مقالة منهجية

الفروق بين الجنسين في ماوس الحصين النجمية بعد

13.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53695

⸱

أكتوبر 25, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

في هذه المقالة

ملخص

الخلايا النجمية هي واحدة من اللاعبين الرئيسيين الأكثر أهمية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). هنا، نحن الإبلاغ عن طريقة عملية من تلاعب الحصين بروتوكول ثقافة نجمية من أجل دراسة الآليات الكامنة وراء وظيفة نجمية في الذكور والإناث الجراء الوليد بعد في المختبر نقص التروية.

الملخص

دباق النجمي التالية نقص الأكسجة / نقص التروية (مرحبا) إصابات الدماغ ذات الصلة ب يلعب دورا في زيادة معدلات الاعتلال والوفيات عند الولدان. وتشير الدراسات السريرية الحديثة أن شدة إصابات الدماغ يبدو أن ممارسة الجنس تعتمد، وأن الولدان الذكور أكثر عرضة لآثار إصابات الدماغ المرتبطة مرحبا، مما أدى إلى نتائج عصبية أشد بالمقارنة مع الإناث مع إصابات الدماغ قابلة للمقارنة. تطوير وسائل موثوق بها لعزل والمحافظة على السكان عالي التخصيب من الخلايا النجمية الحصين بالغت أمر ضروري لفهم الأساس الخلوي للفروق بين الجنسين في النتائج المرضية مرحبا حديثي الولادة. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة لخلق الجنس الثقافات نجمية الحصين المحددة التي تتعرض للنموذج في المختبر نقص التروية، والحرمان من الأوكسجين الجلوكوز، تليها عودة التأكسج. تم فحص دباق النجمي رد الفعل لاحق من immunostaiنينغ للبروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP) وS100B. هذا الأسلوب يوفر أداة مفيدة لدراسة دور الذكور والإناث النجمية الحصين التالية مرحبا حديثي الولادة، كل على حدة.

المقدمة

الخلايا النجمية هي واحدة من اللاعبين الرئيسيين الأكثر أهمية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). متزايد من الأدلة يشير إلى أن أدوار الخلايا النجمية هي أكثر من مجرد تقديم الدعم العصبية. في الواقع، يمكن للأدوار الخلايا النجمية في ظل الظروف الفسيولوجية تكون معقدة جدا، مثل توجيه الهجرة من محاور تطوير 1، وتنظيم الجهاز العصبي المركزي تدفق الدم 2، والحفاظ على توازن درجة الحموضة في السائل الخلالي متشابك 3، والمشاركة في حاجز الدم في الدماغ 4 وانتقال متشابك 5. في ظل ظروف مرضية، النجمية تستجيب للإصابة مع عملية تسمى دباق النجمي رد الفعل الذي التشكل، عدد، موقع، والطوبوغرافيا (فيما يتعلق المسافة من الإهانة) وظيفة من وظائف الخلايا النجمية قد تتغير بطريقة متجانسة 6،7. دباق النجمي ينظر التالية حديثي الولادة الاعتلال الدماغي نقص تروية ميتة ربما يسهم في الإصابة بالأمراض والوفيات بين حديثي الولادة 8.

وتشير الدراسات السريرية والتجريبية الحديثة أن شدة إصابات الدماغ ويبدو أن تعتمد على الجنس وأن الولدان الذكور أكثر عرضة لآثار نقص الأكسجة / نقص التروية (مرحبا) إصابات الدماغ ذات الصلة ب، مما أدى إلى نتائج عصبية أشد بالمقارنة مع الإناث مع إصابات المخ مقارنة 9-11. على الرغم من أن توطين إصابة يعتمد على عمر الحمل ومدة وشدة الإهانة، قرن آمون هو واحد من أكثر المناطق تنفذ عادة في الجهاز العصبي المركزي بعد مرحبا حديثي الولادة المدى، وزيادة تم تأكيد دباق النجمي الحصين بنسبة تصل التنظيم من البروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP) 3 د بعد مرحبا حديثي الولادة 7،10،12،13. وقد أظهرت الفروق بين الجنسين في وظيفة الخلايا النجمية في كل من حديثي الولادة والقوارض الكبار بعد نقص التروية الدماغية 14،15. وبالإضافة إلى ذلك، فقد تبين قابلية نجمي الذكور إلى نقص التروية في المختبر عن طريق زيادة سلالموت ل بالمقارنة مع الخلايا النجمية القشرية الإناث في الثقافة 16.

تبدأ الفروق بين الجنسين في الرحم وتستمر حتى الموت 17. على مدى العقد الماضي، كانت أهمية إدراج الجنسين في ظروف تجريبية في زراعة الخلايا وفي الدراسات المجراة التركيز من معهد الطب والمعاهد الوطنية للصحة لطلب المعرفة الأساسية في الفروق بين الجنسين ينظر في الظروف الفسيولوجية والمرضية 17،18 . تطوير وسائل موثوق بها لعزل والمحافظة على السكان من الخلايا النجمية الحصين بالغت أمر ضروري لفهم الأساس الخلوي للفروق بين الجنسين في النتائج المرضية مرحبا حديثي الولادة. وقد تم تصميم هذه الدراسة لتوفير التقنيات اللازمة لإعداد المخصب مصنفة حسب الجنس الثقافات نجمية الحصين من الفئران حديثي الولادة من أجل تقييم أدوار الخلايا النجمية GFAP-مناعيا التالية الأوكسجين / الجلوكوز الحرمان (OGD) وعودة التأكسج (REOX)، الأمر الذي أدىمرحبا في بيئة زراعة الخلايا. هذه التقنية يمكن استخدامها لاختبار أي فرضية تتعلق النجمية قرن آمون في الذكور والإناث حديثي الولادة في ظل ظروف normoxic والدماغية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم إجراء هذه الدراسة وفقا لتوصية دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعهد الوطني للصحة. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من جامعة ويسكونسن ماديسون، رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام. تم اعتماد بروتوكول الثقافة نجمية الأساسي الذي يرد هنا من البروتوكولات التي قدمها تشانغ Y 19 آخرون. وجنكيز P 20 آخرون مع بعض التعديلات.

1. الحصين تشريح ونجمية الثقافة

  1. إعداد جميع الكواشف والمواد اللازمة بما في ذلك مقص جراحي، ملقط الدقيقة على نحو سلس، ملقط غيض مسطحة، والمناشف الورقية، كيس النفايات، و 70٪ من الإيثانول و 2 أطباق تشريح (3.5 سم القطر) على الجليد مليئة 2 مل هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) كل . تأكد من أن المعدات الجراحية هم عقيمة (الأوتوكلاف) قبل إجراء واستخدام كل المواد الأخرى (نجمية تصفيح المتوسطة: المصل DMEM + 5٪ حصان +1٪ البنسلين ستربتومايسين، مصل الحصان، HBSS، 0.25٪ التربسين، coverslips الزجاج، أطباق بتري، 15/50 مل أنابيب، قوارير T25، الخ)، وقبل عقيمة.
  2. عقد بلطف ورذاذ الرأس والرقبة من الجرو الفأر مع الايثانول 70٪ وقطع رأس باستخدام مقص العقيمة حادة [الشكل 1 (1)].
  3. إجراء شق خط الوسط من الخلفية إلى الأمامية الجمجمة مع مقص صغير على طول فروة الرأس لفضح الدماغ [الشكل 1 (3/2)].
  4. قطع الجمجمة بعناية من الرقبة إلى الأنف مع مقص صغير. ثم قطع الجمجمة الأمامي إلى بصيلات الشم وأقل شأنا من المخيخ إلى فصل الجمجمة من قاعدة الجمجمة.
  5. إجراء شق صغير في قاعدة الجمجمة وقطع على طول خط الوسط. استخدام معقم ملقط غيض المسطحة لقشر بعيدا الجمجمة. إزالة جذع الدماغ بمساعدة ملقط منحنية. إزالة الدماغ من الجمجمة ووضع في طبق تشريح الأول [الشكل 1 (9/4)] (2)1.
  6. باستخدام ملقط المنحنية، والوجه الدماغ بحيث السطح البطني من الدماغ يواجه وحتى ذلك الحين فصل نصفي الكرة الأرضية مع شفرة جراحية معقمة حادة [الشكل 1 (10،11)]
  7. قم بتقشير نصفي الكرة المخية وبعناية إزالة أنسجة المخ الأوسط والمهادية انتفاخ العقيمة مع ملقط المنحنية المسطحة للكشف الحصين، لذلك، بنية صغيرة على شكل فرس البحر في الفص الصدغي وسطي [الشكل 1 (12-14)].
  8. إزالة كل الفصوص الحصين [الشكل 1 (15،16)] وتشريح بعناية السحايا من فصوص عن طريق سحب مع ملقط غرامة. هذه الخطوة يتجنب تلوث ثقافة نجمية النهائية من قبل خلايا السحائي والخلايا الليفية.
  9. نقل فصوص الحصين مستعدة في طبق الثاني مليئة HBSS وإعادته على الجليد [الشكل 1 (17،18)]. تجمع كلا الحصين فصوص من ماوس واحدة (P0 - P2) لإعداد فرس النهرالثقافات campal نجمية. وهذا يعطي كثافة نجمية المناسبة. فرم فصوص قرن آمون باستخدام شفرة جراحية معقمة حادة (حوالي 4 مرات).
  10. نضح HBSS من الطبق باستخدام طرف العقيمة تعلق على مل ماصة 1 وإضافة 3 مل من التربسين 0.25٪، مزيج، ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي العقيمة واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
  11. أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف بعناية باستخدام ماصة زجاجية معقمة تعلق على خط فراغ. إضافة 10 مل نجمية تصفيح المتوسطة ويسحن (20 - 30 مرات) باستخدام النار مصقول ماصة الزجاج حتى التجانس قطعة نسيج.
  12. أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. طاف نضح وإضافة 2 مل من وسائل الاعلام نجمية الطلاء prewarmed الطازجة. تمر الخلايا من خلال شبكة تصفية 70 ميكرون (مصفاة الخلية) إلى 50 أنبوب جديد مل المخروطية.
  13. لوحة الخلية تعليق كامل على العقيمة قارورة ثقافة T25 بولي-D-ليسين / Laminin المغلفة التي تحتوي على 3 مل منوسائل الإعلام نجمية الطلاء، ثم احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
  14. نضح وسائل الاعلام بأكمله في اليوم-ط ن المختبر (DIV) 1، DIV 3 و DIV 7، واستبدالها مع 2 مل من وسائل الاعلام نجمية طلاء جديدة. مراقبة التقدم والتقاء نجمي الخلايا تحت المجهر الضوئي في كل مرة في حين استبدال وسائل الإعلام نجمية الطلاء.
    ملاحظة: في DIV 1، يتم إرفاق جميع الخلايا النجمية قابلة للحياة على سطح القارورة ثقافة والخلايا الميتة أو التي تحتضر والتي تشمل الخلايا العصبية تطفو في طاف. في DIV 3، الخلايا تعلق تبدأ لتقسيم لتشكيل طبقة الخلايا نجمي. في غياب الظروف داعمة، والثقافة هي تقريبا خالية من أي نمو الخلايا العصبية. في DIV 7، طبقة نجمية حوالي 80-90٪ متموجة وعدد قليل من الخلايا الدبقية الصغيرة وكذلك خلايا السلائف دبقية قليلة التغصن موجودة على الجزء العلوي من طبقة نجمي.
  15. نضح المتوسطة الطلاء من القارورة، إضافة 2 مل من prewarmed نجمية تصفيح متوسطة جديدة، شطفالثانية إزالة مرة أخرى في DIV 11، عندما الخلايا النجمية هي متكدسة وجاهزة للزراعة الباطن.
  16. إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين، وتناوب بلطف القارورة عدة مرات ونضح التربسين باستخدام الماصة زجاجية معقمة.
  17. إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين والسماح للقارورة الجلوس في نسيج الثقافة هود ل4-5 دقيقة في RT.
  18. إزالة التربسين والحفاظ على قارورة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 10 دقيقة. إضافة 5 مل prewarmed نجمية تصفيح المتوسطة وفصل طبقة نجمي من خلال الاستفادة من قارورة ضد كف يدك (3-4 مرات) تليها سحن لطيف لتحقيق حياد تام وجمع الخلايا النجمية في أنبوب مخروطي 15 مل.
  19. أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، نضح طاف، وإضافة 1 مل نجمية جديدة الطلاء المتوسطة.
  20. إضافة 10 ميكرولتر من خلية إلى تعليق عدادة الكريات وعدد الخلايا في كبيرة في منطقة الشبكية المركزية (1 ملم 2) باستخدام النقيض المجهر المرحلة مقلوب (الهدف 10X). مولtiply بنسبة 10 4 لتقدير عدد الخلايا لكل مليلتر. وسيكون أحد قارورة T25 تسفر ~ 1 × 10 6 المجموع فصل الخلايا. البذور ~ 1 × 10 5 الخلايا في 2 مل نجمية تصفيح المتوسطة على 12 مم بولي-D-ليسين ساترة الزجاج المكسوة مسبقا والمحمولة في بئر طبق ثقافة 24-جيدا.
  21. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. أداء OGD / REOX في DIV 12-14 (القسم 2).
  22. علاج الثقافات نجمية في DIV 3 مع 5 ملي الميثيل استر (LME) هيدروكلوريد-L يسين حتى DIV 11 إذا رغبت الثقافات الحصين خالية من الخلايا الدبقية الصغيرة. بعد LME حضانة والثقافات خاضعة للاهتزاز (300 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة) لإزالة تلويث الخلايا الدبقية الصغيرة.
    ملاحظة: LME هو وكيل السامة للخلايا دبقية التي استخدمت على نطاق واسع كوسيلة للقضاء على تكاثر الخلايا الدبقية الصغيرة 22.

2. OGD / REOX العلاج

  1. وسائل الإعلام نضح من ساترة تحتوي على ثقافة نجمية ملتصقة (DIV 12-14)، وشطف 3 مراتبواسطة بلطف الدورية للطبق ثقافة 24-جيدا عقد ساترة بضع مرات مع 1 مل من محلول متساوي التوتر OGD (7.4 درجة الحموضة) تحتوي على (مم): 0 الجلوكوز، 21 NaHCO 3، 120 كلوريد الصوديوم، 5.36 بوكل، 0.33 نا 2 هبو 4، 0.44 KH 2 PO 4، 1.27 CaCl 2، و 0.81 MgSO 4.
  2. إضافة 0.2 مل من محلول OGD إلى جانب لتغطية ساترة واحتضان لمدة 2 ساعة في حاضنة نقص الأوكسجين التي تحتوي على 94٪ N 2، 1٪ O 2 و 5٪ CO 2. المزيج بلطف مع شاكر المداري (50 دورة في الدقيقة) ل30 دقيقة الأولى من نقص الأكسجين لتسهيل تبادل الغازات.
  3. احتضان الخلايا السيطرة normoxic لمدة 2 ساعة في 5٪ CO 2 والهواء الجوي في منطقة عازلة متطابقة إلى حل OGD باستثناء إضافة 5.5 ملي الجلوكوز.
  4. لREOX، نضح الحل OGD وإضافة 2 مل من نجمية تصفيح المتوسطة. احتضان في 5٪ CO 2 و الهواء في الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات.

3. Immunocytochemical تلطيخ

  1. نضح في وسائل الإعلام الثقافة باستخدام ماصة زجاجية معقمة تعلق على خط فراغ وبسرعة شطف ساترة مرة واحدة عن طريق إضافة من 1mL 0.1 M تريس مخزنة المالحة (TBS) (154 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 16 ملي Trizma قاعدة، 84 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4) إلى البئر. نضح وإضافة 2 مل من 4٪ لامتصاص العرق (PFA) في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  2. نضح وإضافة 1 مل من 0.1 M TBS، ثم وضع على شاكر هزاز لمدة 2 دقيقة. كرر 3 مرات. إضافة 1 مل عرقلة الحل (10٪ مصل الماعز، و 10 ملغ / مل BSA، 0.025٪ تريتون X-100 في 0.1 M TBS)، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر هزاز.
  3. نضح عرقلة الحل وإضافة الأولية وحيدة النسيلة الماوس GFAP مكافحة الأجسام المضادة (0.2 مل من التخفيف 1: 500 في عرقلة الحل) وبولكلونل الأرنب مكافحة S100B (1: 500) أو بولكلونل الأرنب مكافحة HIF1α (1: 200) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر هزاز.
  4. بدلا من ذلك، يتم تحضين بعض الخلايا النجمية مع الأرنب بولكلونل مكافحة IBA1 (1: 200) ومون الماوسoclonal مكافحة MAP2 للوصول إلى نقاء الثقافة.
  5. نضح الأجسام المضادة الأولية وشطف ساترة عن طريق إضافة 1 مل من 0.1 M TBS ووضع على شاكر هزاز لمدة 2 دقيقة ثم نضح. كرر مرتين.
  6. إضافة 0.2 مل من 1: 200 التخفيف من الماعز الثانوية المضادة للأرنب الأجسام المضادة 568 مترافق 488 مترافق ومكافحة فأر في عرقلة الحل لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر هزاز.
  7. نضح الضد الثانوية وشطف ساترة عن طريق إضافة 1 مل من 0.1 M TBS ومكان على شاكر هزاز لمدة 2 دقيقة ثم نضح. كرر مرتين.
  8. إزالة ساترة من جانب والجافة عن طريق وضع على شريحة وضعه على شريحة جفافا. جبل ساترة على شريحة جديدة من قلب على قطرة واحدة من VECTASHIELD hardset المتوسطة المتزايدة مع دابي (1.5 نانوغرام / ميكرولتر).
  9. coverslips الصورة على المجهر متحد البؤر باستخدام 20X الجافة أو 60X الهدف النفط. الحصول على صور (512 × 512) لدابي (405 نانومتر السابق / 450 نانومتر م) وتألقي 488 الموسومة GFAP الضد (488 نانومتر السابق / 515 نانومترم). الحفاظ المعلمات الاستحواذ ثابتة داخل 20X 60X والجماعات.

4. تحديد الجنس عن طريق PCR

  1. حرارة الجرو أخمص القدمين أو قصاصات بأصابع الاتهام إلى 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم وتحييد مع حجم مساو من 1 M تريس، ودرجة الحموضة 6.8.
  2. إضافة 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي المستخرج إلى 19 ميكرولتر من الخليط التالي: 5 pmoles الاشعال للجينات Myog وجمهورية يوغوسلافيا، رد فعل العازلة 1X، 0.2 ملي كل deoxynucleotide و 8 U طق البلمرة.
  3. استخدام التمهيدي متواليات. جمهورية يوغوسلافيا 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3، 5'CATGACCACCACCACCACCAA3 "وMyog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3، 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3" 23.
  4. أداء بروتوكول PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ثم 30 دورات تمسخ في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، الصلب في 58 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، واستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. وبعد هذا 30 دورات، ويخلص التفاعل مع وجود النهائية 72 درجة مئوية استطالة لمدة 1 دقيقة.
  5. كمبيوتر منفصلمنتجات R electrophoretically على هلام الاغاروز 2٪ إيثيديوم بروميد التي تحتوي على وتصور تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية. (الشكل 2A). تنبيه! إيثيديوم بروميد هو مادة مسرطنة محتملة ويجب التعامل معه بحرص شديد والتخلص منها بشكل صحيح وفقا للوائح المؤسسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

فهم الأدوار وظائف نجمية بالغت في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية تم توضيحها بشكل كبير عن طريق زراعة هذه الخلايا في ظل ظروف في المختبر. على جانب هام من جوانب أداء زراعة بالغت هو تحديد جنس الجرو الماوس قبل استخدامه. نحن مصممون جنس الفأر وراثيا بواسطة PCR وتقييم البصرية (الشكل 2) 16. اعتمد منهجية تحديد الجنس باستخدام PCR مع بعض التعديلات من McClive وسنكلير، سريعة وبسيطة، واستنساخه للغاية طريقة 23.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من أجل دراسة الفروق بين الجنسين في خصائص وظيفة الخلايا النجمية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية، وإعداد الخلايا النجمية الأولية بالغت في زراعة الخلايا هو أداة هامة في الاستفادة منها. في هذه الدراسة فإننا الإبلاغ عن كفاءة عالية وأسلوب استنساخه للثقافة التخصيب السكان متجانسة من الخلايا النجمية الحصين بالغت من الأطفال حديثي الولادة (P0-P2) C57BL / 6 (النوع البري) أو K19F (GFAP فارغة) الجراء الماوس في المختبر. إنشاء هذه المنهجية يساعد المحققين فهم الوظائف الفسيولوجية والمرضي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا شيء المؤلفين وتتنافس أو المصالح المتضاربة.

شكر وتقدير

برنامج جائزة العلوم السريرية والانتقالية ل NCATS UL1 TR0000427 و KL2 TR000428 (Cengiz P) ، UL1TR000427 إلى UW ICTR من المعاهد الوطنية للصحة / NCATS والأموال من مركز Waisman (Cengiz P) ، K08 NS088563-01A1 من NINDS (Cengiz P) و NIH P30 HD03352 (مركز Waisman) ، NIH / NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). نود أن نشكر ألبي ميسينج ، دكتوراه ، لتزويدنا بالفئران بالضربة القاضية GFAP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >< > Astrocyte culture media< / em >< / strong>
DMEM ، ارتفاع نسبة الجلوكوزcellgro10-013-CV
مصل الحصانGibco26050-070التركيز النهائي: 10٪
البنسلين - الستربتومايسينCellgro   ؛30-002-CIالتركيز النهائي: 1٪
L-Leucine ميثيل إستر هيدروكلوريدAldrichL1002-25Gالتركيز النهائي: 5 mM
< قوي >< > محلول لهضم أنسجة المخ < / em >< / strong>
HBSSLife Technologies14170-088
Trypsincellgro25-050-CIالتركيز النهائي: 0.25٪
<قوي>أخرى
70٪ (vol/vol) الإيثانولروث9065.2
بولي د-ليسين (PDL) 12 مم أغطية مستديرة Corning354087
WaterSigmaW3500درجة زراعة الخلايا
PBScellgro21-040-CVدرجة زراعة الخلايا
0.05٪ Trypsin-EDTA   ؛لايف تكنولوجيز25300-062
70 & م مصفاة الخلايا المعقمة 22363548علمي
3.5 سم صحن بتريBDفالكون 353001
15 مل أنبوب فالكونBD فالكون352096
50 مل أنبوب فالكونBD Falcon352070
ملقط ، ناعم  Dumont2-1032 ؛ 2-1033# 3c ؛ # 5
ملقط ، طرف مسطحKLS Martin12-120-11
مقص جراحي 13 سمAesculapBC-140-R
مجهر متحد البؤرنيكونA1RSi  ؛
جهاز طرد مركزيEppendorf5805000.0175804R
شاكر مداريحراري علميSHKE 4450-1CEMaxQ 4450   ؛
Anti-IBA1واكو019-19741أرنب أحادي النسيلة
مضاد ل MAP2SigmaM2320ماوس أحادي النسيلة
مضاد ل HIF1alphaabcamab179483أرنب أحادي النسيلة
مضاد ل S100BسيجماHPA015768أرنب متعدد النسيلة
مضاد ل GFAP (كوكتيل)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (أرنب IgG)Vector LabsPK-6101يحتوي على 4 كواشف   ;
الماعز المضاد للأرانب Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
الماعز المضاد للفأر Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004
فيشر

المراجع

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294(2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282(2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFAP S100B

مقالات ذات صلة