مقالة منهجية

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

DOI:

10.3791/53676

⸱

نوفمبر 28, 2015

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقدمة هنا هي طريقة واضحة لعزل وتدفق تحليل cytometric من الخلايا وحيدة النواة الدم المحيطي-التسلل الورم يمكن أن ينتج تعتمد على الوقت بيانات كمية عن وضع عدد وتنشيط الخلايا المناعية التي تدخل المبكر المكروية ورم في المخ.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت مختبرنا مؤخرا أن القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا قادرة على القضاء على زرع orthotopically GL26 الماوس والفئران CNS-1 الاورام الدبقية الخبيثة قريبا بعد engraftment داخل الجمجمة إذا أديت الخلايا السرطانية نقص في التعبير عنها من كتين galectin β-غالاكتوزيد ملزم -1 (غال-1). مزيد من العمل مؤخرا يقول إن عدد سكانها GR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي أمر بالغ الأهمية لهذا الغرض. لفهم أفضل للآليات التي NK وخلايا الدم النخاعي التعاون لمنح رفض الورم غال-1-نقص قمنا بتطوير بروتوكول شامل لعزل وتحليل خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية-التسلل الورم (PBMC). ويتجلى الأسلوب هنا بمقارنة PBMC تسلل إلى المكروية الورم من غال-1، معربا عن GL26 الاورام الدبقية مع أولئك الذين أصبحوا غال-1-ناقص عبر shRNA ضربة قاضية. بروتوكول يبدأ مع وصفا لكيفية الثقافة وإعداد GL26 مLLS للتلقيح في مسانج C57BL / 6J مخ الفأر. ثم يوضح الخطوات المتبعة في عزلة وتدفق تحليل cytometric من PBMCs-التسلل الورم من أوائل المكروية ورم في المخ. هذه الطريقة قابلة للتكيف مع عدد من التصاميم التجريبية في الجسم الحي التي تتطلب بيانات الزمنية على تسلل المناعة في الدماغ. طريقة حساسة وقابلة للتكرار للغاية، كما PBMCs-التسلل الورم يمكن عزله عن الأورام داخل الجمجمة في أقرب وقت 24 ساعة بعد ورم engraftment مع عدد خلايا مماثلة لوحظ من وجهة يقابل الأورام وقت خلال تجارب مستقلة. A التجريبي واحد يمكن أن تؤدي الأسلوب من حصاد الدماغ لتحليل تدفق cytometric من PBMCs-التسلل الورم في ما يقرب من 4-6 ساعة اعتمادا على عدد من العينات لتحليلها. كما يمكن استخدام نماذج الورم البديلة و / أو الأجسام المضادة الكشف عن خلية محددة وفقا لتقدير التجريبيون على تقييم تسلل العديد من إمان أخرىأنواع الخلايا (ه) من الفائدة من دون الحاجة لإجراء تعديلات على الإجراء العام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاورام الدبقية هي فئة من سرطانات الدماغ الظهارية العصبية الناجمة عن الدبقية تتحول داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS). جميع الاورام الدبقية، ومنظمة الصحة العالمية (WHO) الصف الرابع الورم، أو ورم أرومي (GBM)، هو الأكثر شيوعا وفتكا 1. GBM هو صهر للغاية لرعاية المعايير من الحالية التي تتكون من الورم استئصال إلى أقصى حد ممكن تليها الأشعة بالإضافة إلى العلاج الكيميائي وما يصاحبه من المواد المساعدة مع temozolomide 2. هذه السرطانات القاتلة تحمل أحوال الطقس الكئيب أشهر فقط 15-18 من البقاء على قيد الحياة من وقت التشخيص الأولي مع 5٪ فقط من المرضى على قيد الحياة المرض بعد 5 سنوات 3.

وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB)، أدت عدم وجود خلايا مقدمة للمستضد المهنية (ناقلات الجنود المدرعة)، ووجود مجهولون في وقت سابق من الهياكل اللمفاوية الحسنة النية داخل الدماغ 4 لمفهوم GBM حظا المناعة كما. ومع ذلك، العديد من الدراسات SHO الآن ث أن هذه السرطانات الدماغ في الواقع يولد تجنيد الخلايا المناعية الطرفية التي هي في الغالب النخاعي في الأصل والتي تشمل حيدات، الضامة، والخلايا القامع المستمدة النخاعي (MDSCs) 5. كما يؤثر GBM نشاط المقيمين في الدماغ الدبقية الصغيرة لتصبح مؤيدة للمكون للأورام 6،7. الخلايا اللمفاوية مثل خلايا CD8 + T 8 و CD56 + الخلايا القاتلة الطبيعية 9 موجودة أيضا داخل المكروية الورم، لكن بأعداد أقل بكثير، وهذه حقيقة يعتقد أن يكون راجعا إلى وظيفة المثبطة للمناعة بتحريض من العوامل المستمدة من الورم في ورم المرتبطة الضامة ( TAMS) 10. خلايا CD4 + T موجودة أيضا في GBM، ولكن الكثير من هذه الفئة من السكان تعرب عن قلقها أيضا CD25 وFoxP3، صناع مناعة T التنظيمي (T ريج) خلايا (11). الدولة المثبطة للمناعة العامة للGBM يتوج في تعزيز الهروب المناعية والأورام تقدم 12.

= "jove_content"> فهم أفضل للآليات GBM المناعة أمر بالغ الأهمية لوضع استراتيجيات فعالة immunotherapeutic تهدف إلى تحفيز الجهاز المناعي ضد الورم. على مدى السنوات ال 15 الماضية عملت مختبرنا للتغلب على آليات الدماغ ورم immunosuppresson من أجل تطوير فعال immunotherapeutics جديدة لمكافحة GBM 13-19. وقد أدى تتويجا لهذا العمل الآن لتجربة سريرية تهدف إلى تقييم السامة للخلايا جنبا إلى جنب والعلاجية المناعة تنشيطية لمرضى شخصت حديثا GBM (ClinicalTrials.gov معرف: NCT01811992).

يظهر عملنا الأحدث التي GL26 الماوس والفئران CNS-1 خلايا GBM كتلة مضادة للورم الخلايا NK المراقبة المناعي عن طريق إنتاج كميات كبيرة من الربط β-غالاكتوزيد-كتين galectin-1 (غال-1) 20. وقد تجلى ذلك من خلال قمع التعبير عن غال-1 في خلايا الورم باستخدام shRNA بوساطة ضربة قاضية الجينات. في المختبر التجربهوأظهرت البحوث أن خلايا الورم غال 1-نقص انتشرت عادة في الثقافة، ولكن خضعت الرفض السريع قريبا بعد engraftment داخل الجمجمة في مسانج C57BL / 6J أو RAG1 - / - الفئران، وبالتالي تأسيس استقلال T- أو B- الخلايا على هذا الشكل من رفض الورم. NK immunodepletion الخلايا مع anti-asialo GM 1 المصل المضاد أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة NK1.1 أدى إلى الاستعادة الكاملة لنمو الورم داخل القحف غال-1-نقص، وإنشاء دور الخلايا القاتلة الطبيعية في غال-1-نقص رفض الورم. وتبين لنا الآن أن immunodepletion من GR-1 + / CD11b + خلايا الدم النخاعي غير كافية لمنع غال-1-نقص رفض الورم على الرغم من وجود خلايا NK، مما يكشف عن دور مساعد لا غنى عنه لخلايا الدم النخاعي في العون من غال NK بوساطة تحلل الورم -1-ناقص (بيانات غير منشورة). وأدت هذه النتيجة غير متوقعة لنا لوضع بروتوكول شامل لعزل وتحليل خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) أنالتسلل المكروية ورم في المخ بعد وقت قصير من engraftment داخل الجمجمة حتى يتسنى لنا أن تميز أفضل الأحداث تسلل المناعية التي المسند غال-1-نقص رفض الورم.

ويتجلى الأسلوب هنا باستخدام خلايا الورم الماوس GL26 أن mCitrine صريحة جوهري البروتين الفلوري، ودعا GL26-سيت، والتي تسمح المباشر التصور الخلايا السرطانية بواسطة المجهر مضان 21. وهذه الخلايا المغروسة stereotactically في الدماغ من مسانج C57BL / 6J الفئران ويسمح لتنمو لمدة 24، 48، أو 72 ساعة قبل الماوس القتل الرحيم. ثم يتم عزل PBMCs-التسلل الورم وimmunolabeled استخدام الألغام المضادة -CD45، -Gr-1، -CD11b و-NK1.1 الأجسام المضادة سطح الخلية مع immunolabeling داخل الخلايا لجرانزيم B (GzmB). هذه تركيبة معينة من الأجسام المضادة يسمح لتحديد-التسلل الورم GR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي وNK1.1 +، وخلايا NK، أنواع الخلايا لدينا بالتابعين المتورطين في رفض الورم غال-1-ناقص. ملف تسلل المناعي للغال-1-نقص GL26-سيت الورم، ويشار إليها هنا ب GL26-سيت-gal1i، ثم يتم مقارنة بما كان عليه من الاورام الدبقية التعبير عن المستويات العادية من غال-1 يسمى GL26-سيت-NT التي تحتوي على عدم تستهدف السيطرة shRNA القاسي. بروتوكول يبدأ مع الوصف على كيفية الثقافة الخلايا GL26-سيت الورم في المختبر، والتي تبعتها شرحا عن كيفية تدبر orthotopically هذه الخلايا في الجسم المخطط من مسانج C57BL / 6J الفئران. ومن ثم تمضي إلى تعداد الخطوات المتبعة في عزلة وimmunolabeling من PBMCs-التسلل الورم لتحليل تدفق cytometric. ويخلص البروتوكول مع شرح لتحليل البيانات القياسية وتمثيل رسومي.

تكشف المظاهرة أن كلا من GR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي وخلايا NK1.1 + NK تتراكم تفضيلي ضمن المكروية ورم في المخ غال-1-نقص في غضون 48ساعة من زرع الورم، ونتيجة لذلك مما يساعد على تفسير سبب هذه الأورام الخضوع بسرعة كامل الورم تحلل حوالي 1 أسبوع engraftment بعد ورم-20. هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة إلى عدد من مختلف في الجسم الحي التصاميم التجريبية التي تتطلب بيانات الزمنية على تسلل المناعة في الدماغ. A التجريبي واحد يمكن أن تؤدي البروتوكول من حصاد الدماغ لتحليل تدفق cytometric من PBMCs-التسلل الورم في حوالي 4-6 ساعة اعتمادا على عدد من العينات لتحليلها. ويمكن أيضا طريقة دمجه مع التجارب التي تهدف إلى تميز الملف الشخصى تعميم PBMCs في الفئران الحاملة للورم للمقارنة مع تلك التي تتسلل إلى الدماغ وذلك لتحديد الظواهر كبت المناعة بفعل تحديدا المكروية الورم. تطبيق هذا وما شابهه من الأساليب ينبغي أن تيسر فهم أفضل للعوامل متورطة في تهريب الخلايا المناعية الطرفية في المكروية ورم في المخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يرجى مراجعة بروتوكول كامل قبل إجراء التجارب. يجب الحصول على موافقة لاستخدام الحيوانات الفقارية من اللجنة المؤسسية المناسبة على استخدام ورعاية الحيوانات قبل المتابعة.

1. إعداد الخلايا السرطانية لداخل الجمجمة Engraftment

  1. العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية، تبدأ من خلال إعداد GL26-سيت-NT / gal1i وسائل الإعلام ثقافة الخلية المكمل زجاجة 500 مل من Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) مع 10٪ العقيمة التي تمت تصفيتها مصل بقري جنيني للحرارة المعطل (FBS )، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 600 ميكروغرام / مل G418 كبريتات (لاختيار mCitrine التعبير ناقلات) و 3 ميكروغرام / مل من هيدروكلوريد بوروميسين (لاختيار من عدم استهداف أو shRNAs غال-1-محددة).
  2. ثقافة GL26-سيت-NT و / أو خلايا GL26-سيت-gal1i (1A الشكل و1B ) في مجموعة مجلس الوزراء زراعة الأنسجة إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 1-2 أيام قبل إجراء الورم engraftment أو حتى قوارير تصل إلى 50-80٪ confluency.
  3. في يوم من الجراحة، وإزالة وسائل الإعلام ثقافة خلية من خلايا الورم باستخدام 10 مل ماصة المصلية وبندقية ماصة وتجاهل وسائل الإعلام في دورق النفايات.
    1. عكس قارورة أعلى جنبا إلى أسفل وإضافة 10 مل من DPBS إلى الجانب العلوي من القارورة باستخدام 10 مل ماصة المصلية. عكس ببطء القارورة لتغطية الخلايا في DPBS، ثم تقلب في قارورة عموديا وإزالة والتخلص من DPBS في دورق النفايات.
  4. إضافة 3-4 مل من غير الثدييات بديل التربسين في DPBS مع EDTA (انظر قائمة المواد للحصول على التفاصيل) لكل T75 زراعة الأنسجة قارورة ووضع مرة أخرى إلى مجلس الوزراء زراعة الأنسجة لمدة 2-5 دقيقة. باستخدام المجهر مشرق الميدان، والتحقق من أن كافة الخلايا قد تصبح بعيدة عن السطح السفلي قبل المتابعة.
  5. تمنع ابعد من ذلكص النشاط الأنزيمي عن طريق تمييع البديل التربسين مع 6 مل من DPBS. ماصة صعودا وهبوطا باستخدام ماصة 10 مل المصلية لشطف السطح السفلي من القارورة وتنأى ميكانيكيا أي المجاميع الخلوية. نضح الخلايا ومكان في المسمى على التوالي 15 مل أنابيب الطرد المركزي. تدور الخلايا في أسفل 550 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية (الشكل 1C).
  6. إزالة طاف و resuspend بلطف الخلايا مع 1 مل من تستكمل الامم المتحدة DMEM. تأكد من ماصة الخلايا صعودا وهبوطا تماما مع micropipette-P 1000 لتحقيق تعليق خلية واحدة.
  7. جعل 01:10 التخفيف من تعليق الخلية الناتجة لدت في 1.6 عن طريق وضع 18 ميكرولتر من DMEM تستكمل الامم المتحدة الى microtube البولي بروبلين 0.6 مل المخروطية تليها إضافة 2 ميكرولتر من تعليق خلية الورم. ماصة صعودا وهبوطا باستخدام micropipette P-10 لتجانس الخلايا بدقة.
  8. إضافة 10 ميكرولتر &# 160؛ للتخفيف خلية 01:10 الورم ولدت في 1.7 إلى 0.6 مل منفصلة البولي بروبلين مخروطي microtube، ثم إضافة 10 ميكرولتر من التريبان وصمة عار الأزرق إلى أنبوب. تخلط جيدا مع micropipette P-10 و إضافة 10 ميكرولتر من الخلايا السرطانية الناتجة / التريبان حل الأزرق تحت زلة غطاء زجاجي وضعت على رأس عدادة الكريات والحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء (الشكل 1D).
    1. عد الخلايا تحت المجهر مشرق الميدان باستخدام الهدف 10X وفقا لبروتوكول معين يرتبط مع عدادة الكريات معين. مما لا شك فيه أن عاملا في التخفيف 20 أضعاف من تعليق خلية الورم الاصلي الذي قدم خلال إعداد الخلايا لتقدير خلية دقيقة في الأصلي قسامة 1 مل. استخدم الصيغة التالية لحساب العدد الكلي للخلايا: مجموع خلية / مل = [((Σcells تحسب لكل متر مربع) / عدد المربعات تحصى) × 20 (أي عامل التخفيف) × 10000 خلية / مل].
  9. بعد دetermining العدد الكلي للخلايا لكل خط الخلية المستخدمة في تجربة معينة، وتدور عليهم في 550 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف (ق) وresuspend الخلايا مع حجم مناسب لتستكمل الامم المتحدة DMEM من أجل تحقيق تركيز الهدف من 3 × 10 4 خلايا لكل 1 ميكرولتر لكل خط الخلية وفقا للمعادلة التالية: (# الكلي للخلايا / 30000).
  10. وضع ما يعادل حجم كل سطر الخلية إلى وصفت على التوالي 0.6 مل أنابيب البولي بروبلين المخروطية ومكان على الجليد (الشكل 1E). تأكد من حفظ بعض الخلايا لمواصلة نشر كل سطر الخلية إذا T75s منفصل لم المصنفة سابقا.

2. إجراء لالمجسم Engraftment من خلايا الورم في الجسم المخطط من C57BL / 6J الفئران

  1. إعداد حلول التخدير الجراحي، تسكين، والتخدير عكس العمل قبل الجراحة على النحو التالي:
    1. لالكيتامين / dexmedetomidine الصورةالتخدير urgical: إزالة 1.4 مل من 10 مل قارورة معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحقن ويحل مع 600 ميكرولتر من 100 ملغ / المحلول مل من الكيتامين هيدروكلوريد و 800 ميكرولتر من 0.5 ملغ / المحلول مل من dexmedetomidine هيدروكلوريد أن تسفر عن الحل العمل المختلط من هيدروكلوريد الكيتامين (6 ملغ / مل)، وهيدروكلوريد dexmedetomidine (0.04 ملغ / مل).
    2. لالبوبرينورفين التسكين: إزالة 1 مل من 10 مل قارورة معقمة من 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحقن واستبدالها مع كامل حجم 1 مل من واحد 0.3 ملغ / مل الأسهم البوبرينورفين هيدروكلوريد أمبولة أن تسفر عن 0.03 ملغ / مل من محلول العمل.
    3. لatipamezole التخدير الجراحي عكس: إزالة 1 مل من 10 مل قارورة معقمة من 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحقن واستبدالها مع 1 مل من 5 ملغ / مل محلول المخزون من هيدروكلوريد atipamezole أن تسفر عن 0.5 ملغ / مل من محلول العمل.
  2. العمل في الموقع المتفق عليه من أجل البقاء الماوس الصورةurgery، تبدأ من خلال وضع الأدوات الجراحية تعقيمها أو حبة معقمة والكواشف الأخرى كما هو موضح في (الشكل 2A)، ثم الحصول على ما يكفي من العمر الأسبوع 8-10 الإناث C57BL / 6J الفئران (مسانج مع GL26 الورم) المطلوبة للدراسة. ضمان حصولهم المستمر في الغذاء والماء.
  3. تخدير الماوس الأولى مع حقن داخل الصفاق واحد (IP) من الحل التخدير العمل من خلال تقديم جرعة من 75 ملغ / كغ من الكيتامين و 0.5 ملغ / كغ dexmedetomidine (حوالي 250 ميكرولتر ل20 ز الماوس). التالي، وإعطاء 5 ملغ / كغ تحت الجلد (SC) حقن كاربروفين (حوالي 100 ميكرولتر ل20 ز الماوس). تأكد من أن الفأر هو غير المراعية حتى القدمين، وذيل القرصات قبل المتابعة.
  4. استخدام كليبرز الجراحية، حلق الفراء من الجمجمة. تطبيق بوفيدون اليود محلول مطهر لمنطقة حلق، فرك مع 70٪ لوحة الآيزوبروبيل الإعدادية الكحول، ثم إعادة تطبيق بوفيدون اليود محلول مطهر. بعد ذلك، تنطبق على كمية صغيرة من ستيريلو الفازلين مرهم لكل عين لمنع جفاف.
  5. تأمين الجمجمة في إطار المجسم وفقا لبروتوكول التالي:
    1. فتح بعناية الفم عن طريق الوصول في مع زوج من ملقط تشريح المنحنية لسحب بلطف خارج اللسان والانتقال إلى جانب واحد من الفم لمنع الاختناق. السماح للملقط ليتراجع بينما في الفم لنشر الفك مفتوحة وتوجيه اثنين من كبار القواطع في ثقب المفتاح من شريط الأسنان على إطار المجسم. تأمين شريط الأسنان من التمحور أفقيا أو رأسيا عن طريق ضبط مسامير منها. ضمان الجمجمة الماوس، تكون على نفس مستوى أعلى مقاعد البدلاء.
    2. وضع قضبان الأذن بشكل آمن ضد العظام postorbital من الجمجمة والحرص على عدم تطبيق الكثير من الضغط الداخلي على الجمجمة من أجل منع الساحق.
    3. وضع شريط الأنف على الخطم والمسمار أسفل حتى دافئ. تحقق من أنه لا يوجد / الحركة الجانبية عمودية في الرأس من خلال تطبيق ضغط لطيفمع الإبهام والسبابة. ويرد الماوس وضعها بشكل صحيح في إطار المجسم في (الشكل 2B).
    4. باستخدام شفرة مشرط، وجعل خط الوسط شق 1 سم على الجمجمة من العظم الجبهي للعظم القذالي. سحب الجلد في شق باستخدام الكامشات كوليبري.
    5. خفض حقنة ميكروليتر مجهزة إبرة 33 G تعلق على ذراع العمودي للإطار المجسم مباشرة فوق موقف bregma (الشكل 2C). من هناك، وضبط الموقف من الإبرة +0.5 مم AP، +2.5 مم ML للوصول إلى الموقع المستهدف للورم زرع. استخدام السلين حقنة 1 مل مجهزة 26 G إبرة بمناسبة هذا الموقع من قبل شديد القسوة بلطف السمحاق.
    6. حفر حفرة في الجمجمة في الموقع المستهدف حتى تصل إلى الأم الجافية الكامنة باستخدام اللاسلكي الحفر السلطة الدقة مجهزة 1/32 "(0.8 ملم) بعض الشيء. أثناء الحفر، والضغط المتقطع تليها إزالة من حديد الاختزال المباشرليرة لبنانية قليلا من سطح الجمجمة لتجنب الحرارة المفرطة والقوة التي يمكن أن تؤدي إلا إلى مثقاب ثقب أنسجة الدماغ الكامنة.
  6. تدفق حقنة ميكروليتر مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم في 1.7 مل المخروطية البولي بروبلين microtube للتأكد من أن الإبرة ليست مسدودة. نفض الغبار بلطف microtube البولي بروبلين 0.6 مل مخروطي يحتوي على الخلايا السرطانية عدة مرات لresuspend الخلايا.
  7. وضع 2 ميكرولتر من الخلايا في حقنة ميكروليتر ضمان أن يتم إدخال أي فقاعات هواء داخل المحقنة. الاستغناء 1 ميكرولتر من الخلايا على 70٪ ايزوبروبيل وحة الإعدادية ترك بالضبط 1 ميكرولتر من الخلايا السرطانية المتبقية في حقنة.
  8. جلب الإبرة أسفل حتى يلامس جافية، ثم إدخال الإبرة في الدماغ -3.5 ملم من الناحية البطنية ويتقلص بما +0.5 مم. ببطء وسلاسة تقديم الخلايا بالضغط على المكبس حقنة على مدى 1-2 دقيقة.
  9. السماح للخلايا لsettlه في موقع الحقن لمدة 5 دقائق قبل تنسحب ببطء الإبرة. مسح أي دم متخثر أو مسألة الدماغ من رأس الإبرة مع نظيفة 70٪ ايزوبروبيل وحة الإعدادية. شطف الإبر والمحاقن تماما مع كلوريد الصوديوم 0.9٪ من 2.6 خطوة لضمان أن الإبرة لا المسدودة لحقن المقبل.
  10. إزالة الكامشات كوليبري وخياطة فروة الرأس باستخدام ثلاثة 3-0 خيوط النايلون حيدة. إزالة الماوس من إطار المجسم وإدارة 0.1 ملغم / كغم من البوبرينورفين هيدروكلوريد تحت الجلد (SC) (حوالي 67 ميكرولتر من 0.03 ملغ / مل من محلول العمل ل20 ز الماوس) تليها 2.5 ملغ / كغ atipamezole هيدروكلوريد العضل (ايم) (حوالي 100 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل حل العاملة ل20 ز الماوس) لتخفيف آلام ما بعد الجراحة والتخدير العكس. وضع الفئران بعد الجراحة مرة أخرى إلى أقفاصها تحت مصباح التدفئة للتعافي.

3. ماوس Transcardial Perfusايون وحصاد الدماغ

  1. إعداد الحل تايرود heparinized وفقا لبروتوكول التالي:
    1. وضع شريط التحريك المغناطيسي إلى 1 L الزجاج المسمار غطاء زجاجة تخزين وتعبئة للحجم مع عالى النقاء الماء منزوع الأيونات. وضع زجاجة على طبق من اثارة.
    2. وزن وإضافة المواد الكيميائية التالية إلى زجاجة مع التحريك: 8 ز كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)، 0.264 غرام كلوريد الكالسيوم (CaCl 2 • 2H 2 O)، 0.05 غ فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (ناه 2 PO 4 • 2H 2 O)، 1.0 ز D-الجلوكوز (C 6 H 12 O 6)، 1.0 ز بيكربونات الصوديوم (NaHCO 3)، 0.2 غرام كلوريد البوتاسيوم (بوكل). السماح للأملاح حل، ثم يضاف 100 ميكرولتر من 1،000U / مل محلول المخزون من الهيبارين الصوديوم إلى الحل تايرود.
    3. إزالة الحاوية من لوحة اثارة واستخراج شريط التحريك باستخدام عصا المغناطيسي. تخزين heparinized حل تايرود في 4° C.
  2. إعداد محلول العمل للتخدير النهائية على النحو التالي:
    1. لالكيتامين / زيلازين محطة التخدير: إزالة 1360 ميكرولتر من 10 مل قارورة معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحقن واستبدال 1200 ميكرولتر من 100 ملغ / المحلول مل من الكيتامين هيدروكلوريد و 160 ميكرولتر من 100 ملغ / المحلول مل من زيلازين هيدروكلوريد لتسفر عن حل العمل المختلط من هيدروكلوريد الكيتامين (12 ملغ / مل)، وهيدروكلوريد زيلازين (1.6 ملغ / مل).
  3. إعداد الكثافة حل مزيج سائل الإعلام الطرد المركزي من خلال وضع 90 مل من 10X PBS إلى 264 مل من الماء عالى النقاء منزوع الأيونات (3.93x) في حاوية بلاستيكية معقمة. يعاير إلى الرقم الهيدروجيني 7،0-7،2 مع حمض الهيدروكلوريك وتصفية تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرون. تخزينها في 4 ° C.
  4. إعداد 70٪ سائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي من خلال الجمع بين 18 مل من كثافة وسائل الإعلام الطرد المركزي حل المزيج مع 30 مل من وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي (انظر قائمة الموادلمزيد من التفاصيل) في 50 مل أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي. تخزين عند 4 درجات مئوية، ولكنها تعود إلى RT قبل الاستخدام.
  5. إعداد 37٪ سائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي من خلال الجمع بين 9.6 مل من DPBS مع 10.4 مل 70٪ سائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. تخزين عند 4 درجات مئوية، ولكنها تعود إلى RT قبل الاستخدام.
  6. إعداد تدفق العازلة من خلال وضع 500 ميكرولتر من FBS إلى 50 مل من DPBS (~ 1٪ FBS) في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. تخزين في مخزن في 4 درجات مئوية
  7. ملء 4.5 L دلو الجليد البولي يوريثين للقدرة مع رقائق الثلج.
  8. جعل حل جنبا إلى جنب من 1 ملغ / مل كولاجيناز و 1 ملغ / مل الدناز-I بكميات كافية ل1 مل لكل عينة الدماغ في الدراسة عن طريق تمييع 10 ملغ / مل الدناز-I حل سهم 1:10 و 50 ملغ / مل حل الأسهم كولاجيناز 01:50 مع DPBS العقيمة في واحد 15 مل أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي. المزيج بلطف الحل بواسطة pipetting صعودا وهبوطا مع micropipette-P 1000. تخزين على الجليد في polyurethدلو انو من الخطوة 3.7.
  9. الحصول على اثنين من الزجاج 7 مل المطاحن الأنسجة Dounce. تسمية واحدة "NT" والآخر "gal1i". وضع المطاحن الأنسجة في دلو الجليد وإضافة 1 مل من DPBS لكل منهما.
  10. الحصول على ما يكفي من أنابيب الطرد المركزي 15 مل لجمع مادة الدماغ من كل فأر في الدراسة ومكان في دلو الجليد.
  11. مكان ~ 150 مل من DPBS بين ثلاثة 50 مل أنابيب الطرد المركزي في دلو الجليد.
  12. الحصول على ما يكفي من أطباق البوليسترين سداسية وزنها (أعلى قطرها الداخلي (ID) 115 ملم، ID قاعدة 85 مم، 203 مل الحجم) لكل فأر في الدراسة. يظهر الإعداد الكامل للتشريح وسحن من أدمغة فئران في (الشكل 3A)
  13. في نقطة زمنية المختار، تخدير أول ماوس الورم الحاملة في الدراسة باستخدام حقن الملكية الفكرية واحد من 150 ملغم / كغم من الكيتامين هيدروكلوريد و 20 ملغم / كغم من هيدروكلوريد زيلازين (حوالي 250 ميكرولتر من الجمع بين 12 ملغ / الكيتامين مل / 1.6 مز / مل من محلول العمل ل20 ز الماوس زيلازين) للحث على التخدير العميق. تأكد من أن الفأر هو عدم استجابة إلى أخمص القدمين والذيل القرصات قبل المتابعة.
  14. استرداد حل تايرود معدة مسبقا ومكان في غطاء تدفق الصفحي مخصصة لعمليات جراحية الحيوان المحطة. وضع أنابيب الغاز البوليمر بردة تعلق على خزان كربوجين إلى الحل تايرود. فتح صمام خزان للسماح 95٪ O 2/5٪ CO 2 كربوجين بشكل مستمر فقاعة في الحل.
  15. إرفاق G 20 مركزا الألومنيوم إبرة حادة في نهاية كمية إضافية من الغاز كتيمة أنابيب البوليمر تعلق على مضخة تحوي. وضع الأنبوب في الطرف الآخر من مضخة تحوي في الحل تايرود وتحويل مضخة على السماح للأنابيب لملء مع الحل الاوكسيجين وheparinized تايرود. وأنشئت من أجل الماوس transcardial نضح هو مبين في (الشكل 3B).
  16. باستخدام أربعة الإبر 26 G، ماهيتهاالجانب البطني الماوس تخدير من قبل الجبهة والكفوف الخلفيتين على مقذوف كتلة رغوة البوليسترين مغطاة بمنشفة ماصة التخلص في غطاء تدفق الصفحي.
  17. فهم الجلد فوق التجويف البريتوني باستخدام زوج من ملقط تشريح حادة، وباستخدام زوج كبير من مقص تشريح جعل "Y" شق طريق اختراق الجدار البريتوني، وقطع cephalically لثقب الحجاب الحاجز، ثم bifurcating في القص لتنتهي في الإبطين الأيمن والأيسر.
  18. استخدام مرقئ لكبح القص وتعكس القفص الصدري على الماوس، الكتف الأيسر. إزالة التامور مع زوج من ملقط تشريح حادة.
  19. بدوره على مضخة تحوي لبدء بالتنقيط مستمر من حل الاوكسيجين وheparinized تايرود (حوالي 2،3-2،5 مل / دقيقة).
  20. إدراج إبرة حادة إلى البطين الأيسر من القلب. استخدام زوج من مقص صغير تشريح قص الأذين الأيمن للسماح لاستنزاف (الشكل3C).
  21. السماح الحل تايرود ليروي بدقة نظام الماوس الدورة الدموية حتى الكبد والرئتين والمقشر تماما نظرا لعدم وجود الدم. ضمان عدم وجود مبالغ إجمالية الدم تستمر للخروج من الأذين الأيمن قبل إزالة 20 G محور الألومنيوم إبرة حادة من البطين الأيسر.
  22. بفصل الماوس من مقذوف كتلة رغوة البوليسترين وتحويل الجانب البطني الماوس لأسفل. باستخدام زوج كبير من مقص تشريح، فصل الرأس عن بقية الجسم على مستوى الرقبة.
  23. باستخدام زوج من مقص صغير تشريح، وقطع في فروة الرأس في خط الوسط ابتداء من عظم القذالي العمل قدما نحو خطم من أجل فضح الجمجمة.
  24. سحب الجلد على جانبي الجمجمة باستخدام الإبهام والسبابة وعقد الجمجمة بشكل آمن. استخدام زوج من رينجرز العظام لاختراق الجمجمة ابتداء من عظم القذالي والعمل قدما لفضح تماما الظهرية والجانبيةأسطح الدماغ. كن حذرا للحد من تلف في خلايا المخ.
  25. بمجرد إزالة عظام الجمجمة، وتحويل رئيس الماوس الجانب بطني حتى واستخدام زوج من مقص صغير تشريح لقطع الأعصاب القحفية في قاعدة الدماغ من أجل تحريره من الجمجمة.

4. عزل PBMCs-التسلل الورم

  1. استخدام نظيفة واحدة شفرة حلاقة ذو حدين، عزل منطقة من الدماغ الذي يحتوي على الورم عن طريق إجراء خفض السهمي أسفل وسط الدماغ لشطر نصفي الكرة الأرضية. تحويل المماثل الجانب الإنسي نصف الكرة إلى أسفل وجعل اثنين من التخفيضات الاكليلية على مستوى المخيخ والبصلة الشمية لعزل الأنسجة المستهدفة التي تحتوي على زرع الورم (الشكل 4A). وجزء يعادل نصف الكرة الأرضية المقابل يمكن أيضا أن تكون معزولة واستخدامها كوسيلة لمراقبة سلبية.
  2. وضع النسيج المستهدف في المسمى على التوالي الزجاج Dounce طاحونة الأنسجة التي تحتوي على 1 مل؛ من DPBS، دفع المكبس على طول الطريق وتطور 7 مرات لتعطيل البداية الأنسجة. رفع المكبس للسماح للسائل ليستقر العودة إلى الجزء السفلي من طاحونة الأنسجة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. ومع تطور فقط المكبس 4 مرات خلال تكرار المقبلين و3 مرات خلال تكرار الماضي لتجنب الإفراط الطحن الأنسجة.
  3. باستخدام micropipette-P 1000، وتطبيق بالتسلسل ثلاثة 1 مل حجم DPBS المثلج (المعد في 3.11) على طول جانبي المكبس لشطف في طاحونة الأنسجة.
  4. Resuspend والمسألة الدماغ triturated من قبل pipetting صعودا وهبوطا والمكان الى صفت أنبوب الطرد المركزي 15 مل على الجليد. شطف الجانبين من طاحونة الأنسجة Dounce مع 1 مل إضافية من DPBS المثلج وإضافة إلى نفس 15 مل أنبوب الطرد المركزي. منع جميع أنابيب تحتوي على مادة الدماغ triturated على الجليد حتى يتم معالجة كافة العينات.
  5. كرر الخطوات 3،13-3،25 و4،1-4،4 لكل الماوس في الدراسة.
  6. مرة واحدة كل العينات هكتارلقد تم تجهيزها، وتدور أسفل مسألة الدماغ triturated في 15 مل أنابيب الطرد المركزي في 740 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  7. إزالة طاف مع ماصة وماصة 10 مل المصلية بندقية و resuspend المسألة الدماغ مكعبات في 1 مل من معدة مسبقا كولاجيناز / الدناز-I الانزيمات الهاضمة باستخدام P-1000. وضع 15 مل أنابيب الطرد المركزي في أنبوب اختبار رف والمكان في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة.
  8. بلطف تستنهض الهمم العينات مرتين خلال فترة الحضانة التي كتبها عبها أنابيب لتسهيل تصنيف الأنسجة.
  9. إضافة 6 مل من DPBS الجليد الباردة باستخدام 10 مل ماصة المصلية لكل أنبوب لتخفيف الانزيمات الهاضمة. ماصة صعودا وهبوطا ل resuspend، وتصفية مجموع أحجام من خلال معقمة 70 ميكرومتر شبكة النايلون المرشحات إلى المسمى أنابيب الطرد المركزي 15 مل جديدة على الجليد.
  10. تدور تعليق خلية في المخ إلى أسفل في 740 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى تحقيقبيليه خلية واحدة (الشكل 4B). بعد إزالة 15 مل أنابيب من أجهزة الطرد المركزي وضعها على الجليد وزيادة درجة الحرارة الإعداد على أجهزة الطرد المركزي إلى نحو 21 درجة مئوية في التحضير للخطوة المقبلة.
  11. إزالة تماما طاف من كل أنبوب يحتوي على خلايا الدماغ والبداية resuspend وبيليه في 1 مل من 70٪ سائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي باستخدام micropipette-P 1000. ثم يضاف 4 مل إضافية من 70٪ سائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي إلى كل أنبوب باستخدام 10 مل ماصة المصلية. المسمار قبعات على آمن والتجانس تعليق الخلية التي كتبها قلب برفق لأنابيب عدة مرات.
  12. إزالة 15 مل أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على خلايا المخ معلق في 70٪ سائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي من الجليد، ومكان في أنبوب اختبار رف في RT. في وقت واحد، تراكب بعناية 2 مل من 37٪ محلول سائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي على 5 مل من 70٪ سائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي مع micropipette-P 1000 لتشكيل تيار مترددواجهة الهزيل بين طبقتين وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي (الشكل 4C).
    1. استخدام علامة ذات الرؤوس غرامة لبيان المركز واجهة بحيث يمكن التعرف عليها بسهولة بعد الطرد المركزي، وعندما يصبح التمييز أقل وضوحا.
  13. تدور باستمرار في 15 مل أنابيب الطرد المركزي في 740 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) لمدة 20 دقيقة في RT مع أي انقطاع لتجنب تعطيل واجهة.
  14. بعد الطرد المركزي، وجمع PBMCs التي تراكمت في واجهة بين طبقتين وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي (الشكل 4D) عن طريق إدخال micropipette P-200 في أنبوب على طول جانبها، تجاوز بعناية طبقة الدهون.
    1. مرة واحدة على مستوى الفرقة PBMC، استخراج ببطء 200 ميكرولتر من سطح طبقة وسائل الإعلام 70٪ الكثافة الطرد المركزي والمكان الى وصفت على التوالي أنبوب البولي بروبلين FACS على الجليد. أكرر مرة واحدة لإجمالي حجم 400 ميكرولتر لكل عينة.
  15. إضافة 3 مل من تدفق العازلة لكل أنبوب FACS تحتوي على 400 ميكرولتر من PBMCs لتمييع بما فيه الكفاية وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي، ثم تدور الخلايا في أسفل 660 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.

5. Immunolabeling من PBMCs-التسلل الورم

  1. قبل تحليل أي عينات PBMC التجريبية، إجراء، مستقلة، سطح الخلية التجربة isotype السيطرة واحدة لإنشاء بوابات أساسية لتترافق مع مجموعة من الفولتية PMT الثابتة ضمن قالب تحليل البيانات تدفق cytometric مخصصة لتقييم PBMCs-التسلل الورم وفقا إلى بروتوكول التالية:
    1. تدبر C57BL واحد / 6J الفأر مع GL26-سيت-gal1i وآخر مع GL26-سيت-NT وفقا للإجراءات المبينة في القسم 2. بعد 72 ساعة من نمو الورم، والموت ببطء كل ​​من الفئران وعزل PBMCs-التسلل الورم وفقا للإجراءات المبين في جميع أنحاء المادتين 3 و 4.
    2. الجمع بين اثنين من العينات PBMC (NT لالثاني gal1i) في مجلد واحد (أي 100 ميكرولتر)، ثم كذلك تقسيم العينة بالتساوي بين ثلاثة أنابيب FACS (أي 33.3 ميكرولتر في أنبوب) المسمى "نمط إسوي CD45"، "GR-1 / CD11b نمط إسوي"، و "NK1. 1 نمط إسوي ". إضافة الأجسام المضادة التالية (كل في التخفيف 1: 100 والمخفف إلى وحدة تخزين ما مجموعه 200 ميكرولتر في تدفق العازلة) إلى المسمى التوالي أنابيب FACS: "CD45 نمط إسوي": فلور اليكسا الفئران 700 مترافق IgG2b، κ (استنساخ: RTK4530 )؛ "GR-1 / CD11b نمط إسوي": فلور اليكسا الفئران 700 مترافق مكافحة فأر CD45 (استنساخ: 30-F11)، الفئران-PE مترافق IgG2b، κ (استنساخ: eB149 / 10H5)، وPerCP / Cy5.5 IgG2b الفئران -conjugated، κ (استنساخ: RTK4530)؛ "نمط إسوي NK1.1": فلور اليكسا الفئران 700 مترافق مكافحة فأر CD45 (استنساخ: 30-F11)، PE-مترافق الفئران لمكافحة فأر GR-1 (استنساخ: RB6-8C5)، PerCP / الفئران Cy5.5 مترافق مكافحة فأر CD11b (استنساخ: M1 / ​​70)، وAPC-حرف عطفugated الماوس IgG2a، κ (استنساخ: eBM2a).
    3. السماح PBMCs لimmunolabel على الجليد في الظلام لمدة 20 دقيقة. نفض الغبار أنابيب مرة واحدة في منتصف الطريق من خلال فترة الحضانة إلى المزيج بلطف. تغسل مع 1 مل من تدفق العازلة، وتدور باستمرار في 660 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وresuspend كل أنبوب FACS تحتوي على PBMCs مع 200 ميكرولتر من تدفق العازلة.
    4. باستخدام تدفق عداد الكريات مجهزة 85 ميكرون فوهة متكاملة، وتحليل "CD45 نمط إسوي" أنبوب لأول مرة لإنشاء خط الأساس CD45 البوابة الفاصلة. بعد ذلك، قم بتشغيل "GR-1 / CD11b نمط إسوي" أنبوب لإنشاء خط الأساس GR-1 / CD11b بوابة رباعي فقط باستخدام الحقيقية CD45 + الخلايا كإدخال. وأخيرا، قم بتشغيل "NK1.1 نمط إسوي" أنبوب لإنشاء خط الأساس NK1.1 البوابة الفاصلة فقط باستخدام CD45 صحيح + / GR-1 انخفاض خلايا / CD11b +/- كإدخال.
  2. استخدم الإجراء التالي لجميع تجريبي في المستقبلalysis:
    1. جعل كمية كافية من 1: 100 التخفيف من الأجسام المضادة سطح الخلية في تدفق العازلة لتحقيق حجم 200 ميكرولتر لكل عينة (زائد 1 لنمط إسوي GzmB): اليكسا فلور الفئران 700 مترافق مكافحة فأر CD45 (استنساخ: 30-F11 )، الفئران-PE مترافق مكافحة الفأر GR-1 (استنساخ: RB6-8C5)، الفئران PerCP / Cy5.5 مترافق مكافحة فأر CD11b (استنساخ: M1 / ​​70)، والماوس APC مترافق مكافحة الفأر NK1.1 (استنساخ: PK136).
    2. إزالة بعناية طاف من PBMCs نسج نزولا من 4.15 حتى الغضروف المفصلي هو فقط فوق الجزء السفلي من كل أنبوب FACS (~ 50 ميكرولتر) لتجنب الخسائر الخلية. Resuspend وPBMCs في كل أنبوب FACS باستخدام تدفق العازلة المتبقية مع micropipette P-200 وإزالة (1 / عدد العينات) قيمة حجم من كل أنبوب FACS والجمع في أنبوب FACS الجديد المسمى "نمط إسوي المجمعة".
    3. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة كوكتيل سطح الخلية أعدت 5.2.1 لكل عينة PBMC. السماح PBMCs لimmunolabel على الجليد في الظلام لمدة 20 دقيقة. نفض الغبار رانه أنابيب مرة واحدة في منتصف الطريق من خلال فترة الحضانة لخلط بلطف.
    4. تغسل مع 1 مل من تدفق العازلة. تدور باستمرار في 660 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) × 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    5. و resuspend جميع أنابيب FACS تحتوي على PBMCs في 200 ميكرولتر من تثبيتي القائم على الفورمالين المتاحة تجاريا (انظر قائمة المواد للحصول على التفاصيل) لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام. نفض الغبار أنابيب مرة واحدة في منتصف الطريق من خلال فترة الحضانة إلى المزيج بلطف.
    6. تغسل مع 1 مل من المتاحة تجاريا العازلة 1X permeabilization / غسل (انظر قائمة المواد للحصول على التفاصيل) وتدور باستمرار في 660 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    7. في حين PBMCs هي الغزل أسفل، وإعداد كمية كافية من 1: 100 التخفيف من الماوس باسيفيك بلو-مترافق مكافحة الفأر GzmB (استنساخ: GB11) الأجسام المضادة الخلايا في 1X العازلة permeabilization / غسل لتحقيق حجم 200 ميكرولتر لكل عينة.
    8. في أنبوب منفصل، وإعداد حجم 200 ميكرولتر واحد من 1: 100 التخفيف من باسيفيك بلو الاشتراكاتjugated الماوس IgG1، κ (استنساخ: MOPC-21) isotype السيطرة الأضداد.
    9. resuspend كل من العينات PBMC التجريبية مع 200 ميكرولتر من 1: 100 التخفيف من الأجسام المضادة الفأر GzmB و resuspend أنبوب FACS واحد المسمى "نمط إسوي المجمعة" مع حجم 200 ميكرولتر من 1: 100 التخفيف من الأجسام المضادة نمط إسوي.
    10. السماح لجميع العينات PBMC إلى immunolabel على الجليد في الظلام لمدة 20 دقيقة. نفض الغبار أنابيب مرة واحدة في منتصف الطريق من خلال فترة الحضانة إلى المزيج بلطف.
    11. تغسل مع 1 مل من تدفق العازلة. تدور باستمرار في 660 x ج (ماكس إطار التعاون الإقليمي) لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend PBMCs مع 200 ميكرولتر من تدفق العازلة للتحليل.
    12. تدفق cytometrically تحليل PBMCs-التسلل الورم باستخدام فوهة المتكاملة 85 ميكرون والبوابات والفولتية PMT المحددة سابقا في القسم 5.1 22. تأكد من تشغيل وحدة التخزين بالكامل من كل عينة على تدفق عداد الكريات لضمان مقارنة عادلة من العدد الإجمالي للدبقي-infiltPBMCs تصنيف في كل عينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم استخدام استراتيجية النابضة التالية لتجربة نموذجية: FSC-A مقابل SSC-A → SSC-H مقابل SSC-W → FSC-H مقابل FSC-W → CD45 مقابل العد → GR-1 مقابل CD11b → NK1.1 مقابل العد. وضعت بوابات على GR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي وخلايا NK1.1 + NK ثم يتم الطبقية على أساس GzmB التعبير (الشكل 5A). Backgating تلك الخلايا التعرف على الخلايا NK1.1 + NK وGR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي في تجاربنا على FSC-A مق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول وسيلة قوية وقابلة للتكرار للعزلة وتدفق cytometric تحليل PBMCs التي تسللت الماوس في وقت مبكر ورم في المخ المكروية. يتم إنشاؤها تعليق خلية الورم في تركيز يحددها التجريبي التي المغروسة stereotactically في المخطط من مخ الفأر. ثم يصرح باستخدامها الفئران في نقطة زمنية محددة سلفا يحددها التصميم التجريبي ويتم حصاد أدمغتهم ومعالجتها لعزل PBMCs-التسلل الورم التي immunolabeled مع مجموعات من الأجسام المضادة الأولية تألقي مترافق. ثم يتم كميا الخلايا immunolabeled التدفق الخل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NIH / NINDS) يمنح R01-NS074387، R01-R21 NS057711 و-NS091555 إلى MGC. NIH / NINDS منح R01-NS061107، R01-NS076991، R01-R21 NS082311 و-NS084275 لااا. المنح المقدمة من سعيد قلوب ليا، جامعة ميتشيغان مركز السرطان الشامل تمنح للMGC وPRL؛ قسم جراحة المخ والأعصاب، جامعة ميشيغان كلية الطب. معهد ميشيغان لالسريرية والبحوث الصحية، بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منحة 2UL1-TR000433. جامعة ميشيغان السرطان غرانت الأحياء التدريب بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NCI (المعهد الوطني للسرطان) منحة T32-CA009676؛ جامعة ميشيغان التدريب في الأساسية والسريرية علم الأعصاب بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NINDS منح T32-NS007222. وجامعة ميشيغان برنامج التدريب العلماء الطبية بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS (المعهد الوطني لعلوم الطب العام) منح T32-GM007863. المؤلفونإعادة شاكرين للقيادة الأكاديمية والدعم الذي تلقاه من الدكتور كارين Muraszko وقسم الجراحة العصبية. لM. داهلغرن، D. TOMFORD، وS. نابوليتان للدعم الإداري رائع. لM. Dzaman للحصول على المساعدة الفنية المعلقة. وفيل F. جينكينز للحصول على الدعم السخي تجاه شراء زايس 3D مجهر المسح الإلكتروني. علينا أيضا أن نعترف المختبر Kuchroo في كلية الطب بجامعة هارفارد الذي تم وضع نسخة معدلة من استراتيجية بوساطة وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي لعزل الخلايا وحيدة النواة الدماغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو s تعديل النسور المتوسطةGibco12430-054مع 4.5 جم / لتر D-glucose و L-glutamine و 25 mM HEPES و phenol red   ؛
دولبيكو s محلول ملحي مخزن بالفوسفات جيبكو14190-144 بدون كلوريد الكالسيوم أو كلوريد المغنيسيوم
مصل الأبقار الجنينأوميغا Scientific Inc.FB-11
البنسلين ستربتومايسين Gibco15140-12210,000 U / ml Penicillin ؛ 10,000 مو ؛ جم / مل ستربتومايسين   ؛
L-glutamineGibco25030-081200 mM
G418 كبريتات أوميغا العلميةGN-04
بورومايسين ثنائي هيدروكلوريد   Sigma-AldrichP8833من Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase بديل التربسين غير الثديي   ;Thermo ScientificSV30030.01في DPBS مع EDTA 
مقياس كثافة الدم المتباينفي الطور Sigma-AldrichZ3596290.1 مم بعمق 0.1 مم
Trypan Blue StainGibco15250-061
معقم 0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم ، USPHospiraNDC: 0409-488810 مل قوارير
0.6 مل أنابيب دقيقة مخروطية من مادة البولي بروبيلينيميجينيسي Scientific22-272
حقن هيدروكلوريد أتيباميزولأوريون فارماNDC: 52483-6298محلول 5 مجم / مل
حقن هيدروكلوريد الكيتامينفورت دودجNDC: 0409-2051محلول 100 مجم / مل
حقن هيدروكلوريد ديكسميديتوميدينزويتيسNDC: 54771-2805محلول 0.5 مجم / مل محلول
زيلازين هيدروكلوريدلويدNDC: 61311-481محلول 100 مجم / مل
حقن كاربروفينفايزرNDC: 61106-8501محلول 50 مجم / مل
حقن هيدروكلوريد بوبرينورفينريكيت بينكيزرNDC: 12496-07570.3 مجم / مل أمبولات
1 مل محاقن توبركولين  Covidien8881501400
26G x ½ (0.45 مم × 13 مم) إبر حقنة   ؛BD305111
مقص جراحي3M9661
محلول بروفيدون واليودAplicare82-217NDC: 52380-1905
مرهم العيون المعقم للفازلين  DechraNDC: 17033-211
70٪ وسادات تحضير كحول الأيزوبروبيلكيندال6818
شاش معقمCovidien8044غير منسوج ، 4 "× 4" ، 4 طبقات & nbsp ؛
1.7 مل أنابيب دقيقة مخروطية من مادة البولي بروبلينجينيسي Scientific22-281
إطار تجسيمي للماوسStoelting51730
مصباح جراحيPhilips BurtonCS316WCoolspot II Variable Spotlight
ملقط تشريح منحنيTed Pella Inc.5431
ضادات Colibri FST17000-03
مثقاب كهربائي لاسلكيدقيق Dremel 1100-01نموذج القلم ؛ 7.2 فولت ليثيوم أيون مع قاطع نقش محطة الإرساء
Dremel1051/32 "أو 0.8 مم قطر
حقنة ميكرولترهاميلتون75هاميلتون ميكرولتر 700 سلسلة ؛ 5 مو ؛ ل حجم
إبر حقنة ميكرولترهاميلتون7762-0633 جم ، محور صغير RN NDL ، 1.5 بوصة ، نمط النقطة 3 ، 6 / PK
Ethilon 3-0 خيوط نايلون أحادية الشعيرات السوداء   ؛Ethicon1663
قضيب التحريك المغناطيسيVWR74950-2967.9 مم × طول 50 مم (قطر 5/16 بوصة × 2 بوصة طول)
1 لتر زجاجة تخزين زجاجية لولبيةCorning1395النوع 1 ، زجاج البورسليكات من الفئة A
الهيبارين الصوديوم   ؛SagentNDC: 25021-4001,000 U / ml محلول
مضخة التمعجCole Parmer Instruments Group77200-60Master Flex Easy Load II محرك وحدة التحكم
الكربوجين المضغوط (95٪ O 2 < / sub > / 5٪ CO2< / sub>)متاح من البائع المحليN / Aمن النوع A ، اسطوانة كبيرة & nbsp ؛
20 جم × 1 ½ ؛ " إبر حادة من الألومنيوم كيندال88812023630.9 مم × 38.1 مم
دلو ثلج من مادة البولي يوريثينفيشربراند02-591-45السعة: 0.152 أوقية (4.5 لتر)
كولاجيناز (النوع I-S)سيجما ألدريتشC1639من المطثية النوسجي   ؛
ديوكسيربونوكلياز IWorthington Biochemical Corp.LS002007>2,000 وحدة كونيتز لكل ملغ الوزن الجاف
أطباق وزن البوليسترين السداسية الاستاتيكيهتيد بيلا Inc.20157-3معرف علوي 115 مم ، معرف قاعدة 85 مم ، حجم 203 مل
شفرات حلاقة أحادية الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ  Garvey40475
Bone rongeursFST16001-15
HemostatFST13014-14
مقص تشريح كبيرTed Pella Inc.1316
مقص تشريح صغيرFST14094-11
ملقط نهاية حادTed Pella Inc.13250
7 مل زجاج طاحونة مناديل DounceKontesKT885300-0007
Percoll Density Purcoll Density Unitrifugation Media GE HealthcareGE17-0891-01
10 مل ماصات مصليةGenesee Scientific12-104للاستخدام مرة واحدة ؛ معقمة
70 & mu ؛ M مصفاة خلية شبكية من النايلون المعقمة Fisherbrand22363548
Alexa Fluor 700 الفئران المترافقة المضادة للفأر CD45 (استنساخ: 30-F11)Biolegend103128
الماوس المترافق APC المضاد للفأر NK1.1 (استنساخ: PK136)eBiosciences 17-5941-82
الفئران المترافقة PE المضادة للفأر Gr-1 (استنساخ: RB6-8C5) BDPharmigen553128
PerCP / Cy5.5 الفئران المترافقة المضادة للفأر CD11b (استنساخ: M1 / 70)   ؛Biolegend101228
Alexa Fluor 700 - الفئران المترافقة IgG2b ، & kappa ؛ (استنساخ: RTK4530) التحكم في النمط المتماثل  Biolegend400628
الماوس المترافق APC IgG2a ، & kappa ؛ (استنساخ: eBM2a) التحكم في النمط المتماثل  eBioscience17-4724
الفئران المترافقة PE IgG2b ، & kappa ؛ (استنساخ: eB149 / 10H5) التحكم في النمط المتماثل   ؛eBioscience12-4031-82
PerCP / Cy5.5 الفئران المترافقة IgG2b ، & kappa ؛ (استنساخ: RTK4530) التحكم في النمط المتماثلBiolegend400632
الفأر المترافق بالأزرق المحيط الهادئ الجرانزيم B (الاستنساخ: GB11)  Biolegend515403
الفأر المترافق باللون الأزرق والمحيط الهادئ IgG1 ، & kappa ؛ (استنساخ: MOPC-21) التحكم في النمط المتماثل  Biolegend400151
Cytofix / CytopermBD554714
15 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلينGenesee Scientific21-103القاع المخروطي   ؛
الطرد المركزي من مادة البولي بروبلين سعة 50 ملGenesee Scientific21-108القاع المخروطي
12 مم × 75 مم أنابيب البولي بروبيلين FACS ذات القاع المستدير  Fisherbrand14-956-1B
FACSAria طلب خاص لأبحاث تدفق المنتج / فارز الخلاياBD & nbsp ؛650033
خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانيةنموذج شركة بيكرSG603: SterilGARD III Advance
شركة بت قطر أنابيب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
  3. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
  4. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
  5. Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912(2013).
  6. Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
  7. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
  8. Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
  9. Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
  10. Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
  11. El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
  12. Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
  13. Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10(2009).
  14. Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
  15. Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
  16. Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
  17. Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983(2008).
  18. Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
  19. Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
  20. Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
  21. Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
  22. Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
  23. Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
  24. Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528(2013).
  25. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
  26. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
  27. Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
  28. Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
  29. de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
  30. Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
  31. Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
  32. Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة