هنا نقدم الرواية كا 2+ -imaging النهج باستخدام مراسل إضاءة الحيوية. يستخدم هذا النهج تنصهر بناء GFP-aequorin الذي يربط الكالسيوم 2+ وتنبعث الضوء، مما يلغي الحاجة لالإثارة الخفيفة. كبير يسمح هذا الأسلوب التصوير المستمر الطويل، والوصول إلى هياكل الدماغ العميقة وقرار زمنية عالية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وظيفية في مجال التصوير فيفو أصبح نهجا قويا لدراسة وظيفة وعلم وظائف الأعضاء من خلايا المخ وهياكل الفائدة. في الآونة الأخيرة تم تطوير طريقة جديدة لكا 2+ -imaging باستخدام مراسل إضاءة الحيوية GFP-aequorin (GA). وتعتمد هذه التقنية الجديدة على التحام GFP وaequorin الجينات، مما ينتج عنه قادرة جزيء من الكالسيوم ملزمة و- مع إضافة coelenterazine العامل المساعد ل- انبعاث الضوء الساطع التي يمكن رصدها من خلال جمع الفوتون. تم إنشاء خطوط المعدلة وراثيا تحمل جينات GFP aequorin لكل من الفئران وذبابة الفاكهة. في ذبابة الفاكهة، فقد تم وضع الجينات GFP aequorin تحت سيطرة نظام ثنائي التعبير GAL4 / UAS السماح للتعبير استهدافا والتصوير داخل الدماغ. وفيما بعد تبين أن هذه الطريقة لتكون قادرة على الكشف عن كل من الداخل كا 2+ -transients والكالسيوم 2+ -released من مخازن الداخلية. الأهم من ذلك أنها تتيح لمدة أكبر في تسجيل مستمر، والتصوير في أعماق أكبر في الدماغ، وتسجيلها في قرارات الزمنية عالية (تصل إلى 8.3 مللي ثانية). هنا نقدم الطريقة الأساسية لاستخدام التصوير إضاءة الحيوية لتسجيل وتحليل الكالسيوم 2+ -activity داخل الهيئات الفطر، هيكل مركزي في التعلم والذاكرة في الدماغ الطاير.
المقدمة
وكانت الزخرفة وظيفة من النشاط في الدماغ وهياكلها الأساسية منفصلة فترة طويلة مجال الدراسة المكثفة في مجال علم الأعصاب. ربما بعض من أقرب النهج الناجحة المستخدمة لمعالجة هذه المسألة كان القياس الفسيولوجي المباشر للتغيير في النشاط الكهربائي - طرق لكن البديلة التي تسمح التصوير الحي للتغيرات في تركيز الجهد، ودرجة الحموضة أو الكالسيوم (كبديل للنشاط) قد جلبت قدرات إضافية ل دراسة نشاط الخلايا العصبية 1. تقنيات التصوير تحمل مجموعة واسعة من المزايا مثل انخفاض الغازية والقدرة على رصد النشاط داخل هياكل الدماغ كله. وعلاوة على ذلك في الحيوانات مع علم الوراثة الانقياد بما في ذلك ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة، وضع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا، مثل CAMELEON، GCaMPs وغيرها 1 قد يسمح للباحثين لرصد الخلايا العصبية واحدة، السكان العصبية والدماغ كلهالهياكل. في حين أن أكثر أساليب التصوير الكالسيوم الفلورسنت التقليدية باستخدام GCaMPs (GFP تنصهر إلى كالمودولين) أو الحنق (CFP وYFP تنصهر كالمودولين) وقد ثبت أن تقنيات مفيدة توفير القرار المكانية والزمانية جيدة، وعملية الكامنة وراء الإثارة الخفيفة تولد بعض القيود على ه التجريبية التطبيقات. ونظرا لطبيعة الإثارة الخفيفة، تألق ذاتي، صور تبيض والضيائية تنتج حتما، مما يحد بالتالي عمق الهياكل التي يمكن تصويرها، ومدة التسجيلات فضلا عن الاستمرارية في الوقت الحقيقي من التسجيل. وبعبارة أخرى، يجب في كثير من الأحيان أن يؤديها التسجيلات بشكل متقطع لتجنب هذه الآثار الجانبية غير المرغوب فيها.
وبسبب هذه التحديات، وقد وضعت وسائل بديلة إضافية من التصوير الكالسيوم. إحدى الطرق الواعدة هو التصوير إضاءة الحيوية التي تعتمد على الضوء المنتجة من خلال رد فعل الأنزيمي بعد الكالسيوم ملزمة. Bioluminescenلا يتطلب تي التصوير الإثارة الخفيفة وبالتالي لا تواجه نفس الصعوبات التي والتصوير الكالسيوم التقليدية. مراسل إضاءة الحيوية Aequorin - معزولة عن Aequorea فيكتوريا، ونفس قنديل البحر الذي GFP كان isolated- أيضا يتحد الكالسيوم عن طريق الهياكل يدها ثلاثة EF ويخضع لتغيير متعلق بتكوين، مما يؤدي إلى أكسدة coelenterazine العامل المساعد والإفراج عن الضوء الأزرق (λ = 469 نانومتر) 2،3. Aequorin لها قابلية منخفضة جدا من الكالسيوم (K د = 10 ميكرومتر) مما يجعلها مثالية لمراقبة العابرين الكالسيوم لأنها تنتج الضوضاء في الخلفية قليلا جدا ولا تتداخل مع نظام التخزين المؤقت الكالسيوم داخل الخلايا 4. على الرغم من aequorin تم استخدامها سابقا لمراقبة عملية تحريض العصبي في البيض القيطم 5 ضوء المنتجة خافت جدا لاستخدامها في التصوير في الوقت الحقيقي من نشاط الخلايا العصبية. في محاولة للتصدي لهذا التحدي، فيليب تص &# 251؛ ولوزملاؤه في معهد باستور خلق بناء الوراثي التفجير GFP وaequorin الجينات، ومحاكاة للدولة الأم داخل قناديل البحر 4. هذا المنتج الانصهار الجين يرتبط الكالسيوم مرة أخرى عن طريق الهياكل جهة EF ثلاثة من aequorin، التي تخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين يؤدي إلى أكسدة coelenterazine، الذي ينقل الطاقة غير إشعاعيا إلى GFP. هذه النتائج نقل الطاقة في الإفراج عن الضوء الأخضر (λ = 509 نانومتر) من GFP، بدلا من الضوء الأزرق من aequorin. اندماج GFP وaequorin أيضا يمنح قدر أكبر من الاستقرار البروتين يساعد على إنتاج ضوء انصهار بروتين 19-65 مرات أكثر إشراقا من aequorin وحده (4). باستخدام نهج إضاءة الحيوية داخل المخ يوسع تطبيق التجريبي الحالي من التصوير الكالسيوم سواء من حيث مدة التسجيل المتواصل وعدد من الهياكل في الدماغ التي يمكن تسجيلها. على نطاق واسع في سياق العمل السابق وهو ما يعني أن على الصعيدين العالمي وأكبريمكن رصد مجموعة متنوعة من إقليمي "النشاط" في الدماغ (من خلال وكيل العابرين الكالسيوم). الأهم من النشاط يمكن رصدها لفترة أطول، في الوقت الحقيقي، وبصورة مستمرة، وهو يفسح المجال بسهولة إلى السعي لتحقيق فهم كامل وظيفة القاعدية في الدماغ.
في السنوات القليلة الماضية، لدينا مختبر وغيرها قد وضعت الذباب المعدلة وراثيا معربا عن GFP-aequorin تحت سيطرة نظام ثنائي التعبير (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5،6. وقد استخدمنا-GFP aequorin تلألؤ بيولوجي لتسجيل النشاط التي تنتجها المحفزات الطبيعية مثل رائحة 7،8، وكذلك دراسة المكونات الخلوية تحوير الكالسيوم 2+ -activity في الهيئات الفطر التالية مستقبلات الأستيل كولين التحفيز عن طريق تطبيق النيكوتينيك المباشر 9. بالإضافة إلى ذلك، فقد استخدمنا أيضا GFP-aequorin لمعالجة عدد من الأسئلة التجريبية التي لم تكن قادرة على معالجتها سابقا، مثل طويل الأجلالتصوير العابرين الكالسيوم عفوية والتصور من هياكل الدماغ أكثر عمقا 10. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمنا النظام / UAS GAL4 للتعبير عن ATP مستقبلات الثدييات P2X 2 11 قناة الموجبة، في الخلايا العصبية الإسقاط (السندات الإذنية) واستخدام نظام LexA للتعبير عن GFP-aequorin في الهيئات الفطر (MB247-LexA، 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (مجاملة من B. فايفر، Janelia مزرعة، الولايات المتحدة الأمريكية). وقد أتاح ذلك لنا لتفعيل السندات الإذنية من خلال تطبيق ATP، والذي بدوره ينشط الهيئات الفطر (هدف المصب من السندات الإذنية)، ومحاكاة أكثر الظروف الطبيعية، مثل استجابة لحافز الرائحة. عموما هذا الأسلوب يجمع بين P2X 2 و GFP-aequorin توسع الاحتمالات التجريبية. على نطاق واسع لأنه يتيح الفرصة لفهم أفضل لأنماط النشاط في المخ، وبدء دراسات جديدة حول كيفية المحفزات واضطرابات مختلفة يمكن أن يغير من الزخرفة القاعدية من النشاط.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد العينات
- إعداد الحلول وإعداد
- الحفاظ على جميع خطوط البطن ذبابة الفاكهة في 24 ° C على معيار المتوسطة الطعام. الخلفية والاحتفاظ بها في منخفض الكثافة في القارورة لتوليد حجم موحد والوزن من الذباب.
- إضافة 10 الإناث البكر مع 10 ذكور في قارورة، والسماح لهم التزاوج ونقل لهم كل أيام 2 إلى قارورة جديدة. ثم في وقت لاحق 10 يوما، عندما تبدأ الذباب لeclose، حصاد الذباب كل يوم. الاحتفاظ بسجل دقيق لعمر الذباب والاحتفاظ بها في حالة جيدة.
- في يوم 3، فصل الذكور عن الإناث والحفاظ على الإناث 20 الذباب في قارورة. تسجيل الذباب في 4 أو 5 أيام من العمر.
- يعد حل قارع الأجراس مع التركيزات التالية: 130 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 2 مم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي HEPES، و 36 ملي السكروز وضبط درجة الحموضة من الحل لبدقة 7.3. تحضير محاليل الإرواء من 25 μ؛ M النيكوتين و 100 ملي بوكل في حل رينغر.
- إعداد 1000 ميكرولتر طرف ماصة: باستخدام شكل رأس شفرة حلاقة لوجهة نظر (حوالي 35 درجة من نهاية طرف) وإزالة قاعدة فائضة تتجاوز 1 ½ سم من الحافة.
- مربع لتخزين (23 سم × 17 سم × 8.5 سم) من عينة تحضير أثناء الحضانة. وضع اثنين من الإسفنج (12 سم × 8 سم × 3 سم) المشبعة بالماء في أسفل [لمنع جفاف العينة] تحت جهاز رف صغير لوضع العينات على النحو اكتمال إعدادها.
- إعداد الذباب عينات بحيث أنها تحتوي على ما لا يقل عن 1 نسخة من UAS-GFP-aequorin ونسخة واحدة من خط GAL4 لدفع التعبير عن GFP-aequorin. وعبرت خط OK107 GAL4 (خط القيادة التعبير في المقام الأول في الهيئات الفطر) مع UAS-GFP-aequorin في هذا الإعداد.
ملاحظة: يجب أن تكون داخل علبة من ماء والخارج ويجب أن تمنع الضوء من الدخول مربع لمنع تدهور coelenterazine أثناء الحضانة.
- الحفاظ على جميع خطوط البطن ذبابة الفاكهة في 24 ° C على معيار المتوسطة الطعام. الخلفية والاحتفاظ بها في منخفض الكثافة في القارورة لتوليد حجم موحد والوزن من الذباب.
- الإعداديةaration العينات
- كريم تخدير ذبابة الفاكهة قبل نقله إلى قارورة زجاجية والحفاظ على الجليد لمدة 2 دقيقة قبل نقله إلى طبق بيتري المبردة لتحديد المواقع في الطرف ماصة. إعداد نصائح ماصة على ورق الترشيح رطب قليلا في 100 مل طبق بيتري على الجليد تحت المجهر تشريح.
- بلطف مع ملقط مكان يطير داخل ماصة.
- باستخدام فرشاة دفع ومواءمة يطير مثل أن الرأس هو تماما الماضي حافة الحافة وتتعرض جزئيا في المنطقة الظهرية من قبل قسم إزالتها خلال غيض تشكيل (الشكل 2B) بلطف.
- الجمع بين صغيرة (حوالي 3-4 ميكرولتر) أجزاء من عنصرين من الغراء الأسنان. تطبيق الغراء بعناية في جميع أنحاء الأمامي والخلفي الرأس والرقبة وصولا الى وحول حافة طرف الماصة - تجنب تاج الرأس. اسمحوا الغراء جافة لمدة 2 دقيقة.
- مكان ماصة مع ذبابة اصق من خلال ثقب في تسجيل غرفة (الشكل 2D) وجنرالاضغط TLY لتأمين في المكان.
- الجمع بين عنصرين من الغراء السيليكون (حوالي 3-4 ميكرولتر). تطبيق الغراء على الجانب المسطح من الغرفة على طول الحافة حيث الغرفة وماصة لقاء لمنع تسرب محلول رينغر. اسمحوا الغراء جافة لمدة 2 دقيقة.
- تشريح
- يلصق الشريط عبر قناة نضح، حافة قصيرة وتمتد إلى الجزء الخلفي من الغرفة.
- وضع الغرفة مع ذبابة على كتلة تشريح تحت المجهر بدوره على مصباح الفلورسنت. الماصة 1 مل من محلول رينغر في الغرفة.
- استخدام سكين جراحية غرامة لإزالة بشرة. جعل شقوق متوازية من الجزء الخلفي من الرأس إلى المنطقة antennal. ثم قص على طول حافة العين ثم إجراء شق عمودي فوق هوائي يربط بين الشقوق السابقة. جعل مواز شق النهائي لأنه في الجزء الخلفي من الرأس. استخدام الملقط حادة غرامة لإزالة إهاب (الشكل 2C).
- استخدام الملقط حادة غرامة لفهم بلطف لد اضحة بعيدا تتعرض أنسجة الجهاز التنفسي حتى يتم تصور الدماغ و[الاستشعاع] الجسم الفطر بشكل واضح.
- استخدام الملقط حادة جدا لفهم بعناية وقرصة الأنسجة الظهارية العصبية التي تغطي الدماغ للسماح للنفاذ من coelenterazine.
ملاحظة: بدلا من ذلك غراء يمكن استخدامها لpermeabilize وneuroepithelia 9. - باستخدام الماصة، تغسل مرتين مع حل رينغر لإزالة أي حطام من تشريح وعينة مكان في المربع المظلم.
- الماصة 1 مل من محلول رينغر تحتوي على 5 ميكرومتر البنزيل-coelenterazine في الغرفة. إغلاق مربع والسماح الحضانة مع coelenterazine في RT مدة لا تقل عن 2 ساعة.
2. التصوير
- التثبيت
- بدء نظام تسجيل: بدوره على المجهر، والكمبيوتر، وكاميرا ونظام الصرف الصحي وتعيين غرفة الضوابط البيئية إلى 25 ° C.
- مفتوحة القياس وبرنامج أتمتة Explorer على جهاز الكمبيوتر. اضغط على “؛ أجهزة واجهات "، ثم انقر مرتين على" NI أجهزة الحركة "وأخيرا انقر بزر الماوس الأيمن فوق" PCI-7334 "وحدد" تهيئة الجهاز ".
- فتح فوتون تصوير. إنشاء مجلد جديد واسم أول ملف التسجيل. الكاميرا يجب أن تصل إلى -80 درجة مئوية قبل النظام سوف يعمل.
- إعداد نظام نضح - إضافة بوكل، النيكوتين، وحل قارع الأجراس في الخزانات وضبط ذلك كل التصريف حل في 2 مل / دقيقة. تغسل بمحلول رينغر قبل بدء التجربة.
- تحضير عينة
- مكان التصوير جبل طبق كتلة على جبل تحت المجهر في التكبير 5X وإدراج أنبوب نضح في القناة من خلال ثقب.
- تعيين المجهر لوضع الفلورسنت ثم مركز وجلب الهيئات الفطر (ميجا) إلى التركيز. التكيف مع 20X وإعادة الوسط والتركيز.
- أجهزة الصرف موقف على بركة الصرف الصحي، وضبط ارتفاع تحويلة الصرف بحيث غيض هو اعلاه فقطتجمع الإلكترونية، وتشغيل حل رينغر لمدة 30 ثانية لضمان الصرف الملائم.
- هدم درع لاغلاق الجهاز بعيدا عن الضوء. استخدام النظام الآلي في الفوتون تصوير إجراء تعديلات غرامة على التركيز والتقاط صورة الفلورسنت مرجع ميجا.
- تسجيل
- ضبط سرعة الفوتون إلى المطلوب سرعة تسجيل (من 50 ميللي ثانية حتى 1 ثانية أو أكثر). اختر وضع الفوتون ومصراع مفتوحة. سجل الوراثي، والجنس، والعمر، وعدد العينة في إدخالات السجل. ضبط صناديق موقف ROI على الكأس والهيئات الخلية (بنك) والفصوص وسطي بالضغط على صناديق العائد على الاستثمار وسحب في حين عقد السيطرة.
- خط الأساس القياسي لحوالي 5 إلى 10 دقيقة (حسب الرغبة).
- تطبيق النيكوتين لمدة 1 دقيقة. ملاحظة بدء / إيقاف في السجل. تغسل بمحلول رينغر لمدة 5 دقائق.
- الانتظار 5 دقائق لتحقيق الانتعاش وإعداد بوكل إدخال سجل وتوقيت.
- تطبيق بوكل لمدة 1 دقيقة. ملاحظة بدء / إيقاف في السجل. تغسل بمحلول رينغر لمدة 1 دقيقة.
- تحولإلى وضع الفلورسنت، تأخذ صورة الفلورسنت النهائية، وإيقاف حل رينغر.
- اضغط على "إيقاف". سوف مربع حوار يسأل لاغلاق النظام. حدد "لا" لمتابعة التسجيل.
- فتح الدرع، ونظام الصرف الصحي الخطوة، والتبديل الهدف العدسة ل5X، وإزالة أنبوب نضح. إزالة عينة / تسجيل طبق من مرحلة، تنظيف قبالة عدسة 20X قبل الشطف ومسح عدسة مرتين بالماء.
- اضغط على زر التشغيل الأبيض في الجزء العلوي من نافذة البرنامج لبدء تسجيل المقبل.
3. تحليل والإبداع فيديو
- استخراج القيم الفوتون
- فتح برنامج تحليل الفوتون (على سبيل المثال، فوتون عارض) وملف جدول بيانات العينة الأولى مفتوحة.
- حدد علامة التبويب التحكم بالعرض. تحديد العائد على الاستثمار من خلال النقر على المنطقة في حين عقد السيطرة. ضبط حجم والتوجيه وشكل المناطق ذات الاهتمام ليشمل GFP مضيئة بنك التعمير الصينى والفصوص وسطي.
- إضافة إلى ذلكآل ROI بالنقر على "تحديد العائد على الاستثمار"، والنقر والسحب على الشاشة لإنشاء ROI الجديد.
- حدد "فيلم" علامة التبويب للعب الفوتون الفيديو. ضبط "عرض ثانية" و "خطوات ثانية" كما تريد. تعدل وضع ROI الضرورة.
- حدد قطات الشاشة تمثيلية من مضان GFP، استجابة النيكوتين والاستجابة بوكل. لقطات من المحاصيل وصورة معجون إلى شريحة العرض لتحليلها لاحقا والمقارنة.
- ضبط كل من "عرض ثانية" و "خطوة ثانية" لسرعة تسجيل في ثوان. حدد طول التحليل عن طريق تحريك علامات رمادية على اللوحة العلوية لمنطقة قوس قبل بدء التحفيز وبعد نهاية الاستجابة.
- حدد "تعليق وجهات النظر أثناء اللعب" الصحافة "<< REW" ثم اضغط على "PLAY>". حدد علامة التبويب "الكونت معدل الرسم البياني" وضبط وحدات النحو المرغوب فيه وألوان الخط لتتناسب مع لون ROI.
- عندما يتم الانتهاء من تحليل، اضغط على "تصدير عدد معدل البيانات". اختر لقطات من الشاشة جنبا إلى جنب التسجيلات بنك التعمير الصينى ومنطقة الفص وسطي من الاهتمام من كل جانب. لقطات من المحاصيل وصورة لصق شريحة مع الصور الاستجابة. وسوف تستخدم هذه الشريحة في وقت لاحق في التحليل النهائي.
- تحليل سبيل المثال: طريقة واحدة لتحليل البيانات المستخرجة الفوتون المفصل
- فتح ملفات جداول البيانات في مجلد "الكونت الصادرات معدل".
- إعادة الخلايا في العمود المسمى أول مرة لعرض الوقت في ساعة ودقيقة.
- الرجوع الشريحة المقابلة للعينة. إزالة كافة القيم باستثناء الأعمدة للوقت وممثل هما رويس.
- تحديد النيكوتين التحفيز وقت البدء - متوفرة في ملف إدخال سجل في main المجلدات إزالة البيانات الإضافية قبل أن يبدأ أو قيمة تسليط الضوء.
- البحث أعلى / قيمة الذروة لكل من بنك التعمير الصينى والفص وسطي وعلامة / تسليط الضوء.
- تحديد بداية ونهاية الوقت استجابة لكلابنك التعمير الصينى والفص وسطي عن طريق إنشاء التقدير باستخدام نقطة زمنية من المقابلة رسوم بيانية ردا على الشريحة وحدد القيمة الفعلية عن تغير في القيم في القرب من هذه النقاط. تسليط الضوء على المنطقة الواقعة بين هذه النقاط في كل من بنك التعمير الصينى والفصوص وسطي. بدلا من ذلك، استخدام ماكرو 9.
- الجمع بين جميع العينات من المجموعة التجريبية واحد على جدول جديد.
- محاذاة على الذروة من خلال تحديد قيمة الصف هو لكل قيمة الذروة CCB. طرح أقل القيم من أعلى قيمة الصف لتحديد القيمة التقريبية التوالي حيث يجب أن منسوخ بيانات العينة. تحقق من أن كافة القيم هي ذروة الانحياز.
- نسخ ورقة مرتين وحذف إما الأعمدة الفص وسطي أو الأعمدة CCB إنشاء صفحات من بنك التعمير الصينى فقط أو الفص القيم وسطي.
- إزالة البيانات بعد كل الردود CCB قد انتهت. خلق أربعة صفوف وصفت إجمالي الفوتونات، طول الاستجابة (مدة)، السعة القصوى، والاستجابة الإختفاء. نسخ ولصق هذا مرة أخرى تحت الأصلية.
- استخدم الدالة SUM لتحديد مجموع الفوتونات خلال الاستجابة. استخدم الدالة COUNT لتحديد طول استجابة. نسخة وربط الخلية أعلى قيمة لتحديد قيمة السعة الذروة. استخدام وظيفة COUNT - حدد من البداية للنضح من النيكوتين إلى بداية استجابة - لتحديد الاستجابة الإختفاء.
- نسخة القيم باستخدام الدالة ربط وضرب (كل ما عدا السعة الذروة) عن طريق تسجيل سرعة في ثوان.
- قد يتم إنشاء شريط / مربع الرسوم البيانية لمعايير احتساب مثل عدد الفوتونات، السعة القصوى، وطول ردا على ذلك، إذا كان الأمر كذلك المطلوب (مثلا: الشكل 5B، C، D).
- في العمود بعد الخام الاستجابة الفوتون البيانات، متوسط نقاط البيانات الخام لكل نقطة زمنية باستخدام متوسط وظيفة. إذا المتابعة المطلوبة مع عمود تحديد الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)، لكل من القيم الفوتون متوسط في نقطة زمنية.
- استخدام عمود متوسط لبناء بمتوسط عضوية استجابةه [الرسم البياني] لمجموعة عينة بنك التعمير الصينى. للقيام بذلك حدد العمود تحديد الوقت والقيم محور س وعمود من متوسط قيم الفوتون كما المحور الصادي وأخيرا حدد أداة مخطط التشتت إنشاء الرسم البياني.
- كرر هذا الإجراء مع تحليل البيانات من الفصوص وسطي.
- إنشاء صور للفيديو
- فتح المشاهد الفوتون.
- حدد علامة التبويب التحكم بالعرض. انقر على ROI حين عقد التحكم لاختيار إزالة و / أو تصغيره.
- تعديل "عرض ثانية" (الساعة تراكم) كما هو مطلوب لتحديد محتوى كل إطار.
- تعديل "خطوة ثانية" لتحديد التداخل في كل إطار.
- حدد "وجهات النظر التصدير في حين لعب" الصحافة "<< REW" ثم "PLAY>". سيتم تصديرها الصور للفيديو إلى المجلد "وجهة نظر الصادرات" على شكل سلسلة من الملفات بابوا نيو غينيا.
- استخدام لقب الظاهري لجعل الفيديو: طريقة واحدة للفيديو جreation مفصل
- إنشاء مجلد جديد اسمه "resultats" في المجلد عرض الصادرات التي تحتوي على صور.
- جلب النصي (renommer.VBS) في مجلد من الصور.
- انقر مرتين على renommer.VBS لتشغيل.
- سيتم تلقائيا إعادة تسمية الصور رقميا ونسخها إلى مجلد "resultats".
- فتح VirtualDub.exe.
- تحديد ملف الفيديو مفتوح - حدد الصورة الأولى (والصور اللاحقة تلقائيا تحميل).
- حدد فيديو - حدد الإطار معدل ضبط كما تريد.
- حدد الفيديو - ضغط حدد اختيار سينيباك الترميز التي نصف قطرها.
- في ملف اختر حفظ وافي سيتم إنشاء الفيديو تلقائيا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الانصهار من GFP لaequorin يسمح لنا تصور منطقتنا من الفائدة قبل التصوير إضاءة الحيوية من خلال استثارة GFP في وضع الفلورسنت على المجهر (الشكل 3A، 4A، 6A، 6E). واحدة من أبسط الطرق لتحفيز الهيئات الفطر من خلال تفعيل مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية ionotropic. على الرغم من الأستيل كولين هو يجند الذاتية من هذا المستقبل وجدنا أن النيكوتين ينتج استجابات أكثر استنساخه في الهيئات الفطر. هذا هو في جزء منه لأنها الإعراب صراحة عن مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية، وبالتالي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نهج GFP aequorin القائم على إضاءة الحيوية التي وضعت مؤخرا المقدمة هنا يسمح في الجسم الحي تسجيل ظيفية من الكالسيوم 2+ -activity في الخلايا العصبية المختلفة، وكذلك إذا رغبت في ذلك، في نوع آخر من الخلايا مثل الخلايا النجمية الكلى كما ورد في كابريرو وآخرون. 2013 5.
تعديلات، وإطلاق النار المتاعب، والمكونات الإضافية، والخطوات الحاسمة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نحن مدينون ل E. Karplus ، من Sciences Wares ، الولايات المتحدة الأمريكية ، لمساعدته ونصائحه الثمينة والمفيدة. نشكر E. Carbognin و Avet-Rochex و M. Murmu و P. Pavot و D. Minocci و G. Vinatier و J. Stinnakre على مساهمتهم في تطوير وتحسين هذه التقنية. نشكر أيضا B. Pfeiffer و G. Rubin ، Janelia Farm ، H.H.M.I. ، ASHBURN ، الولايات المتحدة الأمريكية ، على خط pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP. تم دعم هذا العمل من قبل زمالة شاتوبريان ، السفارة الفرنسية ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية إلى A. Lark ، من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (IOS 1352882) إلى T. Kitamoto ، ومن قبل ANRs الفرنسية (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin ، 2005 ، و FlyBrainImaging ، 2011) ، و Conseil Régional Ile-de France (NeRF و DIM) ، و IFR-144 ، وبرنامج واجهة Physique-Chimie-Biologie التابع ل CNRS (2009) ، ومن قبل CNRS ، فرنسا إلى JR Martin.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش | S3014 | |
| CaCl2< / sub> | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2< / sub> | prolabo | 25 108.295 | نورمابور |
| سكروز | سيجما ألدريتش | S0389 | |
| النيكوتين | سيجما ألدريتش | N3876 | |
| ATP | سيجما ألدريتش | A2383 | الأدينوزين 5 & بريم ؛ -ثلاثي الفوسفات ثنائي الصوديوم ملح هيدرات |
| البنزيل - كولينترازين | برولوم ، نانولايت ؛ | القط # 301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| غراء الأسنان | 3M ESPE & trade ؛ | 46954 | Protemp IV |
| غراء السيليكون | 3M ESPE & trade; | 36958 | اكسبرس 2 الشريط السريع للجسم |
| العادي 3M سكوتش | 122s | 3M سكوتش الشريط السحري | |
| ماصة نصائح | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 & micro; ل غرفة طرف الماصة Univesal |
| وحامل (المرحلة) | |||
| حضانة | |||
| ملقط مصنوع يدويا (رقم 5) | أدوات العلوم الدقيقة | 11252-00 | ملقط |
| دقيق ملقط منحني ملقط | منحني Sigma-Aldrich | F4142 | ملقط الغراء بالتشريح |
| الدقيق ؛ | صناعة يدوية | ||
| سكين | أدوات العلوم الدقيقة | 10316-14 | 5 مم عمق 15 درجة ؛ طعن |
| EM-CCD الكاميرا ; | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (مبرد إلى -80 درجة ؛ ج) |
| مجهر | نيكون | Eclipse-E800 | |
| عدسة موضوعية الغاطسة | نيكون | 20X فلور .5 واط | |
| مجهر تشريح مع مضان | Leica MZ Fl III | leica نطاق تشريح ومصباح فلورسنت | |
| مربع مظلم | ضيق Science Wares | مخصص تم بناؤه بواسطة Science Wares | |
| مضخة التمعجية ؛ | أنابيب Gilson | Minipuls 2 | |
| Fisher Scientific | على سمك | Tygon R3603 ، نظام نضح St-Gobain | |
| Warner | 64-0135 ( VC-66CS) | نظام التحكم في صمام التروية ، كامل ، مع صمامات قرصة ، منظمات نضح 6 قنوات | |
| مستكشف | Leventon | Dosi-flow 3 | |
| Wares & برنامج National Instruments | N / A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 | |
| photon imager | أدوات العلوم & برامج الأدوات الوطنية | N / A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| عارض الفوتون | Science Wares & برنامج National Instuments | N / A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| برنامج Excel | Microsoft | N / A | https://www.microsoft.com |
| الوصول المفتوح الافتراضي | برنامج N / A | http://virtualdub.sourceforge.net/ | |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | غير متاح | للأسهم {حاليا} متاحة للجمهور |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | ب. فايفر ، مزارع جانيليا ، أشبورن الولايات المتحدة الأمريكية. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | غير متاح | للأسهم {حاليا} متاحة للجمهور |
| OK107 | مركز الأسهم بلومنجتون | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
المراجع
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943(2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275(2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105(2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6(2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
