المقدمة هنا هي طريقة واضحة لعزل وتدفق تحليل cytometric من الخلايا وحيدة النواة الدم المحيطي-التسلل الورم يمكن أن ينتج تعتمد على الوقت بيانات كمية عن وضع عدد وتنشيط الخلايا المناعية التي تدخل المبكر المكروية ورم في المخ.
مقالة منهجية
المقدمة هنا هي طريقة واضحة لعزل وتدفق تحليل cytometric من الخلايا وحيدة النواة الدم المحيطي-التسلل الورم يمكن أن ينتج تعتمد على الوقت بيانات كمية عن وضع عدد وتنشيط الخلايا المناعية التي تدخل المبكر المكروية ورم في المخ.
وقد أظهرت مختبرنا مؤخرا أن القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا قادرة على القضاء على زرع orthotopically GL26 الماوس والفئران CNS-1 الاورام الدبقية الخبيثة قريبا بعد engraftment داخل الجمجمة إذا أديت الخلايا السرطانية نقص في التعبير عنها من كتين galectin β-غالاكتوزيد ملزم -1 (غال-1). مزيد من العمل مؤخرا يقول إن عدد سكانها GR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي أمر بالغ الأهمية لهذا الغرض. لفهم أفضل للآليات التي NK وخلايا الدم النخاعي التعاون لمنح رفض الورم غال-1-نقص قمنا بتطوير بروتوكول شامل لعزل وتحليل خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية-التسلل الورم (PBMC). ويتجلى الأسلوب هنا بمقارنة PBMC تسلل إلى المكروية الورم من غال-1، معربا عن GL26 الاورام الدبقية مع أولئك الذين أصبحوا غال-1-ناقص عبر shRNA ضربة قاضية. بروتوكول يبدأ مع وصفا لكيفية الثقافة وإعداد GL26 مLLS للتلقيح في مسانج C57BL / 6J مخ الفأر. ثم يوضح الخطوات المتبعة في عزلة وتدفق تحليل cytometric من PBMCs-التسلل الورم من أوائل المكروية ورم في المخ. هذه الطريقة قابلة للتكيف مع عدد من التصاميم التجريبية في الجسم الحي التي تتطلب بيانات الزمنية على تسلل المناعة في الدماغ. طريقة حساسة وقابلة للتكرار للغاية، كما PBMCs-التسلل الورم يمكن عزله عن الأورام داخل الجمجمة في أقرب وقت 24 ساعة بعد ورم engraftment مع عدد خلايا مماثلة لوحظ من وجهة يقابل الأورام وقت خلال تجارب مستقلة. A التجريبي واحد يمكن أن تؤدي الأسلوب من حصاد الدماغ لتحليل تدفق cytometric من PBMCs-التسلل الورم في ما يقرب من 4-6 ساعة اعتمادا على عدد من العينات لتحليلها. كما يمكن استخدام نماذج الورم البديلة و / أو الأجسام المضادة الكشف عن خلية محددة وفقا لتقدير التجريبيون على تقييم تسلل العديد من إمان أخرىأنواع الخلايا (ه) من الفائدة من دون الحاجة لإجراء تعديلات على الإجراء العام.
الاورام الدبقية هي فئة من سرطانات الدماغ الظهارية العصبية الناجمة عن الدبقية تتحول داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS). جميع الاورام الدبقية، ومنظمة الصحة العالمية (WHO) الصف الرابع الورم، أو ورم أرومي (GBM)، هو الأكثر شيوعا وفتكا 1. GBM هو صهر للغاية لرعاية المعايير من الحالية التي تتكون من الورم استئصال إلى أقصى حد ممكن تليها الأشعة بالإضافة إلى العلاج الكيميائي وما يصاحبه من المواد المساعدة مع temozolomide 2. هذه السرطانات القاتلة تحمل أحوال الطقس الكئيب أشهر فقط 15-18 من البقاء على قيد الحياة من وقت التشخيص الأولي مع 5٪ فقط من المرضى على قيد الحياة المرض بعد 5 سنوات 3.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ملاحظة: يرجى مراجعة بروتوكول كامل قبل إجراء التجارب. يجب الحصول على موافقة لاستخدام الحيوانات الفقارية من اللجنة المؤسسية المناسبة على استخدام ورعاية الحيوانات قبل المتابعة.
1. إعداد الخلايا السرطانية لداخل الجمجمة Engraftment
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يتم استخدام استراتيجية النابضة التالية لتجربة نموذجية: FSC-A مقابل SSC-A → SSC-H مقابل SSC-W → FSC-H مقابل FSC-W → CD45 مقابل العد → GR-1 مقابل CD11b → NK1.1 مقابل العد. وضعت بوابات على GR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي وخلايا NK1.1 + NK ثم يتم الطبقية على أساس GzmB التعبير (الشكل 5A). Backgating تلك الخلايا التعرف على الخلايا NK1.1 + NK وGR-1 + / + CD11b خلايا الدم النخاعي في تجاربنا على FSC-A مق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يصف هذا البروتوكول وسيلة قوية وقابلة للتكرار للعزلة وتدفق cytometric تحليل PBMCs التي تسللت الماوس في وقت مبكر ورم في المخ المكروية. يتم إنشاؤها تعليق خلية الورم في تركيز يحددها التجريبي التي المغروسة stereotactically في المخطط من مخ الفأر. ثم يصرح باستخدامها الفئران في نقطة زمنية محددة سلفا يحددها التصميم التجريبي ويتم حصاد أدمغتهم ومعالجتها لعزل PBMCs-التسلل الورم التي immunolabeled مع مجموعات من الأجسام المضادة الأولية تألقي مترافق. ثم يتم كميا الخلايا immunolabeled التدفق الخل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NIH / NINDS) يمنح R01-NS074387، R01-R21 NS057711 و-NS091555 إلى MGC. NIH / NINDS منح R01-NS061107، R01-NS076991، R01-R21 NS082311 و-NS084275 لااا. المنح المقدمة من سعيد قلوب ليا، جامعة ميتشيغان مركز السرطان الشامل تمنح للMGC وPRL؛ قسم جراحة المخ والأعصاب، جامعة ميشيغان كلية الطب. معهد ميشيغان لالسريرية والبحوث الصحية، بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منحة 2UL1-TR000433. جامعة ميشيغان السرطان غرانت الأحياء التدريب بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NCI (المعهد الوطني للسرطان) منحة T32-CA009676؛ جامعة ميشيغان التدريب في الأساسية والسريرية ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| دولبيكو s تعديل النسور المتوسطة | Gibco | 12430-054 | مع 4.5 جم / لتر D-glucose و L-glutamine و 25 mM HEPES و phenol red ؛ |
| دولبيكو s محلول ملحي مخزن بالفوسفات | جيبكو | 14190-144 | بدون كلوريد الكالسيوم أو كلوريد المغنيسيوم |
| مصل الأبقار الجنين | أوميغا Scientific Inc. | FB-11 | |
| البنسلين ستربتومايسين | Gibco | 15140-122 | 10,000 U / ml Penicillin ؛ 10,000 مو ؛ جم / مل ستربتومايسين ؛ |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 كبريتات | أوميغا العلمية | GN-04 | |
| بورومايسين ثنائي هيدروكلوريد | Sigma-Aldrich | P8833 | من Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase بديل التربسين غير الثديي ; | Thermo Scientific | SV30030.01 | في DPBS مع EDTA |
| مقياس كثافة الدم المتباين | في الطور Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 مم بعمق 0.1 مم |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| معقم 0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم ، USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 مل قوارير |
| 0.6 مل أنابيب دقيقة مخروطية من مادة البولي بروبيلينيمي | جينيسي Scientific | 22-272 | |
| حقن هيدروكلوريد أتيباميزول | أوريون فارما | NDC: 52483-6298 | محلول 5 مجم / مل |
| حقن هيدروكلوريد الكيتامين | فورت دودج | NDC: 0409-2051 | محلول 100 مجم / مل |
| حقن هيدروكلوريد ديكسميديتوميدين | زويتيس | NDC: 54771-2805 | محلول 0.5 مجم / مل محلول |
| زيلازين هيدروكلوريد | لويد | NDC: 61311-481 | محلول 100 مجم / مل |
| حقن كاربروفين | فايزر | NDC: 61106-8501 | محلول 50 مجم / مل |
| حقن هيدروكلوريد بوبرينورفين | ريكيت بينكيزر | NDC: 12496-0757 | 0.3 مجم / مل أمبولات |
| 1 مل محاقن توبركولين | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 مم × 13 مم) إبر حقنة ؛ | BD | 305111 | |
| مقص جراحي | 3M | 9661 | |
| محلول بروفيدون واليود | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| مرهم العيون المعقم للفازلين | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70٪ وسادات تحضير كحول الأيزوبروبيل | كيندال | 6818 | |
| شاش معقم | Covidien | 8044 | غير منسوج ، 4 "× 4" ، 4 طبقات & nbsp ؛ |
| 1.7 مل أنابيب دقيقة مخروطية من مادة البولي بروبلين | جينيسي Scientific | 22-281 | |
| إطار تجسيمي للماوس | Stoelting | 51730 | |
| مصباح جراحي | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| ملقط تشريح منحني | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| ضادات Colibri | FST | 17000-03 | |
| مثقاب كهربائي لاسلكي | دقيق Dremel | 1100-01 | نموذج القلم ؛ 7.2 فولت ليثيوم أيون مع قاطع نقش محطة الإرساء |
| Dremel | 105 | 1/32 "أو 0.8 مم قطر | |
| حقنة ميكرولتر | هاميلتون | 75 | هاميلتون ميكرولتر 700 سلسلة ؛ 5 مو ؛ ل حجم |
| إبر حقنة ميكرولتر | هاميلتون | 7762-06 | 33 جم ، محور صغير RN NDL ، 1.5 بوصة ، نمط النقطة 3 ، 6 / PK |
| Ethilon 3-0 خيوط نايلون أحادية الشعيرات السوداء ؛ | Ethicon | 1663 | |
| قضيب التحريك المغناطيسي | VWR | 74950-296 | 7.9 مم × طول 50 مم (قطر 5/16 بوصة × 2 بوصة طول) |
| 1 لتر زجاجة تخزين زجاجية لولبية | Corning | 1395 | النوع 1 ، زجاج البورسليكات من الفئة A |
| الهيبارين الصوديوم ؛ | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U / ml محلول |
| مضخة التمعج | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II محرك وحدة التحكم |
| الكربوجين المضغوط (95٪ O 2 < / sub > / 5٪ CO2< / sub>) | متاح من البائع المحلي | N / A | من النوع A ، اسطوانة كبيرة & nbsp ؛ |
| 20 جم × 1 ½ ؛ " إبر حادة من الألومنيوم كيندال | 8881202363 | 0.9 مم × 38.1 مم | |
| دلو ثلج من مادة البولي يوريثين | فيشربراند | 02-591-45 | السعة: 0.152 أوقية (4.5 لتر) |
| كولاجيناز (النوع I-S) | سيجما ألدريتش | C1639 | من المطثية النوسجي ؛ |
| ديوكسيربونوكلياز I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 وحدة كونيتز لكل ملغ الوزن الجاف |
| أطباق وزن البوليسترين السداسية الاستاتيكيه | تيد بيلا Inc. | 20157-3 | معرف علوي 115 مم ، معرف قاعدة 85 مم ، حجم 203 مل |
| شفرات حلاقة أحادية الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| مقص تشريح كبير | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| مقص تشريح صغير | FST | 14094-11 | |
| ملقط نهاية حاد | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 مل زجاج طاحونة مناديل Dounce | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Purcoll Density Unitrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 مل ماصات مصلية | Genesee Scientific | 12-104 | للاستخدام مرة واحدة ؛ معقمة |
| 70 & mu ؛ M مصفاة خلية شبكية من النايلون المعقمة | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700 الفئران المترافقة المضادة للفأر CD45 (استنساخ: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| الماوس المترافق APC المضاد للفأر NK1.1 (استنساخ: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| الفئران المترافقة PE المضادة للفأر Gr-1 (استنساخ: RB6-8C5) BD | Pharmigen | 553128 | |
| PerCP / Cy5.5 الفئران المترافقة المضادة للفأر CD11b (استنساخ: M1 / 70) ؛ | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700 - الفئران المترافقة IgG2b ، & kappa ؛ (استنساخ: RTK4530) التحكم في النمط المتماثل | Biolegend | 400628 | |
| الماوس المترافق APC IgG2a ، & kappa ؛ (استنساخ: eBM2a) التحكم في النمط المتماثل | eBioscience | 17-4724 | |
| الفئران المترافقة PE IgG2b ، & kappa ؛ (استنساخ: eB149 / 10H5) التحكم في النمط المتماثل ؛ | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP / Cy5.5 الفئران المترافقة IgG2b ، & kappa ؛ (استنساخ: RTK4530) التحكم في النمط المتماثل | Biolegend | 400632 | |
| الفأر المترافق بالأزرق المحيط الهادئ الجرانزيم B (الاستنساخ: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| الفأر المترافق باللون الأزرق والمحيط الهادئ IgG1 ، & kappa ؛ (استنساخ: MOPC-21) التحكم في النمط المتماثل | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix / Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلين | Genesee Scientific | 21-103 | القاع المخروطي ؛ |
| الطرد المركزي من مادة البولي بروبلين سعة 50 مل | Genesee Scientific | 21-108 | القاع المخروطي |
| 12 مم × 75 مم أنابيب البولي بروبيلين FACS ذات القاع المستدير | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria طلب خاص لأبحاث تدفق المنتج / فارز الخلايا | BD & nbsp ؛ | 650033 | |
| خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية | نموذج شركة بيكر | SG603 | : SterilGARD III Advance |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن