يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

A عالية الدقة الطريقة لرصد تفعيل الفسفرة التي تعتمد من IRF3

11.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53723

⸱

يناير 24, 2016

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا نصف إجراء يسمح بتحليل مفصل للتنشيط المعتمد على الفسفرة لعامل النسخ IRF3. يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين SDS-PAGE عالي الدقة و PAGE الأصلي المقترن بالبقع المناعية باستخدام أجسام مضادة متعددة للفوسف.

الملخص

يعد عامل النسخ IRF3 أمرا بالغ الأهمية لخط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض بشكل أساسي من خلال β الإنترفيرون والتعبير الجيني المضاد للفيروسات. يعد التحليل التفصيلي لتنشيط IRF3 ضروريا لفهم كيفية تحفيز مسببات الأمراض أو التهرب من الاستجابة الفطرية المضادة للفيروسات. يمكن تمييز الأشكال المنشطة المميزة ل IRF3 بناء على الفسفرة وحالة المونومر مقابل الخافت. يمكن تحقيق التمييز في الجسم الحي بين الأنواع المنشطة المختلفة ل IRF3 من خلال فصل الأشكال المفسفرة IRF3 بناء على تحولات حركتها على SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مراقبة مستويات مونومر IRF3 وثنائي باستخدام الرحلان الكهربائي غير المتغير. هنا ، نقوم بتفصيل إجراء للوصول إلى أعلى دقة للحصول على أكبر قدر من المعلومات المتعلقة بحالة تنشيط IRF3. يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين SDS-PAGE عالي الدقة و PAGE الأصلي المقترن بالبقع المناعية باستخدام العديد من الأجسام المضادة الكلية والفوسفوفية النوعية. تشكل هذه الاستراتيجية التجريبية نهجا ميسور التكلفة وحساسا للحصول على جميع المعلومات اللازمة لإجراء تحليل كامل للتنشيط بوساطة الفسفرة ل IRF3.

المقدمة

عامل النسخ أعرب بتواجد مطلق وجوهري إنترفيرون (IFN) عامل التنظيمي 3 (IRF3) هو أمر حاسم لخط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض أساسا من خلال تحريض IFNβ، ولكن أيضا من خلال تحريض على chemokine (CC عزر) يجند 5 (CCL5 ) والعديد من البروتينات المضادة للفيروسات بما في ذلك البروتين IFN التي يسببها مع tetratricopeptide يكرر IFIT1 / 2/3 1-3. تم الإبلاغ عن تفعيل IRF3 العدوى التالية مع العديد من الفيروسات أو التعرض لحمض polyinosinic-polycytidylic (بولي I: C) أو lipopolysaccharide في (LPS) 4. الأهم من ذلك، تطورت الفيروسات الأكثر دراسة آليات للتهرب من الاستجابة بوساطة IRF3، وبالتالي الهروب من المضيف الدفاع المناعي الفطري 5. وهكذا، ورصد تفعيل IRF3 له أهمية كبيرة لفهم الآليات الجزيئية للالفطري دفاع المضيف المضادة للفيروسات، ولكن أيضا لتحديد استراتيجية تستخدمها الفيروسات للتصدي لهذا الرد.

والأنف والحنجرة "> لكن العديد من التقارير المنشورة لا توفر سوى تحليل محدود من تفعيل IRF3 التي يؤديها رصد تحريض الجينات IRF3 المستهدفة (IFNB1 وIFIT1) و / أو مراسل luciferase الفحص الجيني بالإضافة إلى دقة منخفضة الصوديوم هلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS- PAGE) تحليل IRF3. ومع ذلك، العديد من الدراسات البيوكيميائية، ساهمت تحليل سلوك مختلف المسوخ IRF3 وتوضيح هيكل IRF3 الكريستال 11/06 لإثبات أن IRF3 يخضع لمجموعة معقدة من التعديلات بعد متعدية متتابعة من قبل الفسفرة في مواقع متعددة. ويبدو أن مجموعة من الفسفرة المشاركة في تفعيل IRF3 أن تعتمد على التحفيز وعلى الأرجح على نوع من الخلايا. في الخلايا غير المصابة، IRF3 تتعايش كأنواع غير فسفرته وhypophosphorylated تحتوي على phosphoresidues، بما في ذلك Thr135 وSer173، في 1 -198 أأ-N محطة المنطقة 6،12-14. تراكم هذا و hypophosphorylatedهو فعل مكتب إدارة السجلات من IRF3 بواسطة محرضات الإجهاد، وعوامل النمو وعوامل الإضرار DNA 6. الفسفرة من بقايا سر / منتدى المجالس الرومانسية في المنطقة C من محطة IRF3 تحتوي على المجال transactivation يتم تشغيل يتابع تفعيل الفيروسات، بولي I: C أو LPS في نوع الخلية بطريقة تعتمد 15-17. الفسفرة-C النهائي للIRF3 تشمل ما لا يقل عن 7 مواقع phosphoacceptor متميزة نظمت في مجموعتين رئيسيتين، Ser385 / Ser386 وSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405، التي تساهم كل لتفعيل IRF3 من خلال dimerization، تراكم النووي، بالتعاون مع CREB -binding البروتين (CBP) / coactivators P300، DNA ملزمة لالإنترفيرون عنصر استجابة حساسة (ISRE) تسلسل التوافق وtransactivation من الجينات المستهدفة 9،10،17-19. ويعتقد الفسفرة Thr390 أيضا للمساهمة في يسببها فيروس تفعيل IRF3 20. تحليل الطيف الكتلي من IRF3 أثبتت أن Ser386، Thr390، Ser396 وSer402 البقايا مباشرة phosphorylatإد من قبل المانع من كيلوبايت كيناز ε (IKKε) / ملزم TANK كيناز 1 (TBK1) تحركات 9،10. مطلوب أيضا الفسفرة في بقايا-C محطة لإنهاء تفعيل IRF3 من خلال polyubiquitination وبوساطة proteasome وتدهور 10. هذه العملية هي أيضا تعتمد على الفسفرة في Ser339، وهو أمر ضروري لتوظيف مزامرة بروبيل PIN1 10،11. وتعتبر الأنواع IRF3 التي تحتوي على ما لا يقل عن الفوسفات-Ser339 / 386/396 بقايا أشكال hyperphosphorylated. يبقى التسلسل الدقيق ووظيفة كل موقع مسألة مناقشة 10،21. فمن الواضح الآن أن IRF3 تنشيط لا يمثل دولة متجانسة، إلا أن الأنواع المختلفة تنشيط اظهار الفسفرة أو dimerization خصائص متميزة موجودة 10،22.

لتوفير فهم كامل لتفعيل IRF3 ردا على مسببات الأمراض المحددة، بالتالي فمن الضروري لصفلاaracterize أي من الأنواع تفعيلها والتي يسببها. تحريض الجينات المستهدفة IRF3، IFNB1 وIFIT1، وقد ثبت أن نقدم موثوق للقراءة من أجل تفعيل IRF3. ومع ذلك، ورصد التعبير عن هذه الجينات لا يميز بين الدول التنشيط مختلفة من IRF3. يعتمد تحليل شامل للدول تفعيل IRF3 في وضع معين على توصيف مفصل للالفسفرة وdimerization ضعها 10. Unphosphorylated (النموذج الأول)، hypophosphorylated (النموذج الثاني) وhyperphosphorylated (أشكال الثالث والرابع) أشكال IRF3 6،18،23 يمكن حلها بنجاح من قبل قلة الحركة في قرار عالية من تحليل SDS-PAGE. الأنواع IRF3 أحادى ومثنوي يمكن تحديد كفاءة من خلال تحليل الأم-PAGE. يتم تحسين هذه المناهج إلى حد كبير عندما تستخدم بالاقتران مع الأجسام المضادة الموجهة ضد phosphospecific متميزة المواقع IRF3 phosphoacceptor.

بروتوكولات موحدة تسمح قرار فقيرالبروتينات التي لا يسمح الفصل الفعال للIRF3 متميزة أشكال فسفرته. هنا، نحن تصف بالتفصيل إجراء لتحقيق أعلى دقة لرصد تحريض متميزة الأنواع IRF3 تنشيط الفيروس باستخدام SDS-PAGE بالإضافة إلى الأم-PAGE في تركيبة مع طخة مناعية باستخدام الكلية وphosphospecific الأجسام المضادة. المجراة التمييز بين مختلف تفعيلها يتم تنفيذ أشكال IRF3 على أساس التحولات حراكها لوحظ على SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، IRF3 مونومر وديمر يمكن تمييزها من قبل الكهربائي غير تغيير طبيعة. الجمع بين هذه التقنيات التكميلية مع اثنين من طخة مناعية يبرهن على أن تكون نهجا بأسعار معقولة وحساسة للحصول على جميع المعلومات اللازمة لإجراء تحليل كامل لتفعيل بوساطة الفسفرة IRF3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يتم وصف بروتوكول هنا باستخدام خلايا A549 المصابين بفيروس سينداي (SEV). ومع ذلك، فإن بروتوكول لSDS-PAGE وPAGE الأم يعمل أيضا مع جميع أنواع الخلايا الإنسان والفئران تم اختبارها حتى الآن، وخاصة خلايا الدم النخاعي حفز مع مختلف-تفعيل IRF3 9،15،19،24،25 المحفزات.

1. العدوى من خلايا A549

  1. الحفاظ على خلايا A549 في الثقافة في 15 سم لوحة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 في 20 مل F12K / هام المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل للحرارة المعطل الجنين البقري (مرحبا-FBS) و 1٪ L-الجلوتامين (F12K كاملة / لحم الخنزير المتوسطة).
    ملاحظة: يجب على جميع الحلول المستخدمة لزراعة الخلايا والعلاجات تكون عقيمة.
  2. في 24 ساعة فقط قبل الإصابة، نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع 10 مل من الفوسفات المقطر مخزنة المالحة (D-PBS) في RT.
  3. إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA حل لكل لوحة لتغطية الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  4. وقف الحضانة بمجرد عشرالخلايا ه بداية لفصل من لوحة عن طريق النقر بهدوء لوحة بيد واحدة. إبطال نشاط التربسين وذلك بإضافة 10 مل من تسخينه مسبقا كامل F12K / هام المتوسطة في لوحة ونقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 3 دقائق على RT. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 8 مل من F12K / هام المتوسطة للحصول على تعليق خلية واحدة متجانسة.
  6. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 خلايا في 60 ملم لوحة في 4 مل من يسخن قبل كامل F12K / هام المتوسطة. احتضان لمدة 20-24 ساعة عند 37 ° C / 5٪ CO 2. بعد 20-24 ساعة، والخلايا تشكل متموجة أحادي الطبقة 90٪ (وهذا يتوافق مع 1.5 × 10 6 خلايا).
  7. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 2 مل من مصل خالية F12K / هام المتوسطة (SFM). إضافة 2 مل من SFM جديدة في 60 ملم لوحة.
  8. ذوبان الجليد قسامة من فيروس سينداي (SEV) (المخزنة aliquoted -80 ° C) على الجليد ودوامة لفترة وجيزة.
  9. تمييع عشرفيروس الإلكترونية في الإدارة المستدامة للغابات ما قبل ساخنة للحصول على 60 HAU / 100 ميكرولتر. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا بهدوء وإضافة 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف لكل لوحة لأداء العدوى في 40 HAU / 10 6 خلايا. لا تقم بإضافة الفيروس في لوحة التحكم غير المصابة.
  10. احتضان الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2. تستنهض الهمم لوحات باليد 3 أو 4 مرات، أو باستخدام شاكر المداري أو هزاز التلقائي وضعها مباشرة في الحاضنة، خلال الساعة الأولى من الإصابة.
  11. في 2 ساعة بعد الإصابة، إضافة 2 مل من F12K / هام المتوسطة التي تحتوي على 20٪ مرحبا-FBS للحصول على تركيز النهائي من 10٪ مرحبا-FBS.
  12. احتضان الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية / 5 CO 2٪ إضافيين من 1 و 4 و 7 ساعة للوصول إلى مجموع مرات إصابة 3 و 6 و 9 ساعة، على التوالي. في كل من هذه النقاط الزمنية، انتقل إلى الخطوة 2.1.

2. إعداد كله خلية مقتطفات (WCE)

  1. إزالة المتوسطة العدوى. حصاد الخلايا عن طريق كشط في 1 ملمن الجليد الباردة D-PBS ونقل تعليق خلية إلى قبل المبردة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي.
  2. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 16000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 20 ثانية وصب بعناية كل آثار D-PBS.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، بيليه الخلية يمكن أن تخضع مباشرة لاستخراج البروتين أو فلاش المجمدة في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف / حمام الإيثانول وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تحلل.
  3. إعداد العازلة تحلل تحتوي على 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA، 10٪ الجلسرين و 1٪ Nonidet P-40 في الماء منزوع الأيونات ([ده 2 O). Extemporarily إضافة البروتيني (1 ميكروغرام / مل leupeptin و 2 ميكروغرام / مل أبروتينين) والفوسفاتيز مثبطات (5 ملم فلوريد الصوديوم، تنشيط 1 ملم orthovanadate الصوديوم، 2 مم البارانتروفنيل الفوسفات و 10 ملم β-سكرولي 7.5 درجة الحموضة).
    ملاحظة: تحلل العازلة دون مثبطات يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية. يوصف بروتوكول معين لتفعيل orthovanadate الصوديوم في جدول الكواشف محددة / اجهزة لازيوتالإقليم الشمالي.
  4. resuspend الكرية خلية في 70 ميكرولتر من تحلل العازلة. عادة تركيز المحللة ستكون حوالي 2 ميكروغرام / ميكرولتر.
  5. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. فلاش تجميد المحللة التي كتبها حضانة في حمام النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية. ذوبان الجليد في المحللة في RT حتى ذاب تماما ودوامة لمدة 10 ثانية. تكرار تجميد / الذوبان / دورة دوامة 3 مرات.
    1. بدلا من ذلك، نفذ الخطوة تجميد في الإيثانول / الجاف حمام الثلج لمدة 1 دقيقة.
  6. الطرد المركزي في 16000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. نقل طاف (المقابلة لWCE) إلى قبل المبردة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة. الحفاظ على WCE على الجليد في جميع الأوقات.
  7. تحديد البروتينات باستخدام أي إجراء تقدير البروتين متوافق مع تحلل العازلة مثل تستند برادفورد فحص البروتين 26.

3. قرار WCE التي كتبها عالية الدقة SDS-PAGE

  1. إعداد ثلاث تغيير طبيعة المواد الهلامية الكهربائي.
    1. للكشف عنأشكال IRF3، صب نوعان من المواد الهلامية ما لا يقل عن 16 سم طول مع هلام فصل يتكون من 7.5٪ الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (37.5: 1)، 375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8 (RT)، 0.1٪ سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS )، بيرسلفات 1٪ الأمونيوم و 0.1٪ TEMED في ده 2 O وهلام التراص مكونة من 4٪ الأكريلاميد، 62.5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT)، 0.05٪ SDS، فوق كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.1٪ TEMED في ده 2 O.
      الحذر! مادة الأكريلاميد، TEMED وSDS سامة و / أو مهيجة. ارتداء قفازات واقية والتلاعب تحت غطاء الدخان.
    2. للكشف عن البروتينات SEV، صب جل واحدة لا تقل عن 8.5 سم طول مع خصائص مشابهة للهلام هو موضح في 3.1.1، إلا أن جل فصل يحتوي على 12٪ مادة الأكريلاميد.
  2. تفسد WCE حصلت عليه في الخطوة 2.6 بإضافة 1: 4 (V / V) العازلة 5X تحميل (125 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT)، و 10٪ SDS، 20٪ (ع / ت) الجلسرين، 0.0005٪ برموفينول الأزرق و 25٪ β المركابتويثانول في ده 2 O) تليها التدفئة في 100 °C لمدة 10 دقيقة. دوران سريع الأنابيب لاسقاط التكثيف الذي يشكل في الحد الأقصى.
    الحذر! β المركابتويثانول هي سامة عن طريق الإستنشاق. ارتداء قفازات واقية والتلاعب تحت غطاء الدخان.
  3. تحميل المواد الهلامية في جهاز الهجرة. ملء الغرف العلوية والسفلية مع تشغيل العازلة التي تحتوي على 25 ملي تريس، قاعدة، 0.1٪ SDS و 192 ملي الجلايسين في الماء المقطر (DH 2 O).
  4. تحميل 14 ميكرولتر من معيار الوزن الجزيئي في بئر واحدة من كل 16 سم جل و7 ميكرولتر من معيار الوزن الجزيئي في بئر واحدة من 8.5 سم هلام. تحميل 30 ميكروغرام من WCE التشويه والتحريف (أعد كما هو موضح في الخطوة 3.2) لكل بئر من اثنين من المواد الهلامية التي أعدت في الخطوة 3.1.1 للكشف عن أشكال IRF3. تحميل 8-10 ميكروغرام من WCE التشويه والتحريف (أعد كما هو موضح في الخطوة 3.2) لكل بئر على هلام أعدت في الخطوة 3.1.2 لتحليل SEV.
  5. تشغيل المواد الهلامية في 30 أمبير تيار مستمر حتى تصل أمام الهجرة الجزء السفلي من هلام.
    ملاحظة: الهجرة عادة يستمر approximately 3 ساعة ل16 سم هلام و 45 دقيقة للحصول على 8.5 سم هلام.
  6. الشروع في نقل على الأغشية النيتروسليلوز (الخطوة 5).

4. تحليل IRF3 Dimerization من قبل الأم-PAGE

ملاحظة: هذه الطريقة تم وصفها في الأصل من قبل مجموعة من الدكتور T. فوجيتا 27.

  1. إعداد العليا (-) وانخفاض (+) مخازن غرفة الكهربائي. يتكون المخزن المؤقت الغرفة العليا من 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.4 (RT)، 192 ملي الجلايسين و1٪ deoxycholate الصوديوم (DOC) في ده 2 O. المخزن المؤقت النواب يحتوي على 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.4 (RT) و 192 ملي الجلايسين في ده 2 O.
    ملاحظة: يمكن تخزين غرفة مخازن الكهربائي العلوية والسفلية في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. ومع ذلك، تأكد من أنها قبل استعد لRT قبل تنفيذ الكهربائي.
  2. صب جل غير تغيير طبيعة-حل ما لا يقل عن 8.5 سم طول تحتوي على 7.5٪ الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (37.5: 1)، 375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8 (RT)، 1٪ ذخيرةبيرسلفات nium و 0.1٪ TEMED في ده 2 O.
  3. قبل تشغيل هلام في 40 مللي أمبير تيار مستمر لمدة 30 دقيقة على الجليد. اضغط على جهاز الجري في الجليد تقريبا إلى مستوى أقل عازلة الكهربائي الغرفة. من المهم أن الجل ليس في الجليد.
  4. خلال مرحلة ما قبل التشغيل، مزيج أبقى WCE على الجليد مع 2X الأم-PAGE تحميل العازلة 1: 1 (ت / ت) التي تحتوي على 125 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT)، و 30٪ الجلسرين و 0.1٪ برموفينول الأزرق في ده 2 O.
  5. تحميل 8-10 ميكروغرام WCE (أعد كما هو موضح في الخطوة 4.4) على الفور في نهاية مرحلة ما قبل التشغيل.
  6. تشغيل هلام في 25 مللي أمبير تيار مستمر على الجليد، كما هو موضح أعلاه لما قبل التشغيل، حتى تصل أمام الهجرة الجزء السفلي من هلام (حوالي 40 دقيقة).

5. تحليل طخة مناعية الأنواع IRF3

  1. إعداد المخزن المؤقت نقل تحتوي على 25 ملي تريس، قاعدة و 192 ملي الجلايسين في ده 2 O. بردت العازلة نقل في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
  2. الرطب ثلاث قطع من غشاء النيتروسليلوز قطع إلى حجم أكبر قليلا من المواد الهلامية في مربع من البلاستيك / الزجاج التي تحتوي على المخزن المؤقت النقل. تشير إلى اتجاه الغشاء عن طريق قطع زاوية واحدة. المخزن المؤقت نقل يمكن إعادة استخدامها 3 مرات. تخزين المخزن المؤقت في 4 ° C بين الاستخدامات.
  3. Uncast المواد الهلامية (SDS-PAGE والأم-PAGE) وقطع زاوية واحدة من كل جل للالتوجه السليم.
    1. لالأم-PAGE، واحتضان الجل في RT مع الإثارة لطيف لمدة 30 دقيقة على الأقل في المنطقة العازلة SDS-PAGE تشغيل لإزالة DOC قبل ان ينتقل الى المخزن المؤقت النقل.
  4. احتضان المواد الهلامية (SDS-PAGE والأم-PAGE) في المخزن المؤقت نقل عن 5-10 دقيقة.
  5. جبل شطيرة نقل في هلام في شريط نقل مع غشاء نحو القطب الموجب (رغوة ورقة وسادة / فلتر / غشاء / هلام / ورقة مرشح / وسادة رغوة). كن حذرا لإزالة جميع الفقاعات في بين طبقات من الساندويتش.
  6. أداء نقل على النحو الموصى به بذ الشركة المصنعة للجهاز نقل المستخدمة.
    ملاحظة: تنفيذ جميع حضانات ويغسل في الخطوات المقبلة على منصة هزاز أو المدارية تهتز.
  7. في نهاية الوقت نقل، واحتضان الأغشية لمدة 15 دقيقة في محلول التثبيت التي تحتوي على حمض الخليك 7٪، 40٪ من الإيثانول و 3٪ الجلسرين في ده 2 O. غسل الأغشية 3X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10.2 ملي نا 2 هبو 4 و 1.8 ملي KH 2 PO 4 في DH 2 O).
    الحذر! حمض الخليك غير سامة، مهيجة وقابلة للاشتعال. ارتداء قفازات واقية والتلاعب تحت غطاء الدخان.
    ملاحظة: الحل تثبيت يمكن إعادة استخدامها عدة مرات.
  8. لغشاء الأم-PAGE الانتقال مباشرة إلى الخطوة 5.11.
  9. شطف الأغشية SDS-PAGE ثلاثة بسرعة في DH 2 O قبل تفرخ لهم لمدة 1 دقيقة في حل الشقائقية الحمراء التي تحتوي على 6.57 ملي الشقائقية الأحمر وحامض الخليك 1٪ في DDH 2 O.
    ملاحظة: الحل الشقائقية الأحمر يمكن أن يكون ص eused عدة مرات.
  10. شطف الأغشية في DH 2 O حتى خلفية بيضاء بما فيه الكفاية لرؤية العصابات البروتين ملطخة باللون الأحمر. لاحظ علامات مع قلم رصاص وقطع غشاء الزائدة حول البروتينات. يزيل اللون الأغشية قبل الحضانة لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني في إطار التحريض.
  11. احتضان الأغشية لمدة 1 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية في عرقلة الحل (PBS تحتوي على 0.05٪ توين 20 و الحليب الجاف 5٪ الخالي من الدسم () الحليب PBS-T. غسل الأغشية 3X 5 دقائق في PBS-T.
    ملاحظة: غسل PBS-T هو اختياري والوحيد المطلوب بدقة عند تطبيق الأجسام المضادة المخفف في تحتوي على 5٪ ألبومين المصل البقري (PBS-T-BSA) (الشكل 1 والجدول 1) في الخطوة التالية PBS-T.
  12. احتضان أربع الأغشية (من SDS-PAGE والأم-PAGE) مع الأجسام المضادة الأولية وفقا لترتيب تسلسلي المفصل في الشكل 1 والجدول 1. نفذ 5X 5 دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني-T.
"> figure-protocol-1
الشكل 1. تسلسل تحليلات طخة مناعية. ويصف التخطيطي الفردية SDS-PAGE والأم-PAGE المواد الهلامية اللازمة للكشف عن مختلف أشكال فسفرته وأحادى / مثنوي IRF3. يوصف ترتيب معين من الأجسام المضادة تطبيقها على غشاء الناتجة عن كل هلام في إجراء طخة مناعية. لاحظ أن الأجسام المضادة الأكتين وتستخدم الأولى لضمان التحميل على قدم المساواة من العينات قبل تطبيق أي أجسام مضادة محددة أخرى. تسلسل بديل، مع أضداد أكتين تطبق بعد أضداد الفوسفات-IRF3، ويعمل أيضا. ويستخدم تجريد بين المضادة للالأكتين ومعاداة SEV الأجسام المضادة، أو بين مكافحة الفوسفات-IRF3 وأضداد IRF3 بسبب تداخل حجم الإشارات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكافحة الأرانب
الأجسام المضادة الأولية تخفيف عازلة التخفيف حضانة الأجسام المضادة الثانوية تعليقات
المضادة للأكتين 1/10000 PBS-T-BSA 15 دقيقة في RT مكافحة فأر استخدام بعد SDS-PAGE
antibodyies المخفف يمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا المخزنة في 4 درجات مئوية في وجود 0.02٪ أزيد الصوديوم.
مكافحة IRF3-P-Ser386 1/200 PBS-T-BSA O / N عند 4 درجات مئوية المضادة للأرنب استخدام بعد الأم-PAGE.
فمن غير المستحسن إعادة استخدام الأجسام المضادة المخفف
مكافحة IRF3-P-Ser396 1/10000 PBS-T-BSA O / N عند 4 درجات مئوية استخدام بعد SDS-PAGE.
فمن غير المستحسن لإعادة المخفف الأجسام المضادة لمكافحة IRF3-P-396 هو متاح من الإشارات الخلوية أيضا. وقد تم تعريف التخفيف الأمثل ك 1/1000 لهذا الجسم المضاد، ولكن قد تختلف بين الكثير.
مكافحة IRF3-P-Ser398 1/10000 PBS-T-BSA O / N عند 4 درجات مئوية المضادة للأرنب استخدام بعد SDS-PAGE. فمن غير المستحسن إعادة استخدام الأجسام المضادة المخفف
المضادة للIRF3 كامل طول 1/7500 PBS-T-الحليب 3 ساعة على RT المضادة للأرنب استخدام بعد SDS-PAGE. المضادة للIRF3 كامل طول الأجسام المضادة يمكن أن تستخدم بعد الأم-PAGE، ولكنه أقل حساسية للكشف عن مونومر. الأجسام المضادة المخفف يمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا المخزنة في 4 درجات مئوية في وجود 0.02٪ أزيد الصوديوم.
مكافحة IRF3-NES 0.5 ميكروغرام / مل PBS-T-الحليب 3 ساعة على RT المضادة للأرنب استخدام بعد الأم-PAGE. antibodyies المخفف يمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا المخزنة في 4 درجات مئوية في وجود 0.02٪ أزيد الصوديوم.
المضادة للSEV 1/14000 PBS-T-BSA 3 ساعة على RT المضادة للأرنب استخدام بعد SDS-PAGE. antibodyies المخفف يمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا المخزنة في 4 درجات مئوية في وجود 0.02٪ أزيد الصوديوم.
ملاحظة: التخفيف وعازلة تستخدم لالأجسام المضادة الثانوية HRP الديناميكي تحتاج إلى أن يكون الأمثل كما انها تختلف من شركة إلى أخرى.
. في غضون صفحة = "1">

الجدول 1. مواصفات الأجسام المضادة المستخدمة في إجراء Immunoblotting.

  1. احتضان الأغشية مع البيروكسيديز الفجل (HRP) -conjugated الأجسام المضادة الثانوية على النحو المفصل في الشكل 1 والجدول 1. غسل الأغشية 5X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني-T، تليها 2X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني لإزالة تماما آثار توين.
  2. احتضان الأغشية لمدة 1 دقيقة في حجم المعزز التوهج كاشف كافية لتغطية كامل الأغشية. تجف الأغشية باستخدام ورق الترشيح.
  3. ضع الأغشية في محلل صورة الانارة لتصور العصابات مناعيا.
    1. بدلا من ذلك، نفذ الكشف عن عصابات مناعيا باستخدام الحساسة أفلام X-راي.
  4. غسل الأغشية 3X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: في هذه الخطوة الأغشية يمكن أن تبقى جافة. ومع ذلك، إذا كان المطلوب المزيد من تجريد، فمن الأفضل لأداء تجريد قبل التجفيف الغشاء. يمكن أيضا تخزين الأغشية لفترة قصيرة في برنامج تلفزيوني.
  5. لالأغشية التي لا تتطلب تجريد بين الحضانة مع الأجسام المضادة (انظر الشكل 1) الانتقال مباشرة إلى الخطوة5.20.
  6. عندما تجريد مطلوب بين الأجسام المضادة (انظر الشكل 1)، احتضان الأغشية في مرحلة ما قبل حرارة حل تجريد تحتوي على 2٪ SDS، 62.5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 (RT) و 0.7٪ β المركابتويثانول في ده 2 O في 50 ° C لمدة 20 دقيقة في إطار التحريض منتظم. غسل الأغشية 3X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: الانفعال أثناء إجراء تجريد هو مفتاح الحل. تجريد لا يمكن أن يؤديها في فرن التهجين. بدلا من ذلك، وتجريد يمكن القيام بها باستخدام الأغشية مختومة في أكياس بلاستيكية ومغمورة في حمام مائي. في هذه الحالة، فمن المهم أن تستنهض الهمم الأغشية 4-5 مرات خلال الحضانة.
  7. احتضان الأغشية لمدة 1 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني-T-الحليب.
  8. كرر الخطوات 5،12-5،16 وفقا لشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 2 صورة طخة مناعية نموذجية من IRF3 الكشف مع IRF3 مجموع الأجسام المضادة والأجسام المضادة IRF3-phosphospecific ضد Ser396 وSer398 بعد قرار من WCE التي كتبها عالية الدقة SDS-PAGE. في الخلايا A549 unstimulated، تم الكشف عن IRF3 كما شريطين في 50 و 53 كيلو دالتون على SDS-PAGE المقابلة لغير فسفرته (النموذج الأول) وhypophosphorylated (النموذج الثاني) نوعا من IRF3. تعرض خلايا A549 لSEV عن 3-9 النتائج ساعة في التحو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

البروتوكول وصفنا هنا يتكون من مزيج من عالية الدقة SDS-PAGE والأم-PAGE بالإضافة إلى استخدام العديد من الأجسام المضادة phosphospecific لتمييز أحادى / مثنوي وphosphoforms I-IV من IRF3. كشف المناسب من هذه الأنواع IRF3 ضروري لتوصيف كامل تفعيل IRF3 في وضع معين. على سبيل المثال، LPS تحفيز الضامة تفعيلها يؤدي إلى تشكيل مثنوي، Ser396 / 398 IRF3 مفسفر الذي يظهر hypophosphorylated (النموذج الثاني)، ولكن ليس hyperphosphorylated (النموذج الثالث والرابع)، ونمط في SDS-PAGE 15. باستخدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون أعضاء المختبر السابقين والحاليين على تطوير البروتوكولات. تم دعم العمل بتمويل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) [منحة # MOP-130527] ومن مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا [NSERC-355306-2012]. حصلت NG على كرسي أبحاث من المستوى الثاني في كندا. يحمل AR منحة دراسية من البرنامج التدريبي لشبكة أبحاث صحة الجهاز التنفسي من Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
F12 / HamLife Technologies11765-054دافئ في 37 درجة ؛ حمام C قبل الاستخدام.
مصل الجنينالبقري تقنيات الحياة12483-020
تقنيات حياة L-glutamine25030-081
D-PBSLife Technologies14190-144لزراعة الخلايا.
التربسين / EDTA 0.25٪لايف تكنولوجيز25200-072
فيروس سينداي سلالة كانتيلمختبرات نهر تشارلز600503
هيبسبيوشوبHEP001
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)بيوشوبSOD001.5
EDTABioshopEDT001
الجلسرينBioshopGLY001.1اقطع طرف الطرف والماصة ببطء لأنها سميكة جدا.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771علامة تجارية مسجلة تتوافق مع Octylphenoxy poly (ethyleneoxy) ethanol (Nonidet P-40) منظف
LeupeptinBioshopLEU001
AprotininBioshopAPR600.25  
فلوريد الصوديومسيجما ألدريتش201154
أورثوفاناديت الصوديومMP Biomedicals159664تنشيط أورثوفاناديت الصوديوم 0.2 م: 1) اعادلت الرقم الهيدروجيني إلى 10.0 باستخدام إما 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم أو 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريد. قد يختلف الرقم الهيدروجيني الأولي لمحلول أورتوتوفانادات الصوديوم باختلاف الكثير من المواد الكيميائية. 2) المحلول أصفر عند درجة الحموضة 10.0. 3) يغلي حتى عديم اللون. 4) تبرد إلى RT. 5) أعد ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10.0 وأعد الخطوات من 3 إلى 4 حتى يظل المحلول عديم اللون ويستقر عند 10.0. قم بتخزين حصص أورثوفاناديت الصوديوم المنشط عند -20 درجة مئوية.
p-nitrophenyl فوسفات ملح ثنائي الصوديوم سداسي هيدراتسيجما ألدريتشP1585
بيتا جليسيروفوسفاتسيجما ألدريتشG6376   ؛
كاشف فحص البروتين Bio-Rad بيو راد500-0006 سام للخلايا
أكريلاميد / بيس أكريلاميد (37.5: 1) 40٪BioshopACR005   ؛سام للخلايا
Tris-BaseBioshopDEO701
حمض الهيدروكلوريك (HCl) LabChemLC15320-4   ؛العمل تحت غطاء الدخان. سامة ومهيجة.
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)BioshopSDS001.1 مثير.
أمونيوم بيرسولفاتسيجما ألدريتشA3678
TEMEDInvitrogen15524-010سام ومهيج.
بروموفينول الأزرقفيشر ScientificB392-5
بيتا ميركابتو إيثانولسيجما-ألدريتشM6250العمل تحت غطاء الدخان. سامة للجهاز العصبي والأغشية المخاطية. قد تكون سامة للجهاز التنفسي العلوي والعينين والجهاز العصبي المركزي.
جلايسينبيوشوبGLN001.5
ديوكسي كولات الصوديومسيجما-ألدريتشD6750
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)BioshopSHY700 مثير.
غشاء النيتروسليلوز (0.45 مم)Bio-Rad162-0115
حمض الخليكالجليدي BioshopACE222.4العمل تحت غطاء الدخان. سامة ومهيجة وقابلة للاشتعال.
أحمر ponceauسيجما ألدريتشP3504   
كلوريد البوتاسيوم (KCl)سيجما ألدريتشP3911   ؛لتكوين PBS للبقع المناعية.
Na2HPO4BioshopSPD307.5لتكوين PBS للبقعة المناعية.
KH2PO4Sigma-AldrichP0662 لتكوين PBS للبقع المناعية.
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA7906لتكوين PBS-T-BSA للبقعة المناعية.
الحليب الجاف الخالي من الدسمقرنفل
بولي سوربات 20 (توين)MP Biomedicals103168قطع طرف الطرف والماصة ببطء لأنها سميكة جدا.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-America18783Store مقتبسة عند -20 o< / sup>C. تجنب التجميد / الذوبان.
Anti-IRF-3-P-Ser396محلي الصنع19Store في -80 oC. تجنب التجميد / الذوبان.
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) CellSignaling Technology4947sيخزن في -20 o< / sup>C.
Anti-IRF-3-P-Ser398صنع منزلي15Store في -80 oC. تجنب التجميد / الذوبان.
مضاد ل IRF-3 كامل الطولActifالشكل 39033تخزين مقتبس عند -80 o< / sup>C. تجنب التجميد / الذوبان.
Anti-IRF3-NESIBL-America18781Store مسعرة في -20 o< / sup>C.
كاشف التلألؤ الكيميائي الغربي بالإضافة إلىPerkin-Elmer Life SciencesNEL104001EA
LAS4000mini جهاز كاميرا CCDللرعاية الصحية
GE SDS-PAGE ، تخزين Bio-Rad161-0317واسع النطاق مقتبس عند -20 o< / sup>C.
معايير الوزن الجزيئي

المراجع

  1. Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
  2. Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
  3. Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
  4. Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
  5. Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
  6. Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
  7. Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
  8. Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
  9. Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  10. Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
  11. Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
  12. Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
  13. Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
  14. Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
  15. Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
  16. Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).
  17. Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
  18. Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
  19. Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
  20. Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
  21. Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
  22. Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
  23. McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
  24. Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).
  25. Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  28. tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
  29. Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
  30. Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

IRF3 SDS PAGE Native PAGE
A عالية الدقة الطريقة لرصد تفعيل الفسفرة التي تعتمد من IRF3
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.