العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

ملخص

يلعب الالتهاب دورا مركزيا في التسبب في السكتة الدماغية الإقفارية. تشير الأدلة المتزايدة إلى أنه يعمل كسيف ذو حدين يؤدي إلى تفاقم إصابة الدماغ المبكرة ، ولكنه يساهم أيضا في الإصلاح لاحقا. يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا المناعية عن الدماغ الإقفاري والتنميط الظاهري الخلوي للتدفق اللاحق.

الملخص

السكتة الدماغية تستهل الاستجابة الالتهابية قوية أن يبدأ في حجرة داخل الأوعية الدموية وينطوي على تفعيل السريع للخلايا المقيمين الدماغ. آلية رئيسية من هذه الاستجابة الالتهابية هي هجرة تعميم الخلايا المناعية إلى الدماغ الدماغية سهلت الإفراج chemokine وزيادة التعبير جزيء التصاق الخلايا البطانية. ومن المعروف جيدا كريات الدم البيضاء-غزو الدماغ المساهمة في مرحلة مبكرة الإصابة الدماغية الثانوية، ولكن تم مؤخرا لاحظت أهميتها لإنهاء الالتهاب وإصلاح الدماغ في وقت لاحق فقط.

هنا، يتم توفير بروتوكول بسيط للعزلة كفاءة الخلايا المناعية من مخ الفأر الدماغية. بعد نضح transcardial، يتم تشريح نصفي الدماغ وفصلها ميكانيكيا. ويتبع الهضم الأنزيمي مع Liberase من التدرج الكثافة (مثل Percoll) الطرد المركزي لإزالة المايلين والحطام الخلية. واحد الميزة الرئيسية لهذا ط بروتوكولق طبقة واحدة الإجراء التدرج الكثافة التي لا تتطلب وقتا طويلا إعداد التدرجات ويمكن أن يؤديها بشكل موثوق. النهج غلة عدد الخلايا استنساخه للغاية في نصف الكرة المخ ويسمح لقياس عدة لوحات التدفق الخلوي في تكرار البيولوجي واحدة. التوصيف المظهري وتقدير من الكريات البيض، تغزو المخ بعد السكتة الدماغية التجريبية يمكن أن تسهم في فهم أفضل لأدوار متعددة الأوجه في الإصابة الدماغية والإصلاح.

المقدمة

السكتة الدماغية الدماغية يتسبب في الاستجابة الالتهابية المتواصلة التي تبدأ بسرعة بعد وقف تدفق الدم المحلي ويشمل تقريبا جميع أجزاء من الجهاز المناعي. واحدة سمة هامة من هذه الاستجابة الالتهابية هي تدفق الوقت المناسب من الخلايا المناعية إلى الدماغ الذي يحركه تنشيط الخلايا البطانية الدماغ، إفراز chemokine كبير وزيادة تدفق متعاطفة ^1-3. اعتبر تسلل خلية التهابات سابقا ضارة في السكتة الدماغية، ومع ذلك، فشلت عدة محاكمات العلاج يهدف إلى منع عشوائيا الكريات البيض الخروج إلى الدماغ للحث على فائدة سريرية قابلة للقياس ^(4). وفي الآونة الأخيرة، أصبح واضحا أن الخلايا المشتقة من الوحيدات تشترك في بادئ الأمر في تطور الضرر نقص تروية ⁵ قد تلعب أيضا دورا محوريا لقرار من التهاب الأنسجة واللاحقة إصلاح ^6.

بفضل تحديد المظهرية وfunctiعدم التجانس بين اونال وحيدات الضامة، وسعت بشكل كبير من المعرفة حول دور البالعات وحيدات النوى في التنمية وحل التهاب. في الفئران، وحيدات تعميم يمكن تصنيفها إلى قسمين على الأقل فرعية متميزة وظيفيا وفقا لتعبير سطحها من اللمفاويات مستضد 6 مجمع (لي-6C) ^7. في حين كانت لي-6C monocytes''inflammatory ^عالية يظهر ذلك بوضوح على أنها ضرورية لمكافحة الالتهابات البكتيرية ^8، ودورها في الإصابة العقيمة هو أكثر إثارة للجدل. في السكتة الدماغية، أدى الاجتثاث الانتقائي للحيدات ^عالية CCR2 + لي-6C في النزفية احتشاء التحول ^6. ومع ذلك، تحسنت المنهج التجريبي نفس الإعاقة الحادة بعد نزيف داخل المخ ^9. وبالمثل، يعتقد أن مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا T لممارسة إما ضارة ¹⁰ أو وقائية الإجراءات ¹¹ في إصابات الدماغ الدماغية، ومع ذلك، البيانات controversiآل ^12،13 ومذكرات مزيد من التحقيقات. ونظرا لهذا التعقيد المتزايد، يصبح من الواضح أن تعميق معرفة دور كل من الخلايا المناعية المتنوعة في الإصابة الدماغية وإصلاح أمر حاسم لترجمة النتائج التجريبية في العلاجات التي تستهدف التهاب آخر السكتة الدماغية.

اليوم، أقوى أداة لتحليل الاستجابات المناعية الخلوية متعدد الألوان التدفق الخلوي. وهو يتيح للتحديد وتقدير من مختلف مجموعات فرعية الخلايا المناعية في موقع الالتهاب دون الحاجة إلى انحياز النظام في الجسم الحي العلامات أو التلاعب الجيني ^14. تلطيخ وقت واحد من علامات سطح الخلية مع الأجسام المضادة ضد السيتوكينات داخل الخلايا ¹⁵ أو النسخ عوامل ¹⁶ بالإضافة إلى ذلك يوفر معلومات حول حالة الوظيفية الفردية خلايا، حدد ظاهريا. كما عيب رئيسي واحد، يطلب تعليق خلية واحدة لفحوصات تدفق cytometric، وبالتالي حصول على معلومات حول الموضعيتم فقدان alization من تتسرب الخلوية. ومع ذلك، في حين أن الأنسجة مثالية للحصول على معلومات المكانية، ويقتصر من قبل عدد من الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد لوصف أنواع فرعية الخلايا المناعية في أنسجة معينة. اليوم، هناك حاجة إلى الجمع بين وجود وعدم وجود علامات سطح مختلفة لتحديد بشكل لا لبس فيه نادرة فرعية الخلايا المناعية، وخاصة متميزة السكان خلية الوحيدات المستمدة أثناء التهاب ^17.

هنا، نحن تصف بروتوكول كفاءة لعزل أعداد كبيرة من الكريات البيض من مخ الفأر تال للإقفار باستخدام بسيط طبقة واحدة التدرج الكثافة. تعليق خلية تم الحصول عليها يمكن أن يكون إما عن طريق تحليل تدفق متعدد الأبعاد الخلوي أو مزيد من إثراء فرز تدفق cytometric أو اختيار immunomagnetic لإجراء تحليلات المصب محددة للغاية. تفاصيل طريقة نضح transcardial، وإزالة نصفي الدماغ، تفكك الأنسجة الدماغية في المعل خلية واحدةensions، والكثافة الطرد المركزي التدرج لإزالة النخاعين وكذلك تلوين الأجسام المضادة لتحليل تدفق cytometric.

البروتوكول

ويجب على جميع التجارب على الحيوانات تتفق مع المعايير وفقا لرعاية الحيوانات (على سبيل المثال، دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها المعاهد الوطنية الأميركية للصحة، المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85-23، منقحة 1996)، ويجب أن تتم الموافقة عليها من قبل سلطة الدولة المناسبة.

1. إعداد الكواشف

1. عازلة الهضم (1 مل ​​لكل نصف الكرة الأرضية): حل خليط موحد من الانزيمات الهاضمة تنقيته، على سبيل المثال، Liberase مع تركيز thermolysin منخفضة (TL) إلى تركيز 2U / مل في هانكس المتوازن محلول الملح (HBSS) التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (المغنيسيوم)
2. غسل العازلة مع الدناز: تذوب أنا الدناز إلى تركيز 666U / مل في HBSS (كا / المغنيسيوم الحرة) التي تحتوي على 10٪ من مصل العجل الجنين (FCS)
3. غسل عازلة دون الدناز: HBSS (كا / المغنيسيوم مجانا) تحتوي على 10٪ من FCS
4. كثافة متوسطة الانحدار (5 مل لكل نصف الكرة الأرضية): إعداد الأوراق المالية متساوي التوتر التدرج الكثافة0؛ المتوسطة (SIP؛ 100٪) عن طريق خلط تسعة أجزاء من التدرج الكثافة المتوسطة مع جزء واحد 1.5 M كلوريد الصوديوم. تمييع SIP إلى كثافة 25٪ عن طريق إضافة كمية مناسبة من HBSS (كا / المغنيسيوم الحرة) التي تحتوي على 3٪ من FCS
5. التدفق الخلوي (FC) المخزن المؤقت: إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 3٪ من FCS

2. عابر الأوسط انسداد الشريان الدماغي

ملاحظة: عابر وسط انسداد الشريان الدماغي (MCAO) عن طريق تقنية خياطة داخل اللمعة تم تنفيذ كما هو موضح سابقا ¹⁸ في 12 أسابيع من العمر من الذكور C57BL / 6 الفئران.

1. باختصار، تخدير الفئران مع 2.0٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪. الحفاظ على درجة حرارة الجسم في 36.5 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية عن طريق جهاز التدفئة التحكم في ردود الفعل.
2. بعد ربط الشريان السباتي المشترك والشريان السباتي الخارجي، وإدخال موحدة السليكون المطاط المغلفة حيدة في الشريان السباتي المشترك والتقدم إلى أصل ج الوسطىالشريان erebral.
3. بعد 45 دقيقة إزالة خيوط للسماح ضخه. في الحيوانات الشام التي تديرها، الانسحاب فورا خيوط بعد تسد الشريان الدماغي الأوسط لتجنب نقص التروية.

3. Transcardial الإرواء والدماغ تشريح

1. إعداد مضخة نضح تحوي من تخبط واحدة من نهاية الأنابيب في الجليد الباردة HBSS (كا / المغنيسيوم الحرة). إصلاح حادة 23 G الإبرة إلى الطرف الآخر من أنبوب نضح والتبديل على مضخة لملء تماما أنابيب مع HBSS (كا / المغنيسيوم الحرة).
2. تخدير عميق الفأر مع 4٪ الأيزوفلورين والموت ببطء بواسطة CO ₂ الاستنشاق.
3. وضع ظهريا الماوس على لوحة تشريح جزءا لا يتجزأ من علبة من البلاستيك. الصدارة انتشار والكفوف الخلفيتين على أوسع نطاق ممكن واصلاحها على لوحة تشريح مع 20 الإبر G.
4. الاستيلاء على جلد البطن مع على التوالي 1 × 2 أسنان ملقط واستخدام مقص القزحية الحاد إلى إجراء شق الجانبي من خلال إهاب وجدار البطن وفضحكبد.
5. رفع القص وشق الحجاب الحاجز مع شفرة حادة من مقص حاد قزحية / حادة. مواصلة قطع القفص الصدري الوحشي في كلا الجانبين في اتجاه وcaudocranial. احرص على عدم إصابة الرئة والقلب والشرايين الصدرية.
6. رفع رفرف الجلد مع ملقط كليلة ويعلقون عليه على متن تشريح. استخدام ملقط كليلة نهاية ومقص لفصل بعناية القلب من النسيج الضام.
7. عقد القلب مع ملقط كليلة نهاية وإدراج غيض من كليلة 23 إبرة G مع أنبوب نضح تعلق في قمة البطين الأيسر. ملاحظة: لا تدخل الإبرة بعيدا جدا في البطين الأيسر لتجنب إصابة الحاجز بين البطينين. إذا لزم الأمر، وتحديد قنية في مكان مع ملقط حادة على التوالي.
8. شق الأذين الأيمن مع مقص القزحية الحاد وتتحول فورا على مضخة (معدل التدفق: 8 - 10 مل / دقيقة).
9. تواصل نضح حتى يظهر الكبد لون القهوة الخفيفة (~ 30 مل من HBSS). طوالنضح، وتجنب بعناية أي تشكيل فقاعة الهواء في الأنبوب.
10. قطع رأس الفأر مع المقص مباشرة الجراحية خلف الجمجمة. استخدام مقص القزحية إلى إجراء شق خط الوسط من فروة الرأس لفضح الجمجمة.
11. ضع طرف واحد من مقص القزحية الحاد في الثقبة العظمى وقطع أفقيا في الجمجمة. كرر على الجانب الآخر.
12. استخدام مقص القزحية حادة لقطع بعناية من نفس تجويف يصل خط الوسط نحو الأنف. محاولة للحفاظ على نهاية مقص سطحية قدر الإمكان لتجنب إصابة الدماغ.
13. استخدام ملقط غرامة لقشر بلطف عظام الجمجمة من كل نصف الكرة المخ. ملاحظة: الأنسجة محتشية أن تنضم إلى السحايا أو الجمجمة. تأكد من عدم فقدان أنسجة المخ بسبب تشريح غافل
14. رفع الدماغ مع ملعقة واستخدام مقص القزحية الحاد لتشريح بعناية الألياف العصبية الدماغية التي إصلاحه في الجمجمة. وضع الدماغ في أنبوب 15 مل مليئة 10 مل من HBSS (+ كا / المغنيسيوم) والحفاظ على قhortly على الجليد.

4. تفكك النسيج الدماغي في تعليق خلية واحدة

1. إزالة بعناية جذع المخ والمخيخ بشفرة حلاقة نظيفة. استخدام شفرة حلاقة نظيفة لhemisect الدماغ وقطع كل نصف الكرة الأرضية على طول الطائرة الاكليلية إلى ثلاث قطع متساوية الحجم تقريبا.
2. تشريح اللحم المفروم النسيج من كل نصف الكرة الأرضية من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون باستخدام نهاية المكبس من حقنة 5 مل. باستمرار شطف مصفاة الخلية مع الجليد الباردة HBSS (+ كا / ملغ). تخزين عينات متجانسة على الجليد.
3. أجهزة الطرد المركزي في 286 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق، تجاهل بعناية طاف. resuspend الكرية في 1 مل من العازلة الهضم ونقل تعليق في أنبوب 2 مل. احتضان تعليق تحت دوران مستمر بطيء عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
4. تعليق خلية غربال خلال 70 ميكرومتر مصفاة الخلية وشطف جيدا مع 3 مل من غسل العازلة التي تحتوي على الدناز تليها 15 مل من غسل العازلة خالية الدناز. أجهزة الطرد المركزي في 286 x ج و 18 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف. ملاحظة: ملاحظة: استخدام الدناز يزيل المخاط الحمض النووي الناجم عن تحلل الخلايا التي قد تؤدي إلى تراكم الخلايا المساس بقاء الخلية.

5. التدرج الكثافة الطرد المركزي لإزالة المايلين والحطام خلية

1. بيليه الخلية resuspend في 5 مل من 25٪ متوسطة الكثافة التدرج وماصة للتعليق على أنبوب 15 مل. مزيج دقيق من قبل pipetting المتكررة ولطيف تجنب تشكيل فقاعة. ملاحظة: يجب استخدام التدرج الكثافة المتوسطة في RT لمنع تكتل الخلية.
2. أجهزة الطرد المركزي في 521 x ج و 18 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدام أدنى الشخصي التسارع من الدوار ويسمح الدوار لوقف دون فرامل. إزالة بلطف الأنابيب من أجهزة الطرد المركزي دون أن تهتز. نضح بعناية طبقة المايلين وطاف مع الحفاظ على الخلية بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. ملاحظة: تأكد من إزالة طبقة المايلين بأسره أي بقايا سوف impaiص تحليل تدفق cytometric.
3. Resuspend وبيليه في 10 مل من غسل العازلة خالية الدناز وماصة للتعليق على أنبوب 15 مل الجديد. ملاحظة: هذه الخطوة غسل حاسمة منذ الاطاحة كافية من الكثافة التدرج المتوسطة يساهم إلى حد كبير في كمية ونوعية العينة خلية النهائية.
4. مرة أخرى في 286 x ج و 10 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي تجاهل طاف. و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة غسل الباردة وتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء من خلال استبعاد التريبان الأزرق في عدادة الكريات. تخزين العينات في 4 درجات مئوية، وعملية أخرى منها بسرعة.

6. تلوين الأجسام المضادة لتحليل تدفق Cytometric

1. قبل وضع العلامات الأجسام المضادة، واحتضان تعليق الخلية في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع CD16 مكافحة الفئران / CD32 FC-مستقبلات حجب كاشف (تركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل، وتخفيف عامل 1: 200) لمنع ملزم غير محددة.
2. إضافة الأجسام المضادة الأولية fluorophore مترافق في لتركيز ppropriate (كما هو مبين في الجدول رقم 1) إلى تعليق خلية واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. ملاحظة: لا يتم ملطخة عينات مراقبة مع الأجسام المضادة الأولية، ولكن تعامل إلا نفسه.
3. غسل الخلايا مع 2 مل من العازلة FC وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ج و 10 درجة مئوية لمدة 7 min.Carefully نضح طاف و resuspend بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من العازلة FC. تخزين المواد مؤقتا في 4 درجات مئوية في الظلام حتى تحليل تدفق cytometric.

7. الكمي المطلق من الخرز عد

1. باتجاهين معاكسين ماصة 40 ميكرولتر من العازلة FC و 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب العد تحتوي على العدد المعروف من الخرز الفلورسنت. ملاحظة: انتبه أن الماصات يتم معايرة لتقديم بالضبط 10 ميكرولتر من العينة كما يشير حساب لاحق من التهم الكريات البيض إلى هذا المجلد.
2. احتضان تعليق الخلية مع FITC المسمى CD45 الأجسام المضادة (تركيز النهائيمن 5 ميكروغرام / مل، وتخفيف عامل 1: 100) في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
3. باتجاهين معاكسين ملء أنبوب العد مع 200 ميكرولتر من العازلة FC دون أي خطوة الغسيل وتسجيل مباشرة CD45 + الخلايا في قياس التدفق الخلوي.

8. تدفق Cytometric اكتساب

ملاحظة: لتحليل لوحة الأجسام المضادة المقترحة، لابد من تجهيز الكريات المناسب مع الأزرق (488 نانومتر) والأحمر (635 نانومتر)، والبنفسجي (405 نانومتر) الليزر والمرشحات لFITC، PE، PerCP Cy5.5، PECy7، APC-Cy7 وAmCyan.

1. ضبط الأمام (FSC) وsideward (SSC) مبعثر باستخدام خلايا غير ملوثين من نصف الكرة الدماغية. تميز الحلل من الخلايا وحيدة في مؤامرة نقطة تظهر المنطقة وارتفاع FSC.
2. عرض جميع الخلايا وحيدة في رسوم بيانية-معلمة واحدة لكل قناة مضان المستخدمة وضبط أنبوب مضخم (PMT) الفولتية بحيث يتم عرض الخلايا واحد في أقصى اليسار من الرسم البياني.
3. استخدام CD45-FITC احدعينة الملون للتحقق مبعثر وPMT إعدادات خلايا الفائدة بمقدار backgating CD45 الخلايا المناعية ^عالية في كل الرسم البياني والتشرذم مؤامرة. ملاحظة: تكييف الفولتية PMT من FITC بحيث CD45 السلبي، وسيطة (الباحث) والخلايا معربا عالية يمكن أن تكون متمايزة عن بعضها البعض.
4. استخدام الأجسام المضادة القبض على حبات تعويض لأداء تعويضات متعددة الألوان. تعيين بوابات للالخلايا الدبقية الصغيرة (CD45 ^{كثافة العمليات)} والكريات البيض (CD45 ^{عالية)،} وبعد ذلك تحديد الفئات السكانية الكريات البيض وفقا لاستراتيجية النابضة المعروضة في الشكل 1.

النتائج

وبدأ نقص التروية الدماغية في 12 أسابيع من العمر من الذكور C57BL / 6 الفئران عن طريق انسداد خيوط عابرة من الشريان الدماغي الأوسط الأيسر (MCAO). لعملية صورية تم إدراج خيوط لانسداد الشريان الدماغي الأوسط اليسار وسحب على الفور للسماح ضخه لحظة. الأهم من ذلك، neuroinflammation الخلوية يختلف بشكل كبير بين نماذج السكتة الدماغية تطبق عادة ^19. هذا يجب أن يوضع في الاعتبار خاصة عند استقراء النتائج من الدراسات على الحيوانات إلى الفيزيولوجيا المرضية غير متجانسة من السكتة الدماغية الإنسان.

تم التضحية الفئران 24 ساعة بعد MCAO لتحليل أوائل غزو الخلايا المناعية إلى الدماغ الدماغية. عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من نصف الكرة الدماغية (MCAO IPSI، 0.95 ± 0.25 س 10E6) بعد ان التدرج الكثافة الطرد المركزي مماثلة لتلك التي من نصف الكرة الأرضية المقابل (MCAO كونترا، 1.09 ± 0.30 س 10E6) والمماثلنصف الكرة الأرضية من الفئران الشام التي تديرها (IPSI صورية، 1.12 ± 0.18 س 10E6، في اتجاه واحد أنوفا، ع = 0.524). وكان بقاء الخلايا المعزولة تقاس الأزرق الاستبعاد التريبان عالية ولم تختلف اختلافا كبيرا بين المجموعات (صورية 96.85 ± 0.60٪، MCAO كونترا 97.12 ± 1.18٪، MCAO IPSI 95.68 ± 2.04٪، في اتجاه واحد أنوفا، ع = 0.253 ).

تكوين الدماغ التسلل 24 ساعة بعد أن تقرر MCAO عن طريق تحليل تدفق cytometric الشكل 1 يوضح استراتيجية النابضة تخطيطي (A) وحيوان السكتة الدماغية التمثيلي (B). وقد تم تحديد الكريات البيض-اختراق الدماغ خلايا ^عالية CD45 التي يمكن أن تكون متباينة من الخلايا الدبقية الصغيرة CD45 ^{كثافة العمليات.} داخل ^{السكاني} المرتفع CD45، تم تحديد العدلات النوى (السوداء) من خلال التعبير لي-6G، في حين يرسم اللمفاويات التائية كما CD45 CD3 ^عالية + الخلايا. ثم تم تمييز الخلايا ^عالية CD45 المتبقيةإد بواسطة CD19 (الخلايا الليمفاوية B) والتعبير CD11b. وقد subcategorized جزء CD11b + الى مزيد من لي-6C ^عالية `monocytes` التهابات ولي-6C السكان ^{المنخفض التي} تشمل حيدات، والخلايا الجذعية (DC) والضامة.

في المرحلة الحادة من السكتة الدماغية، والخلايا المناعية الدم النخاعي تهيمن التسلل الدماغ ^3،20. العدلات تدخل الدماغ بسرعة بعد انسداد الأوعية وتعزز تسرب من وحيدات التهابات ^21. يعرض الشكل 2A نسبة الزيادة من Ly6-G + العدلات في نصف الكرة الدماغية 24 ساعة بعد MCAO مقارنة المقابل نصف الكرة الأرضية وصورية جراحة. على النقيض من ذلك، فإن نسبة من الخلايا CD3 + T في نصف الكرة الدماغية هي (نسبيا) أقل مما كانت عليه في الدماغ السليم. بين السكان CD11b +، نقص تروية الدماغ يحول التوازن نحو رجحان قوية من لي-6C حيدات التهابات ^عالية (الشكل2B).

بالإضافة إلى التوزيعات النسبية، تم استخدام أنابيب عد لتحديد الأعداد المطلقة للمجموعات فرعية الخلايا المناعية في العينات على أساس CD45 الأحداث الإيجابية (الشكل 3). أنابيب عد تحتوي على بيليه مجفف بالتجميد التي تصدر العدد المعروف من الخرز الفلورسنت. يمكن تحديد العدد المطلق للخلايا إيجابية في العينة عن طريق ربط الأحداث الخلوية إلى حبة الأحداث. لحساب عدد الكريات البيض ^عالية CD45 في نصف الكرة كانت تستخدم المعادلة التالية: CD45 الخلايا ^عالية في نصف الكرة الأرضية = (CD45 الأحداث ^عالية س الكلي الخرز العد / أحداث عينة حبة) س (الحجم الكلي تعليق (100 ميكرولتر) / حجم العينة (10 ميكرولتر )). 24 ساعة بعد MCAO، وقد زاد العدد الكلى الكريات البيض في نصف الكرة احتشاء بشكل ملحوظ بالمقارنة مع المقابل نصف الكرة الأرضية وصورية جراحة (الشكل 3D، في اتجاه واحد أنوفا، ع = 0.0004). التهم الواردة في دي stinct فرعية الخلايا المناعية (السوداء، خلايا تي، الخلايا البائية، لي-6C ^عالية ولي-6C حيدات ^{منخفضة)} يمكن حسابها بسهولة عن طريق ضرب التردد النسبي مع مجموع CD45 عدد الكريات البيض ^عالية من عينة منها.

الشكل 1. استراتيجية المحاصرة لالتدفق الخلوي. (A) توضيح تخطيطي لاستراتيجية المحاصرة. (ب) ويظهر تحليل تدفق cytometric من الكريات البيض معزولة عن تمثيلية مخ الفأر 24 ساعة بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط. FSC مبعثر إلى الأمام، PMN العدلات النوى، منها الخلايا الجذعية الكلاسيكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg "/>
الشكل 2. تمايز مجموعات فرعية الخلايا المناعية. التوزيع النسبي للي-6G + -neutrophils (A)، وخلايا CD3 + T (A) ومجموعات فرعية الوحيدات التي حددها التعبير التفاضلية من لي-6C (ب) في المماثل (IPSI) والجانب المقابل ( كونترا) نصف الكرة الأرضية 24 ساعة بعد انسداد المتوسطة الدماغية الشريان (MCAO) أو عملية جراحية صورية منها. يشار إلى نسبة مئوية من كل السكان في البوابة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. الكمي من الدماغ الكريات البيضاء التي عد الخرز. (A) يدل على بوابة حبة نقرا مزدوجا إيجابية للغاية. بين السكان خلية واحدة (ب) الخلايا الدبقية الصغيرة CD45 ^{كثافة العمليات} يمكن أن تكون متباينة من كريات الدم البيضاء ^عالية CD45 (C). لالكمي، وكان عدد من الأحداث ^عالية CD45 بوابات طبيعية للأحداث حبة فرزها. لاحظ أن الكريات البيض الإجمالية هي زيادة (CD45 ^عالية) التهم بشكل ملحوظ في (IPSI) نصف الكرة المماثل مقارنة المقابل (كونترا) نصف الكرة الأرضية وصورية جراحة 24 ساعة بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO). ** ف <0.01 ***، ف <0.001 من قبل في اتجاه واحد أنوفا وTukey`s اللاحق متعددة مقارنات اختبار. ن = 4-6 في المجموعة. FSC مبعثر إلى الأمام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تألقي	FITC	PE	PerCP	PC7		V500
			(Cy5.5)
مولد المضاد	CD45.2	CD3	لي-6G	CD19	لي-6C	CD11b
التركيز النهائي [ميكروغرام / مل]	5	1	0.2	0.2	1	1
عامل التخفيف	1/100	1/200	1/1000	1/1000	1/200	1/200
استنساخ	104	145-2C11	1A8	6D5	AL-21	M1 / 70

كوكتيل الجدول 1. الأساسية الأجسام المضادة للالمناعي تحديد الخلايا في الدماغ الدماغية.

المناقشة

هنا، نحن تصف طريقة بسيطة وفعالة لعزل الكريات البيضاء من الدماغ الفئران بعد السكتة الدماغية التجريبية. النهج غلة موثوق عدد الخلايا استنساخه للغاية في نصف الكرة المخ مما يسمح لقياس تدفق وحات مختلفة في تكرار البيولوجي واحدة.

على ما يبدو، وعلى إزالة غير كاملة من الدم بما في ذلك الخلايا المناعية تؤدي إلى النظرة المشوهة على المبلغ الفعلي من الخلايا الالتهابية التي دخلت الدماغ الدماغية. وهكذا، عند استخدام هذا البروتوكول إيلاء اهتمام خاص لنضح transcardial شامل لمنع التلوث من الخلايا المناعية تسلل مع الكريات البيض غير التهابية المتداولة. من الخبرة، واستخدام الإبر حادة لالأيسر ثقب البطين يقلل من خطر إصابة الحاجز بين البطينين التي من شأنها تجاوز نضح من الدورة الدموية. ظهور السائل نضح من فتحتي الأنف هو علامة على أن نضح pressureis مرتفعة للغاية، وبالتالي، لمعدلات تدفق باطلة> 10 مل / دقيقة. شاحب للون الأبيض من أنسجة المخ يشير نضح جيد في حين ردي اللون هو علامة ضعف التروية.

خطوة أخرى حاسمة من هذا البروتوكول هو التفكك الفعال للأنسجة المخ والتي تضم تجزئة الميكانيكية وكذلك الهضم الأنزيمي. تنميق الأنسجة من خلال مصفاة الخلية أمر بالغ الأهمية لتوفير وتحسين فعالية البروتياز. ومع ذلك، عندما المجانسة الأنسجة، وتجنب الضغط المفرط كما البالعات وحيدات النوى هي عرضة للانحلال ذاتي ^22. لعملية الهضم الأنزيمي Liberase TL ينصح التي هي مزيج من نظافة كولاجيناز الأول والثاني يحتوي على تركيزات منخفضة من thermolysin البروتيني محايدة. المقارنة المباشرة مع بروتوكولات العزلة التي سبق وصفها ^14،22،23 كشف الانتعاش أعلى بكثير من خلايا قابلة للحياة عن طريق العلاج Liberase TL (KM بيانات غير منشورة). مقارنة كولاجيناز وهي كثيرا ما تستخدمد لعزل الخلايا المناعية من الدماغ، Liberase TL يحتوي على مستويات ضئيلة من الذيفان الداخلي. ولهذا الأمر أهمية خاصة إذا كان يتم فرز الخلايا لتحليل المصب لمستويات عالية من الذيفان الداخلي قد تغيير حالة تنشيط الخلايا المناعية ²⁴ وبشدة يضعف زراعة الخلايا نتائجها ^25. عيب آخر من كولاجيناز التقليدية غير هامة الاختلافات الكثير إلى الكثير في أنشطة الانزيم الذي يعرض للخطر استنساخ نتائج ويتطلب تحديد تركيز العمل لكل دفعة ^26.

في الدماغ الكبار، وإزالة المايلين بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج خطوة لا غنى عنها لتطبيقات المصب مثل التدفق الخلوي أو إجراء المزيد من الدراسات على الجين أو البروتين التعبير. واحد الميزة الرئيسية لبروتوكول هو الإجراء كثافة طبقة واحدة والتي لا تتطلب وقتا طويلا إعداد التدرجات. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول الفصل تنتج نتيجة موثوقةق حتى عندما يقوم بها المجربون عديم الخبرة إلى حد ما. وهي خالية من التدرجات الطبقات ذات الكثافة قريبة من بعضها البعض التي يصعب ماصة دون إزعاج واجهة بينهما.

واستنادا إلى التعبير عن سطح علامة CD45، بروتوكول غلة ثلاث فئات رئيسية خلية في الدماغ الدماغية. الغالبية العظمى من خلايا تنتمي إلى CD45 السكان السلبية التي تتكون من الخلايا العصبية، دبق نجمي الخلايا، البطانة العصبية والخلايا البطانية. ويعزى السبب في وجود وفرة في التدرج كثافة طبقة واحدة والتي تهدف في المقام الأول إلى المايلين كفاءة وإزالة الأنقاض. بالإضافة إلى ذلك، يبلغ عدد سكانها CD45 ^{كثافة العمليات} تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة ²⁷ يمكن أن تكون متباينة من السكان CD45 ^{العالية التي} يحتوي أساسا التسلل الكريات البيض دموية المنشأ. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة قد تعتمد النمط الظاهري ووظيفة خلايا الدم النخاعي المولد الدم. وهكذا، المحنك فقط تطبيقتقنيات د مثل تعايش التصاقي ^28، ونخاع العظام الوهم ²⁹ أو تحليل الخرائط مصير ³⁰ يسمح للتمييز واضح بين هؤلاء السكان اثنين أثناء الالتهاب.

تحليل البيانات في التدفق الخلوي غالبا ما يقتصر على التوزيع النسبي للسكان خلية معينة. ومع ذلك، عند مقارنة احتشاء نصف الكرة إلى أنسجة المخ غير محتشية هذه المعلومات يمكن أن تكون مضللة لأنها لا تعتبر العدد الكلى الكريات البيض الدماغ التي يتم تغييرها من قبل الإصابة الدماغية. وهكذا، لرسم صورة كاملة عن حجم والنمط الظاهري للتتسرب التهابات بعد ويجب أن يستكمل توزيع السكتة الدماغية النسبي للمجموعات فرعية الخلايا المناعية التي كتبها أعداد الخلايا المطلقة. عند استخدام ميكروبيدات كما هو موضح في هذا البروتوكول، pipetting لمن حجم عينة دقيق إلزامي على الاطلاق للحصول على نتائج موثوقة. وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن pipetting لعكس بقوة لتجنب تشكيل رغوة في أنبوب العد. الناشئة فقاعات الهواءسوف يقلل من الحجم المتوقع من ميكروبيدات، وبالتالي يؤدي إلى المبالغة في تقدير المطلقة CD45 التهم ^ارتفاع الكريات البيض في العينة.

وباختصار، يوفر هذا البروتوكول نهج سهلة وموثوقة لعزل الخلايا المناعية من الدماغ. قد يكون بمثابة أداة قيمة لتشريح تعقيد الاستجابة الالتهابية للسكتة الدماغية. وتشمل التطبيقات المستقبلية التحقيقات حول دور تعتمد على الوقت من مجموعات فرعية الوحيدات في نشر وقرار من التهاب الدماغ الدماغية. وبالمثل، فإن مفهومة دور الجهاز المناعي التكيفي بعد السكتة الدماغية. تحليل تدفق cytometric من القطعان الخلايا التائية التي حددها تعبير عن عوامل النسخ-فرعية معينة أو السيتوكينات في الموقع قد تساعد على توضيح تأثيرها على التعافي على المدى الطويل بعد السكتة الدماغية وآفاقا واعدة وبالتالي مفتوحة لتطوير أساليب علاجية جديدة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مضخة بير ستار برو التمعجية, 4 قنوات	أدوات الدقة العالمية	PERIPRO-4LS
Heracell 240i CO2 حاضنة	Thermo Scientific
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR +	Thermo Scientific
FACS Canto II	Becton Dickinson
Isoflurane	Abbott	4831850
Hank's Buffered Salt solution (HBSS)	Gibco / Life Technologies GmbH	14175-129
HBSS مع الكالسيوم / المغنيسيوم	جيبكو / لايف تكنولوجيز GmbH	24020-091
Liberase TL	Roche Diagnostics GmbH	5401020001
Percoll Plus	GE Healthcare Europe GmbH	17-5445-01
مصل الأبقار الجنينية	PAN Biotech	3302-P101003
Trypan blue	Gibco / Life Technologies GmbH	15250-061
Trucount	BD Biosciences	340334
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	Biochrom AG	L 182-10
DNAse I	Roche Diagnostics GmbH	11284932001
CD11b Horizon V500	BD Biosciences	562128
CD16 / CD32	eBioscience	14-0161
CD45.2 FITC	eBioscience	11-0454
CD3 PE	Biolegend	100307
CD19 PE-Cy7	Biolegend	115519
Ly6C APC-Cy7	BD Biosciences	560596
Ly6G PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	560602
أنابيب سيليكون ، 1 متر	أدوات دقيقة عالمية	503022
مقص القزحية الدقيقة أدوات العلوم		14094-11
مقص جراحي	أدوات العلوم الدقيقة	14130-17
مقص القزحية الدقيقة حاد / حاد	أدوات العلوم	الدقيقة 14028-10
ملقط أسنان مستقيم 1 × 2	العلوم الدقيقة	11021-14
ملقط حاد	أدوات العلوم	الدقيقة 11008-13
مكبس حقنة 5 مل	Carl Roth GmbH (Braun)	EP96.1
مصفاة خلوية ، 100 وميكرو ؛ م	دكتور آي شوبرت ، د.ب	2360-00
حقنة جرعة Omnican Fine 1 مل		TBD
، 70 & micro ؛ m	Greiner Bio-One GmbH	542 070
FACS Tubes BD	Bioscience GmbH	352052
ماصات مصلية ، 10 مل	مصلية Greiner Bio-One GmbH	607180
، 10 مل	Sarstedt AG& ماصات	Co 861,254,025
، ماصات مصلية 25 مل	Greiner Bio-One GmbH	760180
	Greiner Bio-One GmbH	606180
، 25 مل	Sarstedt AG& Co	861،685،020
ماصات مصلية ، 5 مل	Sarstedt AG& Co	861,253,025
نصائح, 0.1 - 10 & micro; ل	علوم B.V.Life كورنينج	4840
نصيحة ، 100 - 1,000 & micro ؛ ل	Greiner Bio-One GmbH	740290
نصائح، 10 - 200 & micro; ل	Greiner Bio-One GmbH	أنابيب تفاعل 739296
1.5 مل	Greiner Bio-One GmbH	616201
Reaction Tubes 2 مل	Greiner Bio-One GmbH	623201
صحن بتري بكتريولوجي ، 94 × 16 ملم	Greiner Bio-One GmbH	633180
Falcon 15 مل	Greiner Bio-One GmbH	188271
Falcon 50 مل	VWR International GmbH (BD)	734-0448
شفرة حلاقة نيوباور لمقياس الدم	Biochrom AG	PDHC-N01
	Carl Roth GmbH	CK07.1