والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف loss- وكسب من طريقة وظيفة التي تنطبق على تحديد neogenin بمثابة مستقبلات مرحلة معينة أن يؤدي إلى الأديم الظاهر الغاذي والخلايا الداخلية التمايز الشامل في الأجنة قبل الغرس الماوس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد تقنيات إسكات الجينات والإفراط في التعبير عنها مفيدة في تحديد الجينات المشاركة في التطور الجنيني. يوفر التعديل الجيني المستهدف المباشر في أجنة ما قبل الزرع وسيلة لدراسة الآليات الأساسية للجينات المتورطة ، على سبيل المثال ، في التمايز الخلوي في الأديم الغاذي (TE) وكتلة الخلية الداخلية (ICM). هنا ، نصف بروتوكولا يفحص دور النيوجينين كمستقبل أصيل لتحديد مصير الخلية الأولي في أجنة الفئران قبل الزرع. أولا ، نناقش التلاعبات التجريبية التي تم استخدامها لإنتاج اكتساب وفقدان وظيفة النيوجينين عن طريق الحقن الدقيق للنيوجينين (كدنا) و shRNA. تم تأكيد فعالية هذا النهج من خلال وجود علاقة قوية بين مستويات التعبير الزوجي إما للبروتين الفلوري الأحمر (RFP) أو البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والتقدير الكمي الكيميائي المناعي لتعبير النيوجينين. ثانيا ، يؤدي الإفراط في التعبير عن النيوجينين في أجنة الفئران قبل الزرع إلى تطور ICM الطبيعي بينما تتسبب ضربة قاضية من النيوجينين في تطور ICM بشكل غير طبيعي ، مما يعني أن النيوجينين يمكن أن يكون مستقبلا ينقل إشارات خارج الخلية لدفع الأريمات إلى مصائر الخلايا المبكرة. نظرا لنجاح هذا البروتوكول التفصيلي في التحقيق في وظيفة مستقبلات جديدة خاصة بمرحلة النمو الجنينية ، نقترح أن لديه القدرة على المساعدة في استكشاف وتحديد الجينات الأخرى الخاصة بالمرحلة أثناء التطور الجنيني.
المقدمة
سابق للانغراس التطور الجنيني يمكن تقسيمها إلى عدة مراحل متميزة، من مرحلة خلية واحدة إلى تويتة والكيسة. وتشير أدلة كثيرة على أن الاستقطاب والعظة الموضعية تلعب دورا في أوائل تقرير مصير الخلية إلى الأديم الظاهر الغاذي (TE) وكتلة الخلايا الداخلية (ICM). ومع ذلك، فإن طبيعة العظة، وكيف transduced أنها في الإشارات الخلوية، والسياقات الفسيولوجية التي يمكن لهذه الإشارات هي قادرة على الشروع في خلية النسب التمايز ليست معروفة. هذه الخلايا المتمايزة ثم الخضوع التخصص، بدأت تأخذ على هياكل مميزة والوظائف اللازمة للجنين تشكيل السليم ونمو المشيمة 1-3.
الأجنة ما قبل ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات اللازمة لتربية الحيوانات وهموم وفقا للوائح IACUC جامعة Sahmyook، سيول، كوريا الجنوبية.
1. فرط الإباضة، تربية وعزل قناة البيض
- الحفاظ الفطرية C57BL / 6 الفئران وفقا للشروط التالية: 22 ± 3 درجة مئوية، ~ 60٪ الرطوبة 12 ساعة ضوء / دورة الظلام، والماء والغذاء الإرضاع بحسب الرغبة.
- حمل فرط الإباضة من إناث الفئران القديم أسابيع 3-5 عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5 وحدة دولية فرس الحامل موجهة الغدد التناسلية المصل (PMSG) ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
اكتشفنا وأعرب عن أن neogenin عابر خلال مراحل النمو المبكرة للأجنة قبل الغرس الماوس، والتي تظهر في وقت مبكر في مرحلة 2-الخلية وتستمر لحين تويتة في وقت مبكر ولكن أن تصبح ناقصة في أواخر تويتة ومراحل الكيسة الأريمية (الشكل 2A). وبالإضافة إلى ذلك، اقتصر التوزيع المكاني للneogenin أساسا إلى خارج الخلايا. وكانت نتائج تحليل RT-PCR تتناسب مع طبيعة المبكرة وعابرة التعبير neogenin، وتبلغ ذروتها في مرحلة 4 خلايا ولكنها تفتقر تماما في المرحلة 1.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول، ونحن لشرح أساليب جديدة للMicroinjection من المواد الجينية، إما كدنا] أو shRNA، إلى الأجنة 2-PN الماوس لاستكشاف دور neogenin في تمايز الخلايا في وقت مبكر خلال مرحلة التطور الجنيني الماوس. التعديل الوراثي للأجنة قبل الغرس هي تقنية قوية في الكشف عن المعلومات الأساسية عن الآليات الكامنة الجزيئية ل، على سبيل المثال، أول تقرير خلية النسب. التعديل الوراثي هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا للتحقق من وظيفة الجين. مع استقبالية كبيرة نسبيا من الأجنة 2-PN للمواد الوراثية الأجنبي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة في الكشف عنها.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أيضا أن نعترف مجموعة الدكتور شيونغ في جامعة العلوم الصحية جورجيا لتصنيع وتقاسم البنى لneogenin كدنا] وshRNA ناقلات. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من برنامج العلوم الاساسية بحوث (2013R1A1A4A01012572) بتمويل من مؤسسة أبحاث الكورية ومنحة بحثية من جامعة Sahmyook.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| M16 | متوسط,Gibco BRL (جراند آيلاند, نيويورك) | M7292 LOT# 11A832 | |
| مصل الماعز, | داكو (Glostrup ، الدنمارك) | X0907 | |
| PMSG | Folligon ، Intervet ، هولندا | G4877-1000IU LOT # SLBD0719V | |
| الزيوت المعدنية | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT # SLBC6783V | |
| الغدد التناسلية المشيمية البشرية وموجهة الغدد التناسلية للفرس الحامل ؛ | (Intervet ، هولندا) | (invitrogen ، 15596-026) | |
| SuperScript & reg ؛ III تقنيات حياة النسخ العكسي | 18080-044 | ||
| خليط ما قبل PCR | ( بيونير ، دايجون ، كوريا الجنوبية) | GenDEPOT ، A0224-050 | |
| Agarose (درجة جزيئية) | BioRad | 161-3101 | |
| محلول بارافورمالديهايد ، 4٪ في PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| أجسام مضادة للأرانب متعددة النسيلة مضادة للنيوجينين | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، الولايات المتحدة | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 المسمى الأجسام المضادة للأرانب | المجسات الجزيئية (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 المسمى الأجسام المضادة للأرانب | المجسات الجزيئية (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) | A-21428 | |
| Alexa Fluor & Reg ؛ 555 | مجسات جزيئية من الفالودين (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) | A34055 | |
| DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد) | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | D1306 | |
| المؤتلف البشري RGM-C / Hemojuvelin | R &;D أنظمة | 3720-RG | |
| جميع تركيبات البلازميد | البروفيسور ون تشنغ شيونغ في جامعة جورجيا للعلوم الصحية (أغوستا ، جورجيا). | للدراسات الحالية تم توفيرها من قبل | |
| نيون & ريج; نظام التعدي | lifetech | MPK10096 | |
| ستيريو ميكروسكورف | نيكون | SMZ1000 | |
| نظام Micromainpulation مع نيكون | نيكون Narishige ONM-1 | ||
| حاقن دقيق | نيكون Narishige | GASTIGHT # 1750 | |
| حامل | نيكون Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | نيكون Narishige | Narishige MF-900 | |
| طاحونة | Narishige | EG400 | |
| مجتذب | Sutter Instrumnet شركة | P-97 | |
| CO2< / sub> حاضنة | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti & reg ؛ 384-Well Thermal Cycler | 4388444 | Lifetechnologies |
المراجع
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
