مقالة منهجية

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

DOI:

10.3791/53718

⸱

فبراير 25, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular and Aging Research, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg, 2Kidney Control of Homeostasis, Swiss National Centre of Competence in Research, 3System Physiology, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة وصفنا طريقة سهلة نسبيا تكييفها باستخدام صبغ مضان diaminofluorescein-2 ثنائي الأسيتات (DAF-2DA) وdihydroethidium (DHE) للأون كشف الوجه في وقت واحد وتصور أكسيد النيتريك داخل الخلايا (NO) وأنيون الفائق (O 2 .- ) على التوالي، في طازجة معزولة aortas سليمة من نموذج السمنة الماوس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المستمدة من البطانة أكسيد النيتريك (NO) المنتجة من البطانية NO-سينسيز (أنوش) هي واحدة من الجزيئات vasoprotective الأكثر أهمية في علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية. مختلة أنوش مثل فك ربط أنوش يؤدي إلى انخفاض في NO التوافر البيولوجي وزيادة في أنيون الفائق (O 2 .-) الإنتاج، وهذا بدوره يعزز أمراض القلب والأوعية الدموية. لذلك، قياس مناسب من NO و O 2 .- المستويات في الخلايا البطانية تقوم بدور محوري للأبحاث حول أمراض القلب والأوعية الدموية ومضاعفات. بسبب طبيعة عطوب للغاية من NO و O 2 .-، فإنه من الصعب قياس NO و O 2 .- مباشرة في الأوعية الدموية. وقد وضعت طرق عديدة لقياس NO و O 2 .- الإنتاج. غير أنه، إما غير مبال، أو غير محددة، أو يتطلب تقنية عالية ويتطلب معدات خاصة. نحن هنا وصف والتكيفمن طريقة مضان صبغ للأون كشف في وقت واحد وجه والتصور من الخلايا NO و O 2 .- باستخدام خلية قابلة للاختراق diaminofluorescein-2 ثنائي الأسيتات (DAF-2DA) وdihydroethidium (DHE)، على التوالي، في aortas سليمة من نموذج السمنة التي يسببها الماوس عن طريق تغذية عالية الدهون النظام الغذائي. نحن يمكن ان يظهر نقص الخلايا NO وتعزيز O 2 .- المستويات في aortas سليمة المعزولة حديثا من الماوس السمنة بالمقارنة مع السيطرة الماوس العجاف. علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب هو أسلوب سهل للكشف المباشر والتصور من NO و O 2 .- في الأوعية الدموية سليمة، ويمكن تطبيقها على نطاق واسع للتحقيق في (DYS) وظيفة بطانة الأوعية الدموية تحت (طبيب) الحالات المرضية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا بطانة الأوعية الدموية الحفاظ على سلامة الوظيفية والهيكلية الأوعية الدموية عن طريق الإفراج عن عوامل فعال في الأوعية 1. ومن بين هذه العوامل، المستمدة من البطانة أكسيد النيتريك (NO) المنتجة من L-أرجينين عبر البطانية NO-سينسيز (أنوش) هو العامل الأكثر أهمية وأفضل وصف في علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية 2. لا يسبب استرخاء العضلات الملساء ويمنع تكاثر الخلايا، ويحول دون تراكم الصفائح الدموية والتصاق الخلايا الالتهابية والتسلل في الفضاء تحت البطانة، وبالتالي حماية ضد تطور أمراض الأوعية الدموية 3. في ظل العديد من الظروف الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك الشيخوخة، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري، وفرط شحميات الدم، وما إلى ذلك، الخلايا البطانية التي تتميز انخفض NO التوافر البيولوجي وزيادة O 2 .- الإنتاج الحالي ويعزز التسبب في تصلب الشرايين 2. وتبين دراسات من السنوات الأخيرة أن فك ربط أنوش هوآلية هامة لاختلال وظيفي البطانية، التي الإنزيم أنوش يولد O 2 .- بدلا من NO، تحت مختلف الظروف المذكورة أعلاه 1،4. لذلك، وتحليل وظيفة بطانة الأوعية الدموية، على وجه الخصوص، البطانية أي إنتاج وO 2 .- الجيل أمرا حيويا من أجل البحوث التجريبية على أمراض القلب والشرايين والمضاعفات.

هناك مقاربات منهجية العديدة التي تم تطويرها لتحليل وقياس أي إنتاج في العينات البيولوجية. ونظرا لطبيعة عطوب للغاية من NO الذي يتأكسد بسهولة إلى NO 2 - وNO 3 - وله عمر نصف من 3-6 ثانية، فإنه من الصعب قياس NO مباشرة. وقد استخدم في عينات السائل بمثابة مؤشر للNO صدر من الخلايا أو الأنسجة 5 - وبالتالي تحديد NO 2 - / NO 3. على الرغم من أن هذا الإجراء هو سهل نسبيا، فإن هذه الطريقة، ومع ذلك، عصامتتأثر SILY من خلفية عالية من NO مستقر 2 - / NO 3 - الواردة في الحل. لأنه لا يحفز ذوبان guanylate محلقة لإنتاج دوري غوانوزين الأدينوزين (المركب) 6، كما تم تحديد مستوى المركب الخلوي لتقدير NO إطلاق سراح 7. مرة أخرى، وهذا هو تقدير غير المباشر وقد لا تكون محددة، لأن بعض العوامل المشتقة من البطانة مثل C الببتيد الناتريوتريك نوع (CNP) ويمكن أيضا أن تعزز مستويات المركب من خلال تفعيل الجسيمات guanylate محلقة 8. لا يتم انتاجه من L-أرجينين مع جيل من L-سيترولين كناتج المنتج 9، قياس الإنتاج-L سيترولين ولذلك تستخدم أيضا طريقة غير مباشرة لتقدير أي إنتاج. العوائق الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها المشعة، وأنه لا قياس مستويات لا النشطة بيولوجيا، منذ صدر لا يمكن المعطل بسرعة عن طريق O 2 .-. وعلاوة على ذلك، L-سيترولين يمكن إعادة تدويرها إلى L-أرجينين 10. وتستخدم الطرق الكيميائية الأخرى مثل الكشف عن التوهج 11، والإلكترون تدور الرنين 12، أو porphyrinic الكهروكيميائية NO الاستشعار 13 عدد من الباحثين. وهذه الأساليب هي عادة ليست سهلة في التشغيل، وإجراءات الكشف وتتطلب معدات خاصة. بل هو أيضا الإشارة إلى أن العديد من الدراسات تنطبق التجارب حمام الجهاز مع الأوعية الدموية معزولة مع أو بدون البطانة لتقييم وظيفة بطانة الأوعية الدموية وغير مباشر قياس NO بوساطة الارخاء الأوعية الدموية المستمدة من البطانة. ومع ذلك، هذا الأسلوب، على الرغم من أنها في الغالب بالقرب الوضع الفسيولوجي، ولكن بدقة عن القول، لا قياس أي وظيفة، فإنه بدلا يقيم الردود حركي بوساطة البطانة بشكل عام التي تعكس آثار صافية قدرها وظيفة أنوش، وإنتاج البعض الاسترخاء المستمدة من البطانة العوامل وعوامل التعاقد المستمدة من البطانة، وإنتاج O 2 .-، وأيضا ردود خلايا العضلات الملساءلهذه العوامل. مطلوب تحليل معين من وظيفة أنوش أو أي إنتاج عادة 3.

العديد من المجموعات البحثية بما في بلدنا في السنوات الأخيرة استخدام أسلوب صبغ مضان للكشف عن إنتاج الخلايا من NO 14-19. في هذه الطريقة كانت تستخدم الخلية مؤشر مضان نفاذية diaminofluorescein-2 ثنائي الأسيتات (DAF-2DA) لقياس حرة لا وظيفة NOS في الخلايا والأنسجة في المختبر أو خارج الجسم الحي. وأنه في الخلايا الحية، وdeacetylated مبدأ DAF-2DA بواسطة استريز داخل الخلايا لغير الفلورسنت 4،5-diaminofluorescein (DAF-2) الذي تم تحويلها بعد ذلك إلى فلوري DAF-2 التريازول (DAF-2T) عن طريق تفاعل مع NO . مضان من DAF-2T يمكن ملاحظتها تحت المجهر مضان أو مضان المجهر متحد البؤر 14. ولذلك يبين كثافة مضان داخل الخلايا لإنتاج NO الخلايا في الخلايا أو البطانة لفي حالها vesse الدمل. جنبا إلى جنب مع صبغ مضان محددة مثل dihydroethidium (DHE)، ويمكن للمرء أن يقيم في وقت واحد داخل الخلايا NO و O 2 .- جيل في الخلايا أو في الأوعية الدموية 14. وبالمثل، DHE هو أيضا مركب خلية نفاذية أن يتأكسد بواسطة O 2 .- داخل الخلايا، والمنتج الأكسدة ثم intercalates مع الأحماض النووية لتنبعث منها اللون الأحمر الفاتح اكتشاف كميا بواسطة المجهر الفلورسنت أو مضان المجهر متحد البؤر. DHE هو صبغة محددة للغاية للكشف عن O 2 .- من العينات البيولوجية، كما يكشف أساسا هذه الجزيئات، يتم الاحتفاظ بشكل جيد من قبل الخلايا، بل ويمكن أن يتسامح مع تثبيت خفيف 20. واحدة من مزايا هذه الطريقة مضان صبغ هو أنه يكشف ويتصور NO و / أو O 2 .- أون الوجه مباشرة على الطبقة البطانية سليمة من أحد الأوعية الدموية المعيشة.

في هذه الورقة،وصفنا هذه الطريقة مضان صبغ للكشف NO و O 2 .- التي تكيفنا لأون كشف الوجه من NO و O 2 .- في aortas سليمة لنموذج الفأر السمنة الناجمة عن ارتفاع الدهون النظام الغذائي التغذية (HFD). علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب يمكن بنجاح وبشكل موثوق قياس NO و O 2 .- المستويات وتقييم أنوش وظيفة (DYS) في الطبقة البطانية المعزولة حديثا aortas الماوس سليمة في السمنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق العمل الحيوان من قبل اللجنة الأخلاقية للمكتب البيطري فريبورغ، سويسرا. يتبع بروتوكول المبادئ التوجيهية بشأن رعاية الحيوان والتجريب في مؤسستنا.

1. إعداد مجموعة المتابعة لحضانة الشرايين متفرقة

  1. بناء نظام حمام الجهاز الذي يمكن تسخينها إلى 37 درجة مئوية، والغازي مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 من خزان غاز الكربون.
  2. إعداد الكثير من عازلة بيكربونات كريبس الرنين حسب الحاجة مع تركيز على التشكيل التالي: (118 ملي مول كلوريد الصوديوم، 4.7 ملي بوكل، 2.5 ملي CaCl 2، 1.2 ملي MgSO 4، 1.2 مم KH 2 PO 4، 25 مم NaHCO 3، 0،026 ملي EDTA، و 11.1 ملم مد الجلوكوز).
  3. إبقاء المنطقة العازلة الأسهم على الجليد وتهوية المنطقة العازلة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
  4. التبديل على نظام حمام الجهاز، تعيين درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية، وإضافة 5 مل من المخزن المؤقت جاهزة للاستخدام لكل غرفةوالحفاظ على تهوية المنطقة العازلة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
  5. غسل غرف مرة واحدة مع العازلة كريبس الرنين لمدة 30 دقيقة.
  6. إضافة 5 مل العازلة كريبس-قارع الأجراس في كل غرفة، وتغطي الغرفة لتجنب التبخر.

2. عزل Aortas ماوس

  1. حقن بنتوباربيتال الذي يذوب في 0.9٪ كلوريد الصوديوم داخل الصفاق في تركيز 150 ملغم / كغم للتضحية الفئران.
  2. وضع الماوس supinely على لوحة العمليات الجراحية.
  3. رش الفراء من منطقة الصدر مع 70٪ من الإيثانول لأغراض التعقيم والرطوبة.
  4. تجويف الصدر المفتوح عن طريق خفض حول الصدري لفضح القلب والرئتين، وإزالة الرئتين.
  5. إزالة الدم في تجويف الصدر بلطف بمنديل ورق.
  6. فهم قلب بلطف مع ملقط وفصل الشريان الأورطي الصدري عن طريق قطع الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية بين الشريان الأورطي والعمود الفقري مع مقص جراحي.
  7. على الفور تزج مصنعونالأنسجة الإلكترونية في الجليد الباردة (4 ° C) عازلة كريبس الرنين.
  8. إزالة القلب وقوس الأبهر تحت المجهر تشريح والحفاظ على جزء الأبهر الصدري في المخزن المؤقت.
  9. تشريح الشريان الأورطي مجانا من الانضمام الأنسجة المحيطة بالأوعية تحت المجهر مع مقص جراحي وملقط.
  10. فهم على حافة نهاية الشريان الأورطي مع ملقط، وطرد بعيدا عن الدم في تجويف الأوعية الدموية التنظيف بلطف عازلة كريبس-قارع الأجراس مع 26 G × 1 / 2" حقنة.
  11. قطع حلقات الأبهري تنظيفها الى شرائح طويلة 3 مم.
    ملاحظة: انتبه على هذه الخطوة حتى لا تضر طبقة بطانة الأوعية الدموية.

3. DHE وDAF-2DA تلطيخ

  1. نقل شرائح الأورطي تنظيفها مع ملقط لغرف حمام الجهاز مليئة العازلة كريبس الرنين عند 37 درجة مئوية الغازي مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: اللمس فقط الجانب البرانية من حلقات الأبهري مع ملقط ولا المشبك بسفن lood.
  2. تتوازن الشرايين في غرفة حمام الجهاز لمدة 30 دقيقة.
  3. إضافة أستيل كولين (ACH) إلى الحمام الجهاز إلى النهائي تركيز 1 ميكرومتر، واحتضان الشرايين لمدة 10 دقيقة.
  4. إعداد 1 مل من محلول DHE / DAF-2DA (5 ميكرومتر من كل صبغ، مخففة من 1000 × الأسهم) مع العازلة كريبس الرنين قبل تحسنت في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. التفاف أنبوب microcentrifuge مع رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء.
  5. بعد التحفيز، ونقل حلقات الأبهري من حمام الجهاز إلى حل DHE / DAF-2DA في أنبوب microcentrifuge عند 37 درجة مئوية الغازي مع 95٪ O 2 و CO 2 5٪ واحتضان حلقات الأبهري لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: من هذه الخطوة، والحفاظ على aortas دائما في الظلام.
  6. نقل حلقات الأبهري إلى أنبوب microcentrifuge جديد مع العازلة كريبس الرنين لغسيل وتكرار الغسيل ثلاث مرات في غضون 1 دقيقة.
  7. نقل حلقات الأبهري إلى 4٪ حل لامتصاص العرق لتثبيت ل30دقيقة.
  8. إعداد 1 مل 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) حل (300 نانومتر، مخففة من 1000 × الأسهم) مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. مباين للaortas لمدة 3 دقائق.
  9. نقل aortas إلى أنبوب microcentrifuge جديد مع العازلة في برنامج تلفزيوني لغسيل لمدة 1 دقيقة. تكرار غسل ثلاث مرات.
    ملاحظة: لا تولي اهتماما لتضييق حلقات الأبهري أو تلف طبقة بطانة.

4. أون الوجه تصاعد

  1. إضافة قطرة من تصاعد المتوسطة إلى الشريحة.
  2. قطع حلقات الأبهري طوليا مع مقص المجهرية تحت المجهر، وجعل aortas تدحرجت متابعة شقة وتركيبها أون الوجه على المتوسطة المتزايدة مع البطانة أسفل على شريحة زجاجية. لا تحرك aortas ذهابا وإيابا.
  3. تغطية الشريحة مع انزلاق الغطاء وختم الشريحة مع طلاء الأظافر.
  4. بعد تجفيف الهواء تحت حماية الخفيفة، استخدم الشرائح لتصوير خيمةctly خلال ساعات أو تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة الأيام القليلة المقبلة.

5. متحد البؤر المجهري التصوير

  1. استخدام المجهر متحد البؤر للكشف عن الإشارات مضان. التبديل على الجهاز وتحسين إعدادات التصوير مثل التكبير، سرعة المسح الضوئي، القرار، Z المكدس.
    1. لهذا البروتوكول، واستخدام 200 هرتز سرعة المسح الضوئي، وقرار من 1024 × 1024 بكسل وحجم Z خطوة من 0.25 ميكرون. تثير مضان من DAF-2DA مع 488 نانومتر الأرجون ليزر وكشف في 515 نانومتر، بينما تثير مضان من DHE في 514 نانومتر، وكشف في 605 الانبعاثات نانومتر.
  2. استخدام 10X تكبير للتركيز على عينة حتى إشارة دابي واضحة مع الأشعة فوق البنفسجية، ومن ثم ضبط الهدف 40X تكبير.
  3. تحديد نطاق الطبقة البطانية عن طريق تعديل Z الموقف على لوحة التحكم. إشارات نواة ملطخة دابي هي النقاط بيضاوية أو مستديرة في الطبقة البطانية.
  4. مسح من أعلى(الطبقة البطانية على الحدود التجويف) من العينة من خلال سمك كامل من البطانية إشارة وسجل الصور. اختيار لا يقل عن 3 مجالات مختلفة لفحص كل عينة.

6. تحليل الصور

  1. استخدام برنامج لفتح البيانات الممسوحة ضوئيا بواسطة المجهر متحد البؤر. اختيار ثلاث صور متتالية في المجال لتحليل وتقييم لا يقل عن 3 حقول مختلفة لكل عينة. تصدير الصور المختارة وحفظها كملفات JPEG.
  2. تحديد الصور من DAF-2DA، DHE ودابي تلطيخ مع برامج معالجة الصور. للصورة من تلطيخ دابي، اختر 'الإضافات' → 'تحليل' → "مكافحة خلية" لحساب عدد من دابي نواة إيجابية.
    1. للصور من DAF-2DA وDHE تلطيخ، اختر 'تحليل' → "قياس" لتحليل كثافة الإشارات، وأخذ قيمة 'متوسط' كما كثافة إشارة النسبية. الحالية ثم جاءت النتائج على النحو نسبة DAF-2DA لدابي النوى إيجابية أو نسبة DHE إلى دابي. لكل عينة، واتخاذ متوسط ​​قيمة كل صورة والميدان.
  3. تقسيم النتيجة من كل عينة من متوسط ​​المجموعة الضابطة للحصول على تغيير أضعاف. تم إجراء التحليل الإحصائي مع أونبايريد الطالب اختبار تي أو أنوفا مع Dunnett أو بونفيروني بعد الاختبار. إعطاء البيانات كما يعني ± SEM. النظر في الاختلافات في القيم المتوسطة بالمهم ص <0.05 14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السمنة هي عامل خطر مهم من أمراض القلب والشرايين الدماغية ويترافق مع انخفاض البطانية NO التوافر البيولوجي، وهو السمة المميزة لمرض الأوعية الدموية تصلب الشرايين 21. وقد تبين أنوش-فك ربط ليكون آلية هامة من اختلال وظيفي البطانية تحت العديد من الظروف الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك كبار السن 22، وتصلب الشرايين، والسمنة 14. لذلك، ونحن هنا مقارنة الفئران الخالية من الدهون والسمنة لتظهر النتيجة تمثيلية من NO و O 2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشف NO أو O 2 .- مع الأصباغ الفلورية وكثيرا ما تستخدم في العديد من الدراسات في الخلايا البطانية مثقف وأيضا في cryosections الأنسجة 23. نحن هنا تمديد هذه الطريقة إلى الأوعية الدموية المعيشة على حالها، أي أون كشف الوجه من NO و O 2 .- المستويات في الطبقة البطانية مع DAF-2DA وDHE، على التوالي، والتي هي فعالة وبسيطة نسبيا، وحدسي. بالمقارنة مع أسلوب في cryosections الأوعية الدموية، ويظهر هذا الأسلوب أقل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (310030_141070/1) ومؤسسة القلب السويسرية والمركز الوطني للكفاءة في البحث (NCCR-Kidney.CH) سويسرا. يو يي مدعوم من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ثنائي هيدروإيثيديوم (DHE)InvitrogenD 1168يذوب مع DMSO إلى 5 & nbsp ؛ مليمول / لتر مثل مخزون 1,000 ضعفا ، مخزن في -20   ؛ ° C
ثنائي الأسيتات Diaminofluorescein-2 (DAF-2DA)251505يذوب Calbiochemمع DMSO إلى 5 & nbsp ؛ مليمول / لتر مثل مخزون 1,000 ضعفا ، مخزن في -20   ؛ ° C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)InvitrogenD 1306تذوب مع الماء إلى 300  ومايكرو. مول / لتر مثل مخزون 1,000 مرة ، مخزن في 4   ؛ ° C
تصاعد متوسطناقلات العمل. (reactolab)H-1000
N&# 969; < / sub>-Nitro-L-arginine ميثيل إستر هيدروكلوريد (L-NAME)Sigma-aldrichN5751
PentobarbitalSigma-aldrichP3636
نظام الميوغراف المتعدد   ؛الدنماركية ميو التكنولوجيا A / Sموديل 610M
مجهرنيكونSMZ800
مجهر متحد البؤر  Leica DM6000 
برنامج معالجة الصورالمعهد الوطني للصحة (NIH)صورةJ 
مقص جراحي رز & T AGSDC-11
مقص الجراحة المجهرية FST15000-01
ملقطS & T AGJF-5
Coverslip القطر الدائري 15   ؛ ممVWR631-1579
نصائح 1 ملVWRRFL-1200c   ؛
نصائح 200 &# 956; لVWR613.0659
أنابيب القفل الآمن Eppendorf 1.5 ملEppendorf & nbsp ؛30120086
كلوريد أستيل كولينسيجما ألدريتشA-6625

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149(2013).
  2. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  3. Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
  4. Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
  5. Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
  6. Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
  7. Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
  8. Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
  9. Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
  10. Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
  11. Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
  12. Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
  13. Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
  14. Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113(2014).
  15. Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
  16. Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
  17. Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
  18. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
  19. Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
  20. Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
  21. Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
  22. Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
  23. Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

eNOS

مقالات ذات صلة