يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

رصد في الوقت الحقيقي من بين الخلايا الصفراء حمض حيوية باستخدام حمض الصفراء الاستشعار القائمة على الحنق ترميز وراثيا

9.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53659

⸱

يناير 4, 2016

 ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا مفصلا لدراسة ديناميكيات الأحماض الصفراوية في الخلايا الحية باستخدام مستشعر BAS FRET مشفر وراثيا. يمثل مستشعر حمض الصفراء هذا أداة فريدة لدراسة (تنظيم) نقل حمض الصفراء وتنشيط FXR في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا.

الملخص

أصبحت

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) أداة قوية لمراقبة طي البروتين والتفاعل والتوطين في الخلايا المفردة. مكنت أجهزة الاستشعار الحيوية التي تعتمد على مبدأ FRET من التصور في الوقت الفعلي لأحداث الإشارات دون الخلوية في الخلايا الحية ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية. هنا ، نصف تطبيق مستشعر الحمض الصفراوي المشفر وراثيا (BAS) الذي يتكون من اثنين من الفلوروفورات المدمجة في مجال ربط ترابط مستقبلات الفارنيزويد X (FXR-LBD) ، وبالتالي تشكيل مستشعر حمض صفراوي يمكن تنشيطه بواسطة عدد كبير من أنواع الأحماض الصفراوية وغيرها من روابط FXR (الاصطناعية). يمكن استهداف هذا المستشعر إلى مقصورات خلوية مختلفة بما في ذلك النواة (NucleoBAS) والعصارة الخلوية (CytoBAS) لقياس تركيزات الأحماض الصفراوية محليا. يسمح بالقياس الكمي السريع والبسيط لتدفق الأحماض الصفراوية الخلوية والتدفق والتوزيع الخلوي للأحماض الصفراوية الداخلية دون الحاجة إلى وضع العلامات بعلامات الفلورسنت أو النوى المشعة. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون مستشعرات BAS FRET مفيدة لمراقبة ربط ترابط FXR. أخيرا ، نوضح أنه يمكن دمج هذا المستشعر الحيوي FRET مع تصوير الفلوروفورات الأخرى المتميزة طيفيا. يسمح ذلك بالتحليل المشترك لديناميكيات الأحماض الصفراوية داخل الخلايا و أ) توطين و / أو وفرة البروتينات ذات الأهمية ، أو ب) الإشارات داخل الخلايا في خلية واحدة.

المقدمة

يستخدم بشكل واسع نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) للحصول على فهم أفضل للمهام الخلوية في الخلايا الحية مع ارتفاع القرار الزمني والمكاني 1. في الحنق، يتم نقل الطاقة من fluorophore المانحة متحمس لfluorophore المتقبلة. كفاءة الحنق تعتمد بشدة على المسافة بين الجهات المانحة وfluorophore متقبل وميولهم وبالتالي فهي قراءات حساسة للتغيرات متعلق بتكوين التي تؤثر على fluorophores اثنين. واستغلال هذه الظاهرة لتوليد أجهزة الاستشعار مقرها الحنق من أجل التصوير من جزيئات صغيرة. يمكن رصد التغيرات في التركيز، حيث الزيادات / النقصان في نسبة كثافة الانبعاثات من متقبل مقابل fluorophore المانحة 2. على سبيل المثال، أجهزة الاستشعار الكالسيوم تستند الحنق، تسمح للكشف سريع ومستقر تركيزات الكالسيوم الحرة في الخلايا الحية 3. المزايا الأخرى لهذه الأجهزة القائمة على الحنق، والتصوير في الخلايا الحية واحدة، روريث غير الغازية، قدرتها على أن تكون موجهة إلى أنواع مختلفة من الخلايا والأجزاء الخلوية (4).

لا تزال غير مفهومة العديد من ديناميات حامض الصفراء الخلايا الجوانب. على سبيل المثال، لا يعرف الكثير عن آلية التنظيم الأساسي للنقل حامض الصفراء مترافق واللامقترن. التقنيات المتاحة لرصد هذا النقل يجعل المقام الأول استخدام والصحفيين على luciferase المراسل، والأحماض الصفراوية رديولبلد، أو الفلورسنت النظير الحامض المراري. يتطلب هذا الأخير تعديل الأحماض الصفراوية، وربما تؤثر على ممتلكاتهم. الصحفيين على luciferase المراسل يكون الفقراء قرار الوقت. الى جانب ذلك، هذه التقنيات تؤدي إلى فقدان العينة وغير قابلة للتطبيق للتصوير في زنازين انفرادية. لذلك، قد يكون من المفيد استخدام الأساليب التي تسمح يعيش التصوير خلية واحدة من نشاط النقل باستخدام أجهزة الاستشعار الحنق، لا سيما وأنه يتضمن ميزة الكشف ratiometric 5، 6. بينما المتغيرات من CFP / شكل YFP الأكثر استخداما أزواج الحنق واستراتيجيات جديدة باستخدام شابك وmCherry تحمل طفرات جمعية الذاتي الذي يحفز أدت إلى التوسع في الأدوات الحنق مع أجهزة استشعار جديدة، بما في ذلك الأحمر تحول الصفراء استشعار حمض 7.

أنشأنا سابقا الحنق الصفراء استشعار حمض المشفرة وراثيا (BAS)، التي تتكون من fluorophore المانحة (أزرق) وfluorophore متقبل (السترين) التي تنصهر فيها مع farnesoid X مستقبلات (FXR) يجند مجال الربط (FXR-LBD) والببتيد تحتوي على عزر LXXLL 8. هذا الببتيد الزميلة مع FXR-الائتلاف الحزبي في الصفراوية التي تعتمد على حمض الطريقة. على تفعيل FXR، فإن المسافة بين السترين وأزرق يغير يرجع ذلك إلى تغيير متعلق بتكوين. في خطوط الخلايا الثديية، FXR النتائج التنشيط في زيادة كشفها بوضوح في السترين / نسبة أزرق، بينما يعمل جهاز استشعار النقي في الاتجاه المعاكس مما يؤدي إلى نسبة الحنق انخفضت على تفعيل FXR. هذا الاستشعار (CytoBAS)يسمح رصد عصاري خلوي ديناميات الحامض المراري. بإضافة-الكربوكسيل محطة الزخارف التي تستهدف التحت خلوية، ويمكن أن تستهدف بناء BAS إلى النواة (NucleoBAS) وperoxisomes (PeroxiBAS)، مما يسمح للقياسات تركيز الأحماض الصفراوية في مقصورات الخلوية المختلفة. على الرغم من أن إضافة استهداف عزر peroxisomal لا يضعف قدرته على الاستجابة للأحماض الصفراوية، فإن الخلية نفاذية FXR-بروابط لا تحفز أي الحنق تغيرات PeroxiBAS داخل peroxisomes 8. لأن طبيعة هذا التناقض غير معروفة، وبروتوكول أدناه يركز على CytoBAS وNucleoBAS.

وقد أظهرت استخدام هذا الاستشعار الحنق المشفرة وراثيا مؤخرا في الخلايا التي تحتوي على النقل الكبد الحامض المراري نا + ببتيد / توروكولات المشارك نقل (NTCP) والعضوية نقل المذاب ألفا / بيتا (OSTαβ) 8. NTCP هو الرئيسي الكبدي المستورد الحامض المراري وOSTαβ هو الصفراوية في الأمعاء basolateralنقل الحمضية التي يمكن أن تعمل على حد سواء باعتبارها المستورد والمصدر يعتمد على حامض الصفراء الكهروكيميائية تركيز التدرج 9، 10. وأظهرت البيانات الأخيرة أن على نقل حامض الصفراء التي NTCP و / أو OSTαβ، ردود قوية وسريعة في نسبة الحنق نتيجة التفاعل يجند FXR-LBD يمكن ملاحظة.

هنا، نحن تصف بروتوكولات مفصلة عن طرق لقياس الحنق مثل تحليل متحد البؤر المجهري ومضان خلية تنشيط الفرز (FACS)، تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة، معالجة المشاكل المحتملة ومناقشة طرق بديلة. استخدام هذا الاستشعار الحنق المشفرة وراثيا، والتفاعل مع حامض الصفراء FXR-LBD يمكن قياس ومراقبة مباشرة في الخلايا الحية، ويوفر طريقة سريعة وبسيطة لتصور النقل الحامض المراري وديناميكية في الوقت الحقيقي. هي البلازميدات التعبير الثدييات ترميز CytoBAS وNucleoBAS المتاحة تجاريا. لذلك، يمكن هذا جهاز الاستشعار البيولوجي كذلك المساهمة فيفهم نقل حامض الصفراء أو المركبات التي تنشط FXR وتوفير أعمق البيولوجيا الحامض المراري والإشارات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. عابر ترنسفكأيشن

وتستخدم CytoBAS وNucleoBAS (يرجى الاطلاع على مواد الجدول) بنجاح في العديد من أنواع الخلايا، (U2OS، Huh7، HepG2، H69، MDCK والخلايا HEK293T): مذكرة. الشرط الرئيسي لاستخدام جهاز استشعار هو أنه يحتاج إلى أن يعبر عنه، مما يتطلب من الحمض النووي الترميز لدخول الخلية.

  1. حصاد الخلايا من متكدسة 80٪ 25 سم 2 قارورة. تمييع الخلايا في كامل مستنبت مناسبة للخط معين الخلية (10٪ FBS، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا لخلايا U2OS وHuh7).
  2. لوحة الخلايا في الكثافة المطلوبة في العقيمة 8 غرف جيدا غطاء زجاجي (0.8 سم 2). تهدف لمتموجة الفرعية (60-80٪ confluency) طبقة من الخلايا في يوم التجربة، على الرغم من أن هذا ليس ضروريا.
  3. إضافة الكامل مستنبت إلى الحجم النهائي من 400 ميكرولتر لكل بئر. تسمح للخلايا لنعلق لمدة 24 ساعة.
  4. تحضير مزيج ترنسفكأيشن في أنبوب معقم بإضافة 0.5 ميكروغرام من NucleoBASأو CytoBAS DNA إلى 100 ميكرولتر من مستنبت (المصل / المضادات الحيوية مجاني). دوامة جيدا. إضافة كاشف ترنسفكأيشن ومزيج من قبل vortexing. الكواشف ترنسفكأيشن التي تعطي الكفاءة المثلى هي نوع من الخلايا التابعة وربما تتطلب اختبار مسبق.
    1. على سبيل المثال، استخدام 2.5 ميكرولتر من polyethylenimine 1 ملغ / مل (PEI) واحتضان DNA / PEI المزيج لمدة 15 دقيقة في RT.
  5. يضاف خليط ترنسفكأيشن في قطرات إلى الخلايا وخلط طريق هز بلطف لوحة جيدا باليد. إضافة 100 ميكرولتر من الخليط لمدة بئر ~ 9.6 سم 2. استخدام 10 ميكرولتر من خليط ترنسفكأيشن لغرف التصوير الفردية للخلايا عابر.
    ملاحظة: بعد 24-48 ساعة، وخلايا تعبر عن استشعار الحامض المراري ويمكن استخدامها لإجراء التجارب.

2. ترنسفكأيشن مستقرة

  1. حصاد الخلايا من متكدسة 80٪ 25 سم 2 قارورة. تمييع بيليه في كامل مستنبت مناسب للخط خلية معينة (10٪ بقري جنيني Serum، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا لخلايا U2OS وHuh7) إلى تركيز من 150000 خلية لكل مل وإضافة حوالي 300،000 الخلايا لكل بئر في لوحة الثقافة 6-جيدا (2 مل حجم النهاية).
  2. تسمح للخلايا لنعلق لمدة 24 ساعة.
  3. تحضير مزيج ترنسفكأيشن في أنبوب معقم بإضافة 0.5 ميكروغرام من CytoBAS أو NucleoBAS DNA (يرجى الاطلاع على مواد الجدول) إلى 100 ​​ميكرولتر من مستنبت (المصل / المضادات الحيوية مجاني). دوامة جيدا. إضافة كاشف ترنسفكأيشن ومزيج من قبل vortexing.
    1. على سبيل المثال، استخدام 2.5 ميكرولتر من polyethylenimine 1 ملغ / مل (PEI) واحتضان DNA / PEI المزيج لمدة 15 دقيقة في RT.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من خليط ترنسفكأيشن في قطرات إلى الخلايا وخلط طريق هز بلطف لوحة جيدا باليد. تشمل دائما السيطرة untransfected عند إنشاء خط الخلية مستقرة.
  5. زراعة خلايا O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  6. يعرض للتريبسين الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ثprewarmed إيث 1.5 مل التربسين لكل 25 سم 2 خلية ثقافة)، وتدور عليهم في 250 x ج في RT لمدة 5 دقائق. إزالة الخلايا وطاف resuspend في 13 مل من مستنبت. تقسيم الخلايا على مختلف 10 سم أطباق ثقافة القطر: 0.5 مل (منخفض الكثافة)، و 1.5 مل (متوسطة الكثافة)، و 4.5 مل (عالية الكثافة). نفعل نفس الشيء بالنسبة المتبقية 6.5 مل.
  7. إضافة مستنبت إلى الحجم النهائي من 10 مل. لU2OS الخلايا، استخدم 800 ميكروغرام / مل G418 لالبلازميدات مع المقاومة كاسيت بالنيوميسين مثل CytoBAS وNucleoBAS يبني لتحديد للخلايا إيجابية. هذه التركيزات هي نوع من الخلايا تعتمد ويمكن تحديدها عن طريق اختيار أدنى المضادات الحيوية (G418) الاعتقال حيث توفيت خلايا untransfected داخل 2-10 أيام (G418 800 ميكروغرام / مل لخلايا U2OS).
  8. تحديث مستنبت مع المضادات الحيوية المناسبة (G418) كل 72 ساعة حتى الخلايا untransfected قد لقوا حتفهم.
  9. دراسة لوحة الثقافة تحت المجهر مع الهدف 20X ل(يمكن رصد مضان باستخدام معظم مجموعات مرشح يستخدم لأخضر، أزرق سماوي أو مضان الأصفر) مستعمرات إيجابية.
  10. بمناسبة المستعمرات الإيجابية التي تكمن في عزلة عن غيرها من المستعمرات بالقلم على الجزء السفلي الخارجي للصحن الثقافة.
  11. غسل لوحة مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ونضح ذلك. يستغرق حوالي 15 اسطوانات الاستنساخ معقمة وتغمس في سيليكون العقيمة. تطبيقها في جميع أنحاء المستعمرات اختيارها عن طريق الضغط بخفة على طبق بتري وتأكد من عدم مستعمرة أكثر من واحد يتم إدراجها في حلقة الاستنساخ.
  12. الماصة 20 ميكرولتر من التربسين قبل تحسنت (1X، 0،25٪) في اسطوانة الاستنساخ واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى معظم الخلايا قد جمعوا (مراقبة بالمجهر).
  13. إضافة 150 ميكرولتر من مستنبت مع المصل والمضادات الحيوية المناسبة (10٪ FBS و 800 ميكروغرام / مل G418 للخلايا U2OS وHuh7) في اسطوانة الاستنساخ والماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الخلايا ونقل إلى 96-جيدا لوحة. تحديث المتوسطة بعد 4-24 ساعة وتسمح للخلايا أن تنمو متكدسة في الايام القليلة القادمة (37 ° C، 5٪ CO 2 لخلايا U2OS وHuh7).
  14. تحديث المتوسطة مع المضادات الحيوية كل 3 أو 4 أيام. عندما الخلايا نمت متموجة، نقلها إلى لوحة جيدا أكبر. كرر هذه الخطوة حتى الثقافة هي كبيرة بما يكفي لإجراء التجارب. Cryopreserve بعض قوارير للنسخ الاحتياطي. الحفظ بالتبريد المتوسطة يتكون من 20٪ FBS و 20٪ DMSO في وسائل الإعلام (DMEM) دون ملاحق.
    ملاحظة: الآن، خط خلية وحيدة النسيلة وتعتبر مستقرة للتعبير عن حامض الصفراء الاستشعار. نصف تركيز G418 المضادات الحيوية (400 ميكروغرام / مل) هو الآن ما يكفي للحفاظ على التعبير في خط الخلية مستقرة.

3. Lentiviral تنبيغ

ملاحظة: تعتبر بعض خطوط الخلايا صعبة ل transfect بالطرق الأكثر تقليدية مثل polyethylenimine (PEI) الأسلوب. تنبيغ الفيروسية من الخلايا هو فعالة بديلة أداة وأو الجينات التسليم ومستقر التعبير التحوير.

  1. حصاد الخلايا من متكدسة 80٪ 25 سم 2 قارورة. تمييع الخلايا في كامل مستنبت مناسبة للخط خلية معينة (10٪ FBS، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا لخلايا U2OS وHuh7) وإضافة حوالي 200،000 الخلايا لكل بئر في لوحة الثقافة 6 جيدا.
  2. إضافة مستنبت إلى الحجم النهائي من 2 مل لكل بئر. تسمح للخلايا لنعلق لمدة 24 ساعة.
  3. أداء transductions الفيروسية من الخلايا احتضان لمدة 4-6 ساعة مع 500 CytoBAS ميكرولتر تحتوي على الفيروسة البطيئة المتوسطة (متوفر عند الطلب) يملأ إلى المبلغ الإجمالي لل1 مل مع كامل مستنبت تحتوي على 10 ميكروغرام / مل diethylaminoethyl (DEAE) -dextran أو lentiviral أخرى تنبيغ محسن. لا تنسى أن تشمل بشكل جيد مع الخلايا السيطرة untransduced.
  4. إزالة المتوسطة وإضافة 2 مل من مستنبت التي تحتوي على المضادات الحيوية المطلوبة (500 ميكروغرام / مل هيغروميسين). استخدام بناء lentiviral لCytoBAS تنبيغ التي تقدمالصورة هيغروميسين مقاومة الخلايا. تنمو الخلايا تحت الظروف المطلوبة.
  5. تحديث المتوسطة مع (500 ميكروغرام / مل هيغروميسين) المضادات الحيوية كل 3 أيام وتقسيم الخلايا عند 80٪ متموجة، حتى كل الخلايا السيطرة السلبية هي ميتة (يستغرق حوالي 1-2 أسابيع لمعظم خطوط الخلية). ويعتبر خط الخلية الآن مستقرة للتعبير عن حامض الصفراء الاستشعار.
    1. بدلا من ذلك، استخدام الخلايا لإجراء التجارب بعد 1-3 أيام تنبيغ الفيروسية. كما يعيش الفيروس قد يكون موجودا، وهذا يتطلب معدات الحنق-قراءات في غرف مع مستوى السلامة المناسبة.
  6. بدلا من ذلك، لعزل السريع للخطوط الخلايا مستقرة، نفذ مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS).
    1. حصاد الخلايا من متكدسة 160 سم 2 قارورة.
    2. تمييع الخلايا في يبوفيتش مستنبت (L-15 متوسطة) مع <5٪ مصل إلى تركيز أقصى 5 × 10 6 خلايا لكل مل
    3. لمجموعة من الخلايا التي تم فرزها، وملء أنابيب FACS مع 1 مل من جمع المتوسطة (L-15 متوسطة + 1.5٪ القلم / بكتيريا، 1٪ L-تخمة و 20٪ مصل).
    4. خلايا الفرز لالسترين (520-580 نانومتر) أو أزرق (450-520 نانومتر)، متحمس مع 405 ليزر.
    5. بعد فرز حوالي 500،000 الخلايا، وتدور باستمرار خلايا (5 دقائق، 250 x ج) و resuspend لهم في 5 مل طبيعي مستنبت كاملة (10٪ FBS، 250 ميكروغرام / مل هيغروميسين للخلايا U2OS وHuh7 CytoBAS) وطبق عليها في ثقافة T25 قارورة. تنمو الخلايا تحت الظروف المطلوبة (37 ° C، 5٪ CO 2 لخلايا U2OS وHuh7).

4. يعيش التصوير خلية من حامض الصفراء الاستشعار

ملاحظة: خلايا تحتوي على الناقلين حامض الصفراء يمكن أن يكون مثقف في المتوسط ​​مع 1-10٪ مصل التي تمت تصفيتها الفحم التي تزيل المركبات محبة للدهون. غالبا ما تحتوي على مصل طبيعي الأحماض الصفراوية التي يمكن أن تؤدي إلى تراكم الخلايا الحامض المراري وتشبع من حامض الصفراء الاستشعار.

  1. قياسات الحنق باستخدام المجهر متحد البؤر
    1. لوحة الخلايا ثابت أو transieمعربا عن ntly أجهزة الاستشعار في الكثافة المطلوبة في العقيمة 8 جيدا ساترة القاع غرفة الشريحة (0.8 سم 2). تنمو الخلايا في كامل مستنبت (باستخدام المصل تصفيتها الفحم) حتى أنه في يوم من التجربة، confluency حوالي 60-70٪.
    2. غسل الخلايا الملتصقة في الشريحة غرفة واحدة مع 200 ميكرولتر 1X PBS أو يبوفيتش L-15 مستنبت.
    3. نضح واستبدالها مع 300 ميكرولتر يبوفيتش L-15 مستنبت بحيث لا تحكم CO 2 ضرورية.
      ملاحظة: DMEM دون أحمر الفينول يمكن استخدامها كذلك، ولكن يتطلب CO 2 الشروط مخزنة. يظهر استشعار حامض الصفراء (بعض) الرقم الهيدروجيني حساسية تهدف ذلك للحفاظ على ثبات درجة الحموضة أثناء جمع البيانات.
    4. تمييع المركبات ليتم استخدامها في تجربة التصوير مبائر أيضا في L-15 مستنبت. تأخذ في الاعتبار أنه خلال التصوير، والتي يمكن ان تضاف كميات كبيرة نسبيا من السائل في الدوائر لضمان خلط السريع للعينة (50-100 ميكرولتر)،لذا تأكد حلول 3-5x.
    5. بدء برامج التصوير من المجهر متحد البؤر مع 37 ° C غرفة الحضانة وتشغيل نانومتر الليزر البنفسجي 405. وضع قطرة من زيت الغمر على الهدف ووضع للغرفة 8 على أعلى من ذلك. للتصوير خلية واحدة من الحنق، استخدم الهدف النفط 63X. وقد استخدمت أجهزة الاستشعار بنجاح في RT، ولكن قد يتبدل سلوك الخلية.
    6. ضبط إعدادات المجهر متحد البؤر صحيح.
      1. تعيين وضع اكتساب: XYT (الوقت الفاصل بين التصوير من طائرة الوصل واحدة).
      2. الحصول على صور في 20 ثانية فترات السماح المركبات التي يمكن ان تضاف بين الاستحواذ دون التوقف التجربة.
      3. ضبط النطاق الطيفي للكشف عن الانبعاثات: أزرق: 450-520 نانومتر. السترين: 520-580 نانومتر.
    7. التركيز على طبقة خلية واحدة باستخدام الضوء تضوء. بدء التصوير وضبط موقف ض أكثر دقة. ضبط الربح وتعويض لكل قناة للتمييز إشارة من الخلفية أثناء البقاءجي أقل بكثير من التشبع لجميع بكسل في خلايا الفائدة.
    8. رسم الدوائر لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI). حدد الخلايا التي تظهر كثافة مضان مماثلة. تجنب الخلايا التي تختلف من الواضح من الخلية متوسط ​​في الحجم والشكل. كشف خلايا للضوء لفترة قصيرة قدر الإمكان لتقليل photobleaching من من أجهزة الاستشعار. فإنه من المستحسن أن رسم رويس يست قريبة جدا من محيط الخلية. وهذه المنطقة هي الأكثر حساسية للتغيرات في كثافة مضان بسبب الانجراف البؤري (خلايا تتحرك في الاتجاه ض) مما يجعلها أكثر صعوبة لرصد التغيرات في نسبة مضان خلال التجربة.
    9. بدء القياسات مع المجهر متحد البؤر. انتظر حتى مضان أزرق والسترين مستقرة.
    10. إضافة 50-100 الأحماض الصفراوية ميكرولتر أو غيرها من المركبات في نقاط زمنية المختار أثناء القياس. على كميات عالية نسبيا من السوائل (خمس إلى ثلث الحجم النهائي) ضرورية لخلط السوائل بشكل جيد (في غضون 10 ثانية) دون أن تهتز / صipetting صعودا وهبوطا. تأكد من عدم لمس حافة الغرفة 8 جيدا مع طرف ماصة وإضافة السائل ببطء حتى أن الخلايا لا يخرج عن نطاق التركيز. لا تقم بإضافة مركبات جديدة قبل الوصول إلى مرحلة الهضبة. وهذا يستغرق حوالي 200 ثانية.
    11. إنهاء كل تجربة مع إضافة 100 ميكرولتر GW4064، وتركيز نهاية 5-10 ميكرومتر (جرعة تشبع الاستشعار) وانتظر حتى الاستشعار مضان مستقرة.
    12. حفظ التجربة وتصدير البيانات كملف افي.
    13. فتح في يماغيج كل الملفات AVI (قناة 00، أزرق، قناة 01، السترين) عن طريق اختيار الإضافات> الأكوام> المكدس interleaver. بدلا من ذلك، استيراد ملف متحد البؤر (على سبيل المثال، .lsm أو ملفات .lif) مباشرة في صورة J باستخدام الإضافات المناسبة (متوفرة في http://www.openmicroscopy.org) والانتقال إلى الخطوة 4.1.14.
      1. لالمكدس 1: استخدام القناة 01 (السترين).
      2. لستاك 2: استخدام القناة 00 (أزرق).
    14. انقر على تحرير> اختيار> إضافةلمدير، لفتح نافذة مدير ROI. اضغط على مربع 'عرض جميع'.
    15. رسم بعض المناطق ذات الاهتمام (رويس) تغطي خلايا معينة مع أداة التحديد البيضاوي. رسم أيضا دائرة واحدة في منطقة خارج الخلايا أو داخل الخلية التي لا يعبر عن جهاز استشعار لتحديد إشارة الخلفية. فإنه من المستحسن أن رسم رويس يست قريبة جدا من محيط الخلية في التجارب عندما كانت التغيرات في كثافة مضان بسبب الانجراف البؤري (خلايا تتحرك في الاتجاه ض) أو الهجرة الخلية واضحة.
    16. حدد خلية واحدة. انقر على الإضافات> التعريف نسبة. وسيؤدي هذا في 3 شاشات: RAW، ونسبة وRatio_Profile. يعرض إطار الخام وزيادة في شدة السترين (الخط الأزرق) وانخفاض في أزرق (خط أحمر) إذا كان هناك الحنق. نافذة نسبة يعطي معلومات عن نسبة السترين / أزرق، والتي سوف تزيد مع زيادة في الحنق. يعطي نافذة Ratio_Profile الأعداد الفعلية للكثافة مضان قياس في كل القنوات. إذا مايكروينمواجهة ملفات الإعداد محددة (على سبيل المثال، .lsm أو .lif بدلا من افي) يتم استخدام ملفات قد تكون عكس ترتيب القناة.
    17. نسخ البيانات من نافذة Ratio_Profile في جدول البيانات المرفقة في البيانات التكميلية. تفعل الشيء نفسه بالنسبة لجميع الخلايا الأخرى (وROI الخلفية).
      ملاحظة: في جدول بيانات على شبكة الإنترنت، جميع البيانات تطبيع للحالة التي من المتوقع تفعيل الحد الأقصى BAS. وبالنظر إلى أن GW4064 هو المنشط أقوى من FXR، يتم تعيين نسبة مضان بعد الحضانة مع وجود فائض من GW4064 إلى 1. ولذا فمن المهم إنهاء كل التجارب مع إضافة GW4064. وميزة هذا هو أن البيانات لم تعد تعتمد على كثافة الليزر أو مكسب للكشف عن والتجارب في أيام مختلفة يمكن مقارنة بسهولة أكبر. وعلاوة على ذلك، في الرسم البياني السفلي من جدول البيانات، بمعدل تشغيل يمكن استخدامها لضمان سلاسة منحنيات للضوضاء التجريبية. ومع ذلك، لا تستخدم هذا الرسم البياني عند تحليل البيانات الحركية، منذ avera تشغيلوسوف تقوم الشركة أيضا سلسة الردود الحركية السريعة.
  2. قياسات الحنق باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)
    1. تمييع جميع المركبات للتجربة FACS في FACS معقمة امتصاص العازلة (0.3 ملي EDTA، 0.5٪ BSA، 0.01٪ نان 3 و 10 ملي D-الجلوكوز).
    2. حصاد الخلايا من 80٪ متموجة T-160 سم 2 خلية ثقافة قارورة استخدام 5 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني. خلايا الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق. غسل 2X بيليه خلية في 5 مل FACS امتصاص العازلة في RT.
    3. عد الخلايا باستخدام عداد كولتر أو غرفة الفرز.
    4. تمييع بيليه في FACS العازلة الامتصاص لتركيز 1 × 10 6 خلية / مل. ماصة صعودا وهبوطا لإنشاء تعليق متجانس من خلايا مفردة. إذا خلايا يصعب تفصيل، ووضع العينات من خلال مصفاة الخلية قبل الفرز للحد من انسداد فوهة.
    5. الماصة 200 ميكرولتر خلايا في أنبوب FACS وحمايتها من الضوء.
    6. إضافة تركيز المطلوب من مركب (على سبيل المثالوالأحماض الصفراوية، بروابط FXR الاصطناعية، مثبطات نقل). دوامة. احتضان لمدة 20-30 دقيقة في RT حين تهز (في الظلام).
    7. وفي الوقت نفسه، بدء FACS (الليزر تحتاج الى وقت في عملية الاحماء).
    8. ضبط التدفق الخلوي المعلمات النابضة للتجربة (انظر الشكل 3):
      1. تحميل حوالي 100،000-200،000 NucleoBAS أو CytoBAS transfected الخلايا لتحديد البوابات.
      2. أولا ضبط FSC وSSC الفولتية لرسم الخلايا في وسط المؤامرة.
      3. باستخدام الليزر البنفسجي، وضبط أزرق (450/40 نانومتر) قيمة الجهد والسترين (525/20 نانومتر) الجهد والتأكد من أن جميع NucleoBAS أو CytoBAS خلايا إيجابية يتم رسم ضمن مؤامرة مبعثر.
      4. تعيين البوابات الصحيحة (بوابة P1 تصل إلى بوابة P4)، انظر الشكل 4.
        1. استخدام بوابة P1 لاستبعاد الخلايا الميتة، وعادة ما يظهر في الزاوية السفلى اليسرى من خلال تحديد عدد السكان الرئيسي في منتصف SSC-A / FSC-A المؤامرة.
        2. استخدام البوابة P2 فيوFSC-H / FSC-A نافذة لإزالة duplets من التحليل. وتعرض الخلايا واحد في خط مائل أكثر من الحلل.
        3. بوابة P3 في السترين (525/20 نانومتر) / أزرق (450/40 نانومتر) نافذة يمكن استخدامها لتحديد لNucleoBAS / CytoBAS خلايا إيجابية، من خلال النابضة السترين والخلايا عالية أزرق، عرض السكان قطريا في الزاوية اليمنى العليا من الحبكة.
        4. رسم بوابة P4 في الجزء العلوي الأيسر من السكان، في أقرب وقت ممكن، وتأكد من أن ما لا يزيد عن 5٪ من الخلايا تقع ضمن هذه البوابة.
      5. تحميل بعض الخلايا untransfected (أي التعبير عن CytoBAS أو NucleoBAS) لتحديد لصناعة السيارات في مضان. قد لا يكون موجودا السكان untransfected في بوابة P3. ضبط بوابة P3 عند الضرورة لاستبعاد الخلايا السيارات الفلورسنت.
    9. دوامة العينات قبل وضع الأنابيب في FACS. لكل عينة، وقياس لا يقل عن 10،000 الخلايا في بوابة P3.
      ملاحظة: التسلسل الهرمي النافذة سكان يعطي عدد من الأحداثيتم عرض كل بوابة و٪ من البوابة الأم. في بوابة 4، و٪ من الوالد تنص الخلايا مع السترين زيادة نسبة / أزرق كنسبة مئوية من جميع NucleoBAS خلايا إيجابية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويستند استشعار الحنق-BAS المقدمة على يجند مجال FXR (LBD-FXR) ملزمة تعلق على اثنين fluorophores السترين وأزرق) وعزر LXXLL. هذا الاستشعار يسمح التحقيقات في نقل حامض الصفراء في الخلايا مع القرار المكانية والزمانية عالية (الشكل 1 A) الحية. طبقت الطفرات في أزرق والسترين لتشجيع تشكيل مجمع ضمجزيئي (الشكل 1 B). الأحماض الصفراوية وبروابط FXR أخرى تترابط FXR...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا نقدم بروتوكول مفصلة لاستخدام رواية المشفرة وراثيا استشعار الحامض المراري قادرة على رصد ديناميات الزمانية المكانية للنقل حامض الصفراء في الخلايا الحية. يتكون هذا جهاز الاستشعار البيولوجي من البروتينات الفلورية أزرق والسترين التي تنصهر فيها إلى FXR-الائتلاف الحزبي، وبالتالي تشكيل جهاز استشعار حامض الصفراء القائم على الحنق (BAS).

وحامض الصفراء الاستشعار بسيط نسبيا ومريحة في الاستخدام عند وجود الخبرة الأساسية مع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المنح الابتدائية من ERC (ERC-2011-StG 280255 و ERC-2013-StG 337479) والمنظمة الهولندية للبحث الصحي والتنمية (Vidi 91713319).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CytoBAS Addgene62860
NucleoBAS Addgene62861
وسائط النسور المعدلة من Dulbecco (DMEM)LonzaBE12-614Fنسبة عالية من الجلوكوز بدون L-glutamine
بنسلين ستربتومايسين (قلم / بكتيريا)Lonza17-602E
L-glutamine (200mM)Lonza17-605E
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Invitrogen102-70
Trypsin-EDTA (10x)LonzaCC-5012
T-25VWR international392-0253المطلية باللون اللامينين
VWR international392-0238مطلية باللون اللامينين
VWR International734-0229طبق بول إل ليسين ومطلي باللون اللامينين
10 سمVWR الدولي392-0243مطلي باللون اللامينين
ثنائي إيثيل أمينوإيثيل (DEAE) - ديكسترانسيجما ألدريتشD9885
بولي إيثيلينيمين (PEI)   ؛Brunschwig23966-2
G418 (geneticin) 50 مجم / ملInvitrogen10131-027
Hygromycin B ، 50 مجم / ملInvitrogen10687-010
اسطوانة استنساخ (6 × 8 مم)Bellco2090-00608
L-15 Leibovitz culture mediumInvitrogen21083-027بدون فينول أحمر
البوليسترين أنبوب دائري القاع (5 مل) أنبوب Facsفالكون BD352008بدون غطاء ،
فالكون غير معقم 2,063 أنبوب (5 مل)فالكون BD352063غطاء سناب ، غطاء
بئر معقم Nunc Lab-Tek 8 زجاجحراري علمي155409المعقمة
المفلترة بالفحم12676011
GW4064Sigma-AldrichG5172
TCDCAسيجما ألدريتشT6260
CDCAسيجما ألدريتشC9377
مواد كيميائية أخرىسيجما ألدريتشن.ف.ت.
قارورة ثقافة الخلايا قارورة ثقافة الخلايا T-175 لوحة 6 آبار تقنيات FBS Life

المراجع

  1. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
  2. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  3. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  4. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  5. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  6. Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
  7. Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
  8. van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
  9. Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
  10. Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
  11. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170(2011).
  12. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  13. Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تصوير نقل الطاقة الرنيني الفلوري (FRET)مستشعر مشفر جينياًارتباط ربيطة FXRالمجهر البؤريتصوير الخلايا الحيةCerulean Citrine FRETالتموضع تحت الخلوينقل حمض الصفراء
رصد في الوقت الحقيقي من بين الخلايا الصفراء حمض حيوية باستخدام حمض الصفراء الاستشعار القائمة على الحنق ترميز وراثيا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.