يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الفحص حساس للغاية لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلية

7.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53682

⸱

مارس 2, 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

في هذه المقالة

ملخص

الخطوة الأولى في دورة حياة فيروس الساحة هي ربط الجسيمات الفيروسية بالخلايا المضيفة. أبلغنا عن اختبار كمي قائم على (q) RT-PCR للكشف عن أحداث الارتباط بفيروس الساحة فائقة الحساسية وتقديرها.

الملخص

فيروسات Arena هي عائلة من فيروسات الحمض النووي الريبي المغلفة التي تسبب مرضا بشريا شديدا. الخطوة الأولى في دورة حياة فيروس الساحة هي ربط الجسيمات الفيروسية بالخلايا المضيفة. بينما يمكن قياس ارتباط الخلايا الفيروسية من خلال استخدام الفيروسات المصنفة بالبيوتين أو النظائر المشعة أو الأصباغ الفلورية ، فإن هذه الأساليب تتطلب عادة تعدد عالي من العدوى (MOI) لتمكين الكشف عن الفيروس المرتبط. نصف الفحص الكمي (q) RT-PCR الذي يقيس سلالة فيروس Junin Candid 1 المرفق عبر الكمية للحمض النووي الريبي الجيني الفيروسي المعبأ بالفيريون. يتميز هذا الاختبار بالعديد من المزايا بما في ذلك حساسيته الشديدة وقدرته على قياس التعلق عبر نطاق ديناميكي كبير من MOIs دون الحاجة إلى تنقية أو تسمية فيروس الإدخال. الأهم من ذلك ، يمكن تصميم هذا النهج بسهولة للاستخدام مع فيروسات أخرى من خلال استخدام كواشف qRT-PCR الخاصة بالفيروسات. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل هذا الاختبار للسماح بقياس الالتقام الخلوي للجسيمات وكشف الجينوم. في الختام ، نصف فحصا بسيطا ولكنه قوي لقياس شديد الحساسية لارتباط خلية فيروس الساحة.

المقدمة

Arenaviruses هي عائلة يلفها فيروسات الحمض النووي الريبي واحدة الذين تقطعت بهم السبل، التي يتم الاحتفاظ بها في المقام الأول في القوارض في الطبيعة 1-3. في حين أن هذه الفيروسات عادة بإنشاء عديمة الأعراض والتهاب مستمر في الخزانات القوارض 1،2، فإنها يمكن أن تسبب المرض الشديد في البشر 3. وتشمل الأنواع المسببة للأمراض الهامة الفيروس العالمي الجديد جونين (JUNV) (4) وفيروس العالم القديم لاسا 5، والتي هي وكلاء خاص بأسباب الأمراض الحمى النزفية الأرجنتينية في أمريكا الجنوبية وحمى لاسا في أفريقيا، على التوالي. الليمفاوي فيروس التهاب السحايا المشيمي (LCMV)، وفيروس prototypic الأسرة 6، له توزيع في جميع أنحاء العالم، وهي مسؤولة عن مجموعة متنوعة من الحالات المرضية بما في ذلك التهاب السحايا العقيم في الأفراد المناعة 6، عيوب خلقية خطيرة في الجنين 7، أو القتل العالية في كبت المناعة الأشخاص التالية أسماؤهم الصلبة الجهاز زرع 8،9. عدم وجود الولايات المتحدةوافق عليها إدارة الغذاء والدواء (FDA) اللقاحات أو الأدوية المضادة للفيروسات فعالة لمكافحة هذه الفيروسات يسلط الضوء على الحاجة الماسة إلى وضع استراتيجيات جديدة لاستهداف علاجيا هذه الجراثيم الناشئة / إعادة الناشئة.

يتكون الجينوم الفيروسة الرملية من جزأين واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي، وكبير (L) (~ 7.2 كيلوبايت) والصغيرة (S) (~ 3.6 كيلو بايت) شرائح 10. الجزء S بترميز البروتين النووي الفيروسي (NP) وبروتين سكري مغلف (GP) في حين أن شريحة L بترميز البلمرة الفيروسي (L) والبروتين مصفوفة (Z). يتم تعبئتها من L و S شرائح الحمض النووي الريبي الجينوم (vRNAs) في virions 10-12. الخطوة الأولى للعدوى الفيروسة الرملية هو مرفق من الجسيمات الفيروسية لاستضافة الخلايا من خلال التفاعل بين GP الفيروسي ومستقبلات الخلايا المضيفة المقابلة لها والتي، على JUNV، يتضمن ترانسفيرين مستقبل بشري 1 (hTfR1) 13،14. وعقب المرفق، يتم أخذ جزيئات JUNV داخل الخلية عبر بوساطة بالكلاذرين الإلتقام 15.الجسيمات ثم المرور إلى أواخر الاندوسوم حيث درجة الحموضة منخفضة من هذا الحيز مشغلات تفعيل GP 16،17. تنشيط مرة واحدة، وترميز GP إدراج الانصهار الببتيد في غشاء endosomal، وبدء الانصهار بين الأغشية الفيروسية وendosomal. النتائج الاندماج الناجحة في الإفراج عن vRNAs المعبأة الفيريون إلى السيتوبلازم، حيث أنها بمثابة نماذج للنسخ المتماثل الجيني والنسخ. عندما تتولد كميات كافية من البروتينات وvRNAs الهيكلية الفيروسية، والجسيمات الجديدة بالتجمع وبرعم من الخلية المصابة لاستكمال دورة الحياة 18.

لتسهيل اكتشاف استراتيجيات جديدة لاستهداف علاجيا وarenaviruses المسببة للأمراض، وركزت مجموعتنا على تحديد العوامل المضيفة التي تعتبر بالغة الأهمية لانتشار الفيروس، ولكن يمكن الاستغناء عنها للمضيف. في هذا السياق، وتحديد مرحلة دقيقة (ق) من دورة حياة الفيروس التي تسيطر عليها عوامل المضيف مثل هذه لا بد من توجيهتطوير الاستراتيجيات المضادة للفيروسات. هنا، نحن تصف (ف) فحص الكمي استنادا RT-PCR والتي يمكن استخدامها لقياس التعلق خلية الفيروسة الرملية لغرض تحديد ما إذا كانت بروتينات المضيف المحدد و / أو الجزيئات المضادة للفيروسات تؤثر هذه المرحلة الأولية من دخول الفيروس 19. وقد ظهرت أساليب بديلة لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلايا virions المسمى مع البيوتين 20، الأصباغ الفلورية 21، أو النظائر المشعة 22. عيوب هذه الطرق يمكن أن تشمل متطلبات كميات كبيرة من الفيروس المدخلات (مولتيبليكيتييس عالية من العدوى (وزارة الداخلية))، واستخدام النشاط الإشعاعي، و / أو التعامل معها خطوات إضافية لإعداد فيروس الإدخال (مثل التركيز و / أو وضع العلامات من الفيروسات) . على وجه الخصوص، واستخدام عالية وزارة الداخلية يجعل من الصعب التمييز الإنتاجي مقابل الأحداث التعلق غير منتجة 15،23. مقايسة على أساس QRT-PCR وصفها هنا يمكن الكشف عن أحداث المرفق باستخدام عدد قليل من 20 لوحة لوحدات مينغ (PFUs) من الفيروس، وهو ما يترجم إلى وزارة الداخلية من 0.0004 لوحة 48-جيدا. ولذلك، فإن حساسية قوية للمقايسة يتغلب متطلبات عالية وزارة الداخلية، فضلا عن أي خطوات وضع العلامات فيروس أو التركيز. وعلاوة على ذلك، يمكن للفحص أن يكون ط) تكييفها لقياس الفيريون الإلتقام وكذلك الإفراج عن جينوم الفيروس إلى السيتوبلازم بعد الانصهار والثاني) مصممة خصيصا للاستخدام مع الفيروسات الأخرى من خلال تطوير الكواشف QRT-PCR الفيروس محددة (للحصول على أمثلة، انظر 24-27).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ بروتوكول صفها من استخدام صارمة تقنية قبل PCR (انظر 28 لمحة عامة ممتازة حول كيفية انشاء مختبر قبل PCR وكيفية إجراء التجارب باستخدام تقنية جيدة قبل PCR). لا بد من أن جميع الكواشف والمعدات خالية من تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل الهدف QPCR والضوابط المناسبة في مكانها الصحيح لاكتشاف مثل هذا التلوث. ويظهر لمحة عامة عن البروتوكول في الشكل 1.

1. إعداد وسائل الإعلام وخلايا البذور في لوحات 48-جيدا

  1. إعداد 500 مل من اكتمال Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين ستربتومايسين، و 1٪ HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-الإيثان حامض السلفونيك) حل العازلة بإضافة 50 مل الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 5 مل كل من البنسلين، الستربتوميسين و100X HEPES حل العازلة 100X إلى زجاجة 500 مل من DMEM. يمكن تخزين هذا الكاشف في 476؛ مئوية لمدة أشهر.
  2. البذور 2.5 × 10 4 خلايا الفيرو E6 في بئر في لوحة زراعة الأنسجة 48-جيدا في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر من اكتمال DMEM. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 ل10-18 ساعة.
    1. البذور لوحة في نهاية يوم العمل. اختبار كل عينة الفيروس في إما مكررة أو ثلاث نسخ الآبار.
      ملاحظة: في حين يوصف منصة 48 على أساس جيد لهذا الاختبار، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن توسيع نطاق الفحص وصولا لاستخدامها في 96- أو لوحات 384 جيدا.

2. تنفيذ مرفق فيروس الخلية

ملاحظة: الفيروس المستخدمة في هذا البروتوكول، JUNV سلالة صريح # 1 (C # 1)، وقد استخدمت بنجاح كلقاح حي مخفف للوقاية من مرض JUNV 29. وقد استمدت JUNV C # 1 من ضراوة XJ JUNV سلالة من خلال مرور التسلسلي سواء في المجراة في المختبر ويختلف من سلالة XJ الوالدين بنسبة 12 الأحماض الأمينية 30. Becausالبريد JUNV C # 1 هو مستوى السلامة الحيوية (بي إس إل) في التصنيف -2 الممرض، يجب أن يتم العمل الموصوف في هذا القسم من استخدام المناسبة BSL-2 الممارسات 31. ويشمل ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية (مثل حماية العين، ومعطف المختبر، والقفازات مزدوجة)، والسلامة البيولوجية مجلس الوزراء من الدرجة الثانية، والتأكد من أن جميع الموظفين قد تلقوا التدريب المؤسسي والموافقات المطلوبة للتعامل مع بأمان هذا الحي.

  1. تمييع JUNV C # 1 عينة (ق) لفحصها لPFUs المطلوبة أو تركيز وحدات تشكيل في الجليد الباردة الكامل DMEM وتخزينها على الجليد حتى جاهزة للإضافة إلى كل بئر.
    ملاحظة: كبديل لإجراء الدراسات ملزمة مع فيروس مخففة في الكامل DMEM، واستخدام وسيلة الحد الأدنى تحتوي على برنامج تلفزيوني مع تركيز انخفاض المصل (2٪) والعازلة المناسبة لتحديد ما إذا كان المصل قد يسبب تشويشا مع مرفق الفيروس. وذكرت والبروتوكولات مرفق مشابهة للبحث عن الفيروسات البديلة استخدام RPMI 1640 وسيط وبدون bicarboنيت تحتوي على 0.2٪ ألبومين المصل البقري، 10 ملي (2- (morpholino) حمض ethanesulfonic)، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 6.8 32. قد تكون هذه الوسائط ملزمة متفوقة على منع التغييرات الرقم الهيدروجيني التي يمكن أن تحدث عند إزالة وسائل الاعلام من -environment CO 2 الحاضنة.
    1. تطعيم الآبار مع PFUs تتراوح ما بين 200 إلى 2000 للحد من أحداث التعلق غير منتجة. كما هو مبين في الشكل 2، هذا الاختبار قادر على اكتشاف المرفق باستخدام عدد قليل من 20 PFU (أو ما يصل إلى 2 × 10 6 PFU).
    2. خلق مزيج الرئيسي من الفيروسات للتلقيح على الخلايا. سيتم تلقيح كل عينة الفيروس على الآبار مكررة في حجم 50 ميكرولتر لكل بئر. لذلك، إذا كان المطلوب إضافة 2000 PFUs من الفيروس لكل بئر، وتمييع 4800 PFUs إلى إجمالي حجم 120 ميكرولتر من الجليد الباردة استكمال DMEM.
      1. للسيطرة على خصوصية الفحص، استخدام زوج متطابق من الهامستر الصيني خطوط الخلايا المبيض إما لا تعبر عن TfR1 (TRVb) أو إكسبيجب ريس hTfR1 (TRVb-1) كما JUNV مرفق لهذه الخلايا إما أن تخفض أو لا، على التوالي 13،33. بدلا من ذلك، علاج الخلايا مع البروتيني مثل بروتين كاف لمنع التعلق الفيروسة الرملية 34 أو دخول 35. ويمكن أيضا اعتبار للذوبان hTfR1 أو ch128.1 الأجسام المضادة monocolonal، التي هي محددة لhTfR1، كما هي معروفة لمنع دخول JUNV إلى خلايا 13،36. بالإضافة إلى ذلك، المعالجة الخلايا مع المانوز الحرة 14 أو حضانة الجسيمات مع تحييد الأجسام المضادة-JUNV محددة 37 يمكن أن تمنع دخول الفيروس.
      2. يرجى ملاحظة، مع ذلك، أن هذه الكواشف والنهج الأخيرة، على الرغم من منع دخول JUNV، لم تتأكد لمنع المرفق، على الرغم من أن هذا هو التفسير المحتمل. ويمكن استخدام بروتوكول صفها هنا لتحديد رسميا ما إذا كانت هذه الطرق المختلفة مرفق تأثير الفيريون.
  2. إزالة لوحات من الحاضنة 37 درجة مئوية ووضع إما في 4 درجات مئوية الثلاجة أو على الجليد لمدة 15 دقيقة لكبح قدرة الخلايا مطلي لتنفيذ الإلتقام.
  3. بعد ذلك، نضح DMEM الكامل من كل بئر وغسل بسرعة كل بئر مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني (فوسفات مخزنة المالحة) ودرجة الحموضة 7.4. ثم إضافة 50 ميكرولتر من عينات الفيروس قبل المخفف (المعد في الخطوة 2.1) إلى الآبار المناسبة.
  4. التفاف لوحة في غلاف بلاستيكي ووضع على الفور إما العودة على الجليد أو في 4 درجات مئوية الثلاجة لمدة 1 و 1.5 ساعة للسماح مرفق فيروس تحدث. الحفاظ على لوحة، وغسل العازلة، وعينات فيروس البرد في 4 درجات مئوية طوال هذه الخطوة.
  5. بعد الانتهاء من 4 درجات مئوية الحضانة، ونضح قيحة الفيروس وغسل كل بئر 3 مرات مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.

3. الفيروسي RNA استخراج

  1. تنقية RNA الفيروسي من JUNV C # 1 الجسيمات المعلقة على الطبقات الوحيدة باستخدام طقم التجارية (على سبيل المثال، RNeasy عدة البسيطة) أكوردينغ لبروتوكول الشركة المصنعة. على وجه التحديد، اتبع "تنقية الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا الحيوانية باستخدام بروتوكول التكنولوجيا تدور" في الصفحات 23-28 في دليل البسيطة RNeasy (الطبعة ال 4 أبريل 2006) مع التعديلات الواردة أدناه.
    1. ليز الخلايا كما هو مشروح في خطوة 1B وذلك بإضافة 350 ميكرولتر من RLT العازلة تحلل مباشرة إلى كل بئر. مزيج المخزن المؤقت عدة مرات لضمان تحلل الخلية. لاحظ أن الخلايا ليز بسهولة في هذا المخزن المؤقت وتحلل كامل يمكن التحقق منها عن طريق عرض الآبار تحت مجهر مقلوب.
    2. نقل ينتج عن ذلك من المحللة الخلية إلى العمود عدة (الخطوة 3A) واتبع باقي البروتوكول كما هو موضح. عند هذه النقطة، تم تحييد الفيروس عن طريق المخزن المؤقت تحلل ذلك يمكن أن يتم تنفيذ الخطوات المتبقية من بروتوكول خارج مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية شريطة عدم أنابيب عدة ليست ملوثة بفيروس المعدية.
    3. تتضمن الخطوة الاختيارية 9 من بروتوكول الشركة المصنعة، الذي هو المضافاتIONAL الطرد المركزي لعمود الدوران للقضاء على أي المرحل ممكن من الاحتياطي RPE.
    4. في الخطوة النهائية بروتوكول الشركة المصنعة (الخطوة 10)، أزل الحمض النووي الريبي تنقيته من عمود الدوران باستخدام 30 ميكرولتر من nuclease خالية ده 2 O. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية في هذه المرحلة أو استخدامها مباشرة في فحص QRT-PCR. لمنع تدهور عينات الحمض النووي الريبي الفيروسية تنقيتها من nucleases، استخدام الكواشف والمعدات nuclease خالية والحفاظ على عينات الحمض النووي الريبي إذابة على الجليد.
      ملاحظة: المخازن RLT وRW1 تحتوي على الملح غوانيدين ويجب أن لا تكون مختلطة مع مواد التبييض. يحتوي عازلة RW1 الإيثانول.

4. QRT-PCR قياس الجينوم الفيروسي

  1. لتحويل JUNV C # 1 شريحة S RNA إلى كدنا] لQPCR لاحق، تعرض RNA الفيروسي (ولدت في الخطوة 3.1.4) لRT في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر.
    1. لإعداد رد فعل RT، أولا إنشاء مزيج الرئيسي يحتوي على كل من الكواشف التالية في رد الفعل: 6.75 ميكرولتر من نوكليازخالية ده 2 O و 5 ميكرولتر من الأوراق المالية 2 ميكرومتر من RT التمهيدي S 2098- 2075- ل(5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3)، وهو مكمل للمنطقة NP الجزء S RNA الجيني، 5 ميكرولتر من العازلة 10X PCR الثاني، 11 ميكرولتر من 2 الحل 25 مم MgCl، 1.25 ميكرولتر (62.5 حدات) من RT انزيم، 1 ميكرولتر (0.4 وحدات) من المانع ريبونوكلياز، و 10 ميكرولتر من 500 ميكرومتر الأسهم من dNTPs.
      ملاحظة: أثناء النسخ المتماثل الفيروسة الرملية، يتم إنشاء 4 أنواع شريحة S RNA الفيروسي: الحمض النووي الريبي كامل طول الجينوم (vRNA)، كامل طول antigenomic RNA (vcRNA) (هذا هو تكملة العكسي من vRNA)، واثنين من mRNAs subgenomic ترميز الجينات NP وGP، على التوالي. التمهيدي RT المذكورة هنا غير محددة فقط لشريحة S vRNA، ولكن ليس vcRNA، NP مرنا، أو GP مرنا.
    2. المزيج بلطف مزيج الرئيسي RT ثم قسامة 40 ميكرولتر إلى الفردية 0.2 مل أنابيب PCR. إضافة 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى كل أنبوب. تشمل ط) أنبوب أي سيطرة قالب (على سبيل المثال. إضافة 10 ميكرولتر من ده nuclease خالية من 2 O 40 ميكرولتر من مزيج الرئيسي) والثاني) على أي سيطرة إنزيم RT (على سبيل المثال إضافة 10 ميكرولتر من المصابات يعرف عينة الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى 40 ميكرولتر من مزيج الرئيسي التي لم تتلق أي إنزيم RT) للكشف عن تلوث الكواشف RT مع تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل الهدف الفيروسي. تشمل الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا غير المصابة مع مزيج الرئيسي RT الكامل للسيطرة على خصوصية فحص في وجود الحمض النووي الريبي الخلوية.
    3. بالإضافة إلى ذلك، تشمل عينة الحمض النووي الريبي الفيروسية إيجابية معروفة للمزيج الرئيسي الكامل للتحقق من جودة الكواشف RT. لاحظ أن حجم رد الفعل RT يمكن خفضها الى 25 ميكرولتر إذا لزم الأمر.
  2. تعرض أنابيب RT لظروف الدراجات التالية: 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 48 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. لاحظ أن العينات يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة أو ترك بين عشية وضحاها في thermocycler بإضافة C خطوة 4 درجات.
  3. Perform QPCR في الحجم الكلي لل25 ميكرولتر.
    1. جعل مزيج الرئيسي QPCR عن طريق الجمع بين ما يلي: ميكرولتر 2.5 (السهم 9 ميكرومتر) من كل التمهيدي PCR إلى الأمام S1937 + ل1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') وعكس PCR التمهيدي S 2001- 1982- إلى (5 "-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3)، 2.5 ميكرولتر (السهم 2 ميكرومتر) من QPCR التحقيق S 1960+ ل1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3)، و 12.5 ميكرولتر من سيد 2X عالمية QPCR مزج. لاحظ أن التمهيدي إلى الأمام ذكرت هنا، والتي هي محددة لJUNV C # 1، يختلف من 1 الإقليم الشمالي من تسلسل التمهيدي ذكرت في الأصل 38، الذي يستهدف JUNV سلالة فتاكة روميرو.
    2. المزيج بلطف الحل ومن ثم إضافة 20 ميكرولتر من كل QPCR جيدا. إضافة 5 ميكرولتر من كل رد فعل RT إلى الآبار QPCR المناسبة. إجراء QPCR في ثلاث نسخ لكل عينة اختبار. لاحظ أن حجم رد الفعل PCR يمكن خفضها الى اقل من 12.5 ميكرولتر إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: البرنامج المرتبطالجهاز سوف QPCR توليد أرقام نسخة المطلقة JUNV C # 1 شريحة S RNA الجيني من خلال مقارنة قيمة كل عينة غير معروفة لسلسلة من التخفيفات القياسية البلازميد ترميز JUNV C # 1 NP الجين، وهو الهدف من التمهيدي QPCR والتحقيق تعيين. فحص QPCR يمكن أن توفر فقط الكميات للقيم التي تقع ضمن نطاق المنحنى القياسي. لهذا السبب، وتشمل الكميات التالية البلازميد (في الآبار ثلاث نسخ): 5، 50، 5 × 10 3، 5 × 10 5، و 5 × 10 7 نسخ لكل بئر.
  4. تحميل لوحة QPCR في thermocycler وتشغيل ظروف التفاعل التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    1. جمع وتحليل البيانات لتحديد كمية الفيروسي RNA موجودة في كل عينة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. لإنشاء منحنى قياسي باستخدام عينة تنقيته حديثا البلازميد التي تحتوي على القطران QPCRالحصول على تسلسل، أولا تحديد عدد نسخ البلازميد في هذا الحل.
    1. حساب الوزن الجزيئي للالبلازميد. إذا كان يعرف تسلسل البلازميد بأكمله، وحساب هذا باستخدام الصيغة التالية: MW = ([A * 312.2] + [G * 328،2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13). تذكر لتشمل عدد من النوكليوتيدات معينة وجدت في كل فرع من البلازميد المزدوج تقطعت بهم السبل.
    2. إذا كان يعرف حجم البلازميد ولكن تسلسل الدقيق هو لا، وحساب ميغاواط في ظل افتراض أن كل زوج قاعدة dsDNA له ميجاوات من 600.
      ملاحظة: pCAGGS-JUNV C # 1 NP البلازميد المستخدمة هنا ديها ميجاوات من 4.2 × 10 6.
    3. مرة واحدة وقد تم تحديد ميجاوات من البلازميد، وحساب كم نسخة لكل ميكرولتر موجودة في المحلول البلازميد.
    4. أولا حساب ميكروغرام إجمالي البلازميد في الحل، ثم تحويل هذا إلى الشامات البلازميد (على سبيل المثال إذا كانت مضمنة 69 ميكروغرام البلازميد في 300 ميكرولتر من الماء، ثم 6.9 × 10 -5 ز البلازميد * 1 الخلد / 4.2 × 10 6 ز البلازميد = 1.6 × 10 -11 الشامات البلازميد)، والتي يمكن تحويلها إلى نسخ عدد (على سبيل المثال 1.6 × 10 -11 الشامات البلازميد * 6.022 × 10 23 الجزيئات / الخلد = 9.8 × 10 12 الجزيئات (أو نسخ)).
    5. تقسيم مجموع نسخ البلازميد في حل البلازميد من حجم هذا الحل للحصول على نسخ لكل ميكرولتر (على سبيل المثال 9.8 × 10 12 نسخة / 300 ميكرولتر = 3.28 × 10 10 نسخ).
    6. تمييع هذا الحل مناسبا بحيث يمكن تحميل 5 مجلدات ميكرولتر على لوحة PCR لتقديم مجموعة من الأرقام نسخة اللازمة لإنشاء منحنى قياسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتدليل على حساسية والنطاق الديناميكي للمقايسة QPCR، تعرضت كميات معروفة من البلازميد ترميز الجين NP من JUNV C # 1 (المدى 5-5 × 10 7 نسخ) لQPCR كما هو موضح في المادة 4 من البروتوكول. فحص حساس ويمكن الكشف موثوق قليل تصل إلى 5 نسخ من الحمض النووي الهدف (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، والنطاق الديناميكي للمقايسة كبير و، كما هو مبين في الشكل 2، يمكن أن تغطي على الأقل 7 سجلات القالب. في حين لم تظهر، فقد اكتشفنا ما ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

البروتوكول وصفنا واضح ومباشر، وقدم قوية ويلاحظ الاعتبارات الهامة التالية. أولا، يجب أن توظف صارمة قبل PCR تقنية (انظر 28 للاستعراض ممتاز). لا بد من أن جميع الكواشف والمعدات خالية من تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل الهدف QPCR والضوابط المناسبة في مكانها الصحيح لاكتشاف مثل هذا التلوث. ثانيا، للكشف عن الفيروس الخلية مرفق جزء من البروتوكول، والفيروسات، والخلايا، وسائل الإعلام يجب أن تبقى في 4 درجات مئوية لمنع الإلتقام من virions محددة السطح. ثالثا، يجب على كمية من ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

نشكر ماركوس ثالي، ناثان روي، كريستوفر زيغلر، إميلي بروس، وبنيامين الملك لإجراء مناقشات مفيدة والمعاهد الوطنية للصحة لدعم هذه الدراسات من خلال المنح T32 AI055402 (JK)، R21 AI088059 (جي بي)، وP20RR021905 (JB) .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMLife Technologies11965-118
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-163100x
HEPES BufferSolution Life Technologies15630-130100x
PBS pH 7.4Life Technologies10010-0231x
Vero E6 CellsType CultureCollection CRL-1586
كوستار 48 بئر لوحةCorning3548
RNeasy mini kitQiagen74106لا تخلط المخازن المؤقتة RLT أو   RW1 مع مبيض
QIAshredder الخالطQiagen79654
Taqman Universal PCR Master MixLife Technologies4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µ ل)خليط لايف تكنولوجيز4311235
dNTP (10 ملي مولار ؛ 2.5 ملي مولار لكل dNTP) لايفتكنولوجيزN808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II و 25 ملي مولار محلول MgCl2لايف تكنولوجيزN808-0010
مثبط RNase (5000U / 100 & micro; ل)Life TechnologiesN808-0119
RT التمهيدي 5'-AAGGGTTTAAAAT
GGTAGCAGAC-3'		تقنيات الحمض النووي المتكاملة250 نانومول DNA oligoالقياسية تحلية
المياه إلى الأمام qPCR التمهيدي  5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'لايف تكنولوجيز4304971تحلية المياه القياسية
التمهيدي qPCR العكسي 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'4304971 تحليةالقياسية
TaqMan Probe 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 'Life Technologies4316033منقاة HPLC
(0.1 مل)تقنيات الحياة4346906
StepOnePlus Real-Time PCRSystem Life Technologies4376598أو أي أداة qPCR أخرى
American المياه لوحة تفاعل MicroAmp بصرية سريعة 96 بئر

المراجع

  1. Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
  2. Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
  3. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
  4. Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
  5. Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
  6. Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
  7. Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
  8. Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
  9. Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
  10. Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
  11. Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
  12. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043(2015).
  13. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
  14. Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
  15. Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
  16. Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
  17. Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
  18. Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
  19. Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
  20. Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
  21. Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131(2013).
  22. Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
  23. Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183(2007).
  24. Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911(2014).
  25. Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217(2009).
  26. Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
  27. Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
  28. Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14(2007).
  29. Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
  30. Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
  31. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
  32. White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
  33. McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
  34. Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
  35. Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
  36. Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
  37. Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
  38. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
  39. Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
  40. Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

ارتباط فيروس Arenaمقايسة qRT-PCRتقدير كمية الحمض النووي الريبي الفيروسيارتباط الفيروس بالخليةفيروس Junin Candid 1خلايا Vero E6طقم استخلاص الحمض النووي الريبيالكشف بواسطة qPCRخزانة السلامة البيولوجيةاستخلاص الحمض النووي الريبي الفيروسي
الفحص حساس للغاية لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.