مقالة منهجية

والكمي Glycomics والبروتيوميات المشتركة الاستراتيجية تنقية

DOI:

10.3791/53735

⸱

مارس 8, 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, North Carolina State University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير بروتوكول عالي الإنتاجية لتنقية البروتينات والجليكوميكس المدمجة والقياس الكمي LC-MS / MS في البلازما. كان تحليل إزالة التآكل لأشكال الجليكوزيل المرتبطة ب N خاصا بالمواقع منزوعة الجليكوزيلات. تم تحقيق القياس الكمي الدقيق ل N-glycans عن طريق اقتران المرشح بمساعدة فصل N-glycan إلى تطبيع الفردية عند وضع العلامات باستخدام استراتيجية علامات هيدرازيد الجليكان.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك رغبة متزايدة في العلوم البيولوجية والسريرية لدمج وربط فئات متعددة من الجزيئات الحيوية لكشف علم الأحياء ، وتحديد المسارات ، وتحسين العلاج ، وفهم المرض ، والمساعدة في اكتشاف المؤشرات الحيوية. يعد الارتباط بالجليكوزيل المرتبط ب N أحد أهم وأقوى تعديلات ما بعد الترجمة على البروتينات وينظم وظائف الخلية الحرجة مثل الإشارات والالتصاق والوظيفة الأنزيمية. ظلت التقنيات التحليلية لتنقية وتحليل N-glycans ثابتة نسبيا خلال العقد الماضي. على الرغم من دقتها وفعاليتها ، إلا أنها تتطلب عادة خبرة وموارد كبيرة. على الرغم من تطوير بعض مخططات التنقية عالية الإنتاجية ، إلا أنها لم تجد بعد اعتمادا واسع النطاق وغالبا ما تعتمد على إثراء الجليكوببتيدات. تم عرض إحدى الطرق الواعدة ، التي طورها توماس أوتس وآخرون ، وفصل N-glycan بمساعدة المرشح (FANGS) ، نوعيا على الأنسجة. هنا ، قمنا بتكييف FANGS مع البلازما وربطناها بتطبيع الفردية عند وضع العلامات باستخدام استراتيجية علامات هيدرازيد الجليكان من أجل تحقيق القياس الكمي النسبي الدقيق عن طريق قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة وتأين الرش الكهربائي المعزز. علاوة على ذلك ، قمنا بتصميم وظائف جديدة للبروتوكول من خلال تحقيق تحليل موقع التجانس جنبا إلى جنب والبندقية وتحليل موقع الارتباط بالجليكوزيل على بلازما الدجاجة. أظهرنا أن N-glycans المنقاة على المرشح والمشتقة من علامات الهيدرازيد الكارهة للماء كانت قابلة للمقارنة من حيث الوفرة والطبقة لتلك التي يتم استخلاصها عن طريق استخراج الطور الصلب (SPE). يعتبر هذا الأخير معيارا ذهبيا في هذا المجال. الأهم من ذلك ، أن التباين في البروتوكولين لم يكن مختلفا إحصائيا. البيانات البروتينية التي تم جمعها بما يتماشى مع بيانات السكر في الدم كان لها نفس العمق مقارنة بملخص التربسين القياسي. يتم تقليل إزالة الببتيد في البروتوكول ، مما يحد من إزالة التآكل غير المحدد الذي تم اكتشافه في أشكال الارتباط بالجليكوزيل. سمح ذلك بتحليل موقع الغليكوزيلات المباشر ، على الرغم من أن البروتوكول يمكن أن يستوعب 18O وضع العلامات أيضا. بشكل عام ، أظهرنا بروتوكولا جديدا عالي الإنتاجية وغير متحيز قائم على المرشح لتحليل السكر الكمي والبروتينات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في مجال البروتينات، وقد اعتمدت على نطاق واسع مرشح بمساعدة إعداد العينات (FASP) لقدرته على تقليل كمية من المواد ابتداء، والحد من القطع الأثرية وإعداد العينات، وتحقيق أقصى قدر من الإنتاجية عينة 1. ومع ذلك، فإن مثل هذا الأسلوب حتى باتت وكسب الجر مجال glycomics. تطوير الإنتاجية العالية، وهناك حاجة سير العمل الكمية نظرا للدور لا يتجزأ من بالغليكوزيل في الدفاع البيولوجي وتعديل من قبل السرطان أو أمراض 2،3. في الثدييات، وتتكون -glycans N من تكرار وحدة السكريد (hexoses (عرافة)، hexosamines (HexNac)، والأحماض اللعابي (NeuAc)، وfucoses (الجبهة المتحدة))، التي تزين بنية الأساسية (عرافة 3 HexNac 2) 4 ملزمة تساهميا لالهليونين. على الرغم من أن glycospace هو كبير إلى حد كبير عندما تحسب أيزومرات (> 10 12)، أنها صغيرة جدا على أساس تكوين والأوزان الجزيئية تتراوح عادة من 1،000-8،000 دا 5 </ سوب>. التجانس التركيبي للطبقة وhydrophilicity من glycans تحديات فريدة لتنقية وفصل، ومطياف الكتلة (MS) سير العمل 6.

تقليديا، يتم هضمها N -glycans من البروتينات أو الببتيدات التي كتبها peptide- N -glycosidase F (PNGase F) ومن ثم إثراء كتين تقارب اللوني 7، استولت عليها الخرز هيدرازيد 8، أو تنقيته عن طريق استخراج المرحلة الصلبة (SPE) 9،10. في حين أن هذه الأساليب كلها فعالة للغاية، وتقديم خطوات إضافية لتحلية والحد من عدد من عينات معالجة في وقت واحد. على مدى العقد الماضي، وقد تم اقتراح عدد من منصات عالية الإنتاجية لglycomics. كيم وآخرون نشرت طريقة شبه الآلي باستخدام تعمل فراغ، لوحة SPE 96-جيدا 11. بدلا من ذلك، تم تطوير وسيلة تقارب فلتر (N--glyco FASP) من قبل مجموعة مان، الذي يتطلب اشتقاق الأولي للفايlter مع مزيج مركب من يكتينس 12. وأخيرا، اقترح الفريق توماس أوتس طريقة شبه الكمية، وتصفية بمساعدة N الفصل -Glycan (الأنياب)، التي استغلت حجم التكوين الضيق للglycospace 13. الاعتماد على الوزن الجزيئي قطع المرشحات، وجرفت المياه الملوثة صغيرة أولا أن تضيع ثم تم هضم -glycans N ومزال. تبقى البروتينات Deglycosylated على مرشح في هذا البروتوكول، ويمكن أن تخضع لFASP في الخط.

تحديد وتقدير من glycans بواسطة تأين بالإرذاذ الإلكتروني (ESI) MS يتطلب خارج خط فصل للقرار (جزئي) من سداسي واشتقاق للكشف عن الأنواع المنخفضة للوفيرة. وضع العلامات في الفردانية عندما تطبيع مع استراتيجية علامات هيدرازيد غليكان يمنح التوافق مع اللوني العكسية مرحلة السائل (RPLC) 14،15. 4-phenethyl-benzohydrazide (P2PGN) العلامة مسعور تتوسط في hydrophilicity من glycans، ENHancing التأين التي، في المتوسط، أربعة أضعاف (16). على الرغم من التقنيات الأخرى، مثل permethylation 17 أو أمين رد الفعل كيمياء علامات 18، توفر مزايا مماثلة، في رد فعل هيدرازيد، وكان رد فعل glycans 1: 1 stoichiometrically في الظروف السهلة. ويتحقق الكمي النسبي عن طريق تحليل جنبا إلى جنب من عينات derivatized مع الأم (NAT) أو 13 C 6 تسميات مستقر النظائر (سيل).

الأسلوب التالي تطور الأنياب لتطبيقات البلازما والأزواج إلى العلامة P2GPN مسعور لتقدير نسبي دقيقة. وعلاوة على ذلك، تم تصميمه لأداء البروتينات طلقة بندقية، والتنميط نزع الأميد، وglycomics الكمية على قسامة واحدة من العينة، دون المساس بسلامة التحليلات.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البروتين والبروتين السكري تمسخ والألكلة

  1. للتحضير القياسية، تحميل 2.5 ميكرولتر من 0.1 ميكروغرام حل / ميكرولتر من بروتين سكري (على سبيل المثال فتوين أو ريبونوكلياز B) على 30 كيلو دالتون أو 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي (MW) قطع التصفية.
    1. لعينات البلازما البيولوجية، والتحقق من تركيز البروتين من الأحماض القياسية برادفورد 19 أو bicinchoninic 20 (BCA) بروتين الفحص. تمييع البلازما، وإذا لزم الأمر، مع 100 ملي بيكربونات الأمونيوم (NH 4 HCO 3) في H 2 O (PNGase دايجست الواق) في الرقم الهيدروجيني من ~ 7 لاحتواء بين 10-100 ملغ / مل البروتين الكلي. تحميل 2.5 ميكرولتر البلازما (25-250 البروتين ميكروغرام) على مرشح.
      ملاحظة: فقط تم اختبار هذا البروتوكول على البلازما من عينات الدم التي تم جمعها في وجود ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA).
  2. إضافة 2 ميكرولتر من 1 M Dithiothreitol الحل (DTT) على كل عينة في التصفية.
  3. تمييع العينة مع 200 ميكرولتر PNGase هضم العازلة.
  4. غطاء الأنبوب فلتر عينة وبخفة دوامة، والحرص على عدم تعكير صفو مرشح من مقعدها. احتضان العينة على 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتفسد البروتينات وبروتينات سكرية.
  5. ليؤلكل العينات، إضافة 50 ميكرولتر 1 م Iodoacetamide، لإعطاء تركيز النهائي من ~ 200 ملم، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: إذا لم يتم المطلوب تحليل البروتينات، خطوة 1.5 قد يتم تخطي.
  6. تركيز بروتين سكري التشويه والتحريف على مرشح من قبل الطرد المركزي العينات في 14000 x ج لمدة 40 دقيقة. تتدفق من خلال تجاهل.

2. N -linked غليكان الأنزيمية الهضم

  1. غسل العينة مع 100 ميكرولتر PNGase الهضم العازلة. تركيز بروتين سكري على مرشح في 14000 x ج لمدة 20 دقيقة، وتتدفق من خلال تجاهل.
    1. كرر الخطوة غسل والتركيز مرتين، ليصبح المجموع ثلاث مرات، مما أسفر عن التركيز في حجم القتلى مرشح (~ 5 ميكرولتر). تجاهل كلتتدفق من خلال.
    2. تجاهل قارورة جمع مرة يغسل كاملة. جمع كل eluents ويغسل في المستقبل في قارورة جمع جديدة.
      ملاحظة: PNGase هضم عازلة في H 2 O 18 يمكن استخدامها أثناء الخطوة الهضم PNGase F لوضع العلامات النظائر المستقرة من مواقع الهليونين دي الغليكوزيلاتي، والتي أصبحت deamidated كيميائيا.
  2. إضافة 2 ميكرولتر خالية من الجلسرين PNGase F (75،000 وحدة س / مل) لتصفية بعد نقل إلى قارورة جمع جديدة. إضافة 98 ميكرولتر من PNGase هضم عازلة، ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر، وبلطف ماصة صعودا وهبوطا على مرشح لخلط. إنزيمي هضم glycans في ظل الظروف خطوات 2.2.1، 2.2.2، 2.2.3 أو.
    ملاحظة: يمكن استخدام ثلاثة أساليب لdeglycosylation من البروتينات. للتحليل فقط glycomics (لا البروتينات)، وأوصى حضانة طويلة في الخطوة 2.2.1. لglycomics والبروتينات البحوث، على بعد خطوات 2.2.2 و 2.2.3 سوف تنتج الببتيدات عالية الجودة مع الحد الأدنى من غير SP-نزع الأميد ecific.
    1. Glycomics فقط بروتوكول الهضم (18hr): احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة ليلتصق إنزيمي كل -glycans N.
    2. ارتفاع في بروتوكول الهضم (SPI): احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. العمل بسرعة، وإزالة عينات وارتفاع في 2 ميكرولتر إضافية خالية من الجلسرين PNGase F (75،000 وحدة س / مل). بخفة دوامة العينات لمدة 1-2 ثانية إلى المزيج. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إضافية.
    3. بروتوكول الميكروويف الهضم (MD): مكان العينات في رف أنبوب microcentrifuge العائمة. عينات تطفو في كوب 1 لتر مليئة 1 لتر من الماء (DI) منزوع الأيونات. ضع الكأس في وسط فرن الموجات الدقيقة (950 واط) مع لوحة الدورية. ميكروويف في 60٪ من الطاقة (570 W) لمدة 5 دقائق. لتبرد، وإزالة عينات وعقد في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. ثم الميكروويف لمدة 5 دقائق إضافية في السلطة 60٪.
      سوف تحتاج إلى تعديل على أساس انتاج الطاقة القصوى من الميكروويف إعدادات الطاقة ميكروويف: ملاحظة.ينبغي أن تعقد متوسط ​​القوة المستمر بين النماذج.

3. شطف ن -glycans

  1. أزل glycans بواسطة الطرد المركزي في العينة 14000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من PNGase هضم عازلة لمرشح وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية. جمع الغسيل التي تحتوي على أي المتبقية N -linked غليكان، في نفس القارورة جمع كما شاطف. كرر مرتين. إزالة الفلتر ووضعه في قارورة جمع جديدة.
  3. احتضان عينات غليكان في الفريزر -80 درجة مئوية حتى المجمدة (30-60 دقيقة). الجاف على الانتهاء، في درجة حرارة الغرفة، في المكثف فراغ (4-6 ساعة).
    ملاحظة: لا يمكن تخزين -glycans في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر قبل اشتقاق.

4. البروتين FASP الهضم

ملاحظة: إذا لم يتم المطلوب البروتينات أو تحليل الموقع نزع الأميد، المادة 4 من البروتوكول قد يتم تخطي.

  1. شطف رانه تصفية، التي تحتوي على الببتيدات deamidated، مع 400 ميكرولتر من العازلة 8 M اليوريا. تتويج القارورة جمع وبخفة دوامة لخلط. التركيز على مرشح في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة. تجاهل كل التدفق من خلال.
    1. كرر الخطوة 4.1 مرتين إضافية، ليصبح المجموع ثلاثة يغسل العازلة اليوريا.
  2. شطف التصفية، التي تحتوي على الببتيدات deamidated، مع 400 ميكرولتر من 2 M اليوريا و 10 ملي CaCl 2 العازلة (التربسين هضم عازلة). تتويج القارورة جمع وبخفة دوامة لخلط. التركيز على مرشح في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة. تجاهل كل التدفق من خلال.
    1. كرر الخطوة 4.1 مرتين إضافية، ليصبح المجموع ثلاثة التربسين هضم يغسل العازلة.
    2. تجاهل قارورة جمع مرة يغسل كاملة. جمع كل eluents ويغسل في المستقبل في قارورة جمع جديدة.
  3. إضافة 50 ميكرولتر الخنازير التربسين تعديل في 1:50 أو 1: 5 التربسين: البروتين (ث / ث) نسبة لاكتشاف أو البروتينات الكمية التجارب، على التوالي.تتويج القارورة جمع وبخفة دوامة لخلط.
  4. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. العمل بسرعة، وإزالة عينات وارتفاع في 50 ميكرولتر إضافية من التربسين في 1:50 أو 1: نسبة البروتين: التربسين 5. بخفة دوامة العينات لمدة 1-2 ثانية إلى المزيج. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إضافية.
  5. أزل الببتيدات التي تدور في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  6. شطف الببتيدات المتبقية من تصفية مع حمض الفورميك 400 ميكرولتر 1٪ و 0.001٪ Zwittergent 3-16 (عازلة إخماد). أزل من مرشح من قبل الغزل في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  7. قياس تركيز الببتيد في عينات من برادفورد 19 أو BCA مقايسة 20.
  8. احتضان عينات الببتيد في الفريزر -80 درجة مئوية حتى المجمدة (30-60 دقيقة). الجاف على الانتهاء، في درجة حرارة الغرفة، في المكثف فراغ (4-6 ساعة).
    قد يتم تخزين المجفف الببتيدات في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر: ملاحظة.
  9. و resuspend البروتينات زيتية قبيل LIQUIد اللوني الكتلة الطيفي (MS-LC) تحليل في 2٪ الأسيتونتريل، 98٪ H 2 O، وحمض الفورميك بنسبة 0.1٪ (المرحلة المحمول أ) إلى التركيز المطلوب. تركيزات الببتيد زيتية من 2.5 ميكرولتر مجموعة البلازما 100-300 نانوغرام / ميكرولتر.

5. اشتقاق من N -linked Glycans مع مسعور هيدرازيد الكلمات

  1. إعادة المجففة الثقيلة (سيل) أو ضوء (NAT) الكواشف P2GPN في 1 مل من 75:25 MeOH: حمض الخليك (حل اشتقاق)، لتركيز النهائي من 0.25 ملغ / مل. والكواشف يستغرق فترة تصل الى 10 دقيقة لإذابة تماما. على نطاق واسع دوامة لضمان ذوبان كامل.
    ملاحظة: في حال تم استخدام هذا البروتوكول اشتقاق مع -glycans N المعيار، مقابل glycans النقاء، ونسبة المولي من P2GPN: غليكان يجب أن يكون حوالي (ولا أقل) من 17: 1.
  2. العلامة المجففة N -glycans مع 200 ميكرولتر (50 ميكروغرام) من سيل أو NAT P2GPN كاشف. ماصة صعودا وهبوطا ل resuspend glycans المجففة. دوامة ساmples ثم تدور باستمرار عينات ل~ 5 ثانية على مقعد بين كبار الطرد المركزي.
  3. الرد على glycans مع كاشف لمدة 3 ساعة على 56 درجة مئوية.
  4. التحرك فورا glycans من الحاضنة إلى المكثف فراغ. الجاف على الانتهاء في 55 ° C (3-5 ساعة).
    ملاحظة: هذه الخطوة يروي رد فعل اشتقاق. يجب أن يكون عينة يجف تماما لمنع انتقال التفاعل في الخطوات اللاحقة.
    قد يتم تخزين العينات المجففة، الموسومة في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر: ملاحظة.
  5. المعلمة و resuspend -glycans N في 25-50 ميكرولتر من H 2 O فقط قبل التحليل LC-MS. ماصة صعودا وهبوطا لضمان N -glycans هي بالفاعلات تماما.
    ملاحظة: حجم لإعادة تعليق يعتمد على تركيز الانطلاق من بروتين سكري، الذي يمكن تقدير من تركيز البروتين البداية. ومع ذلك، فإن مجموعة تختلف حسب نوع العينة ويجب أن يكون الأمثل بشكل فردي.
  6. عينات الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant، والحرص على عدم السماح لطرف ماصة لمس الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي.
    ملاحظة: العلامة الزائدة قد لا تكون مرئية للعين، ولكن سيتم تخفيض بواسطة الطرد المركزي.
  7. الجمع بين زوج من عينات NAT وسيل، إذا رغبت في ذلك لتقدير نسبي في نسبة 1: 1 لتحليل جنبا إلى جنب.

6. فائق الضغط اللوني السائل وتحليل الطيف الكتلي

ملاحظة: LC وMS الشروط الموضحة لسهلة NLC-1000 وحقل العليا س Exactive، على التوالي، والأمثل في المنزل لتحليل البروتينات وتحليل غليكان 21. يمكن تكييف هذه الظروف لأنظمة LC أخرى فائقة pressure- أو نانو وغيرها من الطيف كتلة حل السلطة عالية ولكنها قد تتطلب تعديلات طفيفة. استخدام عالية حل الطيفي السلطة ضروري لتحديد غليكان وتحليل نزع الأميد 22،23.

ملاحظة: خطوات 6،1-6،3 يمكن أن تكون الصورةkipped إذا تم استخدام أحد المناسب عكس المرحلة اللوني أو فخ التجاري التفاعل ماء والعمود.

  1. توليف فريت في شعري الرقم 100 ميكرومتر وفقا لميرينغ وآخرون. (24) لاستخدامها في فخ.
  2. حزمة فخ تحت الضغط مع 2.6 ميكرومتر، 100 أ، ج 18 مواد التعبئة والتغليف وقطع لطول 5 سم.
  3. حزمة 75 ميكرومتر العمود باعث معرف تحت الضغط مع 2.6 ميكرومتر، 100 أ، ج 18 مواد التعبئة والتغليف وقطع لطول 30 سم.
  4. إعداد طريقتين مختلفتين LC-MS لالبروتينات (6.4.1) وglycomics (6.4.2) سير العمل.
    ملاحظة: يمكن تشغيل البروتين وعينات غليكان على نفس الإعداد فخ / عمود في أي أمر.
    1. لتحليل البروتين، وضخ ~ 400 نانوغرام من البروتين على العمود في مرحلة الأجهزة المحمولة (MPA). تشغيل العينة على 300 نيكولا لانغ / دقيقة، وفقا للجدول 1، مع 1 ميكرولتر قبل العمود موازنة (500 بار) و 5 ميكرولتر العمود التحليلي موازنة(500 بار). تأين البروتينات وفقا للشروط MS الواردة في الجدول 2.
    2. لتحليل غليكان، حقن 5 ميكرولتر من معلق، الموسومة P2GPN NAT / سيل عينات متساوي المولية على العمود. تشغيل العينة على 300 نيكولا لانغ / دقيقة، وفقا للجدول 3، مع 2 ميكرولتر قبل العمود موازنة (500 بار) و 5 ميكرولتر تحليلية موازنة عمود (500 بار). تأيين glycans في ظل الظروف MS الواردة في الجدول (4).
مرة ٪ MPA ٪ MPB
0 100 0
5 98 2
105 80 20
135 68 32
136 5 95
151 5 95
152 100 0
167 100 0

تم تنفيذ الجدول 1. شروط LC للتحليل البروتين. وشطف التدرج مع الطور المتحرك ب (ام. بي، 98٪ الأسيتونتريل، 2٪ H 2 O، 0.1٪ حمض الفورميك) إلى أزل الببتيدات لالبروتينات طلقة بندقية، التي تعتمد على الاستحواذ البيانات والتجارب MS.

MS 1 معلمات
المدى كتلة (ث) 375-1500
قرار 120000
AGC 1 × 10 6
ماكس التأين الوقت 30
S-عدسة FR مستوى 55
الشعرية تيمالكمبيوتر) 300
رذاذ الجهد 1.75
MS 2 معلمات
اكتساب نوع TOP20
قرار 15000
AGC 1 × 10 5
ماكس التأين الوقت 30
نسبة Underfill 2٪
العزلة النافذة (ث) 1.4
استبعاد تهمة الدولة +1
تطبيع اصطدام الطاقة 27
الوقت الاستبعاد (ق) 20

الجدول 2: شروط MS لتحليل البروتين المعلمات من أجل تأين بالإرذاذ الإلكتروني، MS 1 الاستحواذ، وMS 2 الاستحواذ في صك orbitrap باستخدام dissociatio للطاقة أعلى.يتم إعطاء ن (HCD).

مرة ٪ MPA ٪ MPB
0 95 5
1 70 30
41 60 40
46 37 63
47 10 90
55 10 90
56 95 5
66 95 5

الجدول 3: شروط LC للتحليل غليكان أجري شطف الانحدار إلى أزل هيدرازيد الموسومة N -glycans لتحليل MS.

MS 1 معلمات
المدى كتلة (ث) 600-1900
قرار 60000
AGC 5 × 10 5
ماكس التأين الوقت 64
S-عدسة FR مستوى 65
شعري درجة الحرارة (° C) 325
رذاذ الجهد 1.75
MS 2 معلمات
اكتساب نوع Top12
قرار 15000
AGC 5 × 10 4
ماكس التأين الوقت 100
نسبة Underfill 1٪
العزلة النافذة (ث) 1.4
ثابت قداس الأولى 125
صعدت تطبيع اصطدام الطاقة 10/20/30
استبعاد الوقت (ثانية) 15

الجدول 4: شروط MS لهيدرازيد الموسومة N تحليل -glycan المعلمات من أجل تأين بالإرذاذ الإلكتروني، الذي يتم إعطاء MS 1 الاستحواذ، وMS 2 الاستحواذ في صك orbitrap باستخدام التفكك للطاقة أعلى (HCD).

7. البروتيوميات وتحليل نزع الأميد

  1. تحديد البروتينات / الببتيدات استخدام أدوات البحث المعلوماتية الحيوية القياسية.
    ملاحظة: تم تصميم بروتوكول التحليل التالي باستخدام قواعد البيانات السويسري بروت / TrEMBL في UniprotKB والبحث عبر SEQUEST في بروتيوم مكتشف 1.4 البرنامج، ومع ذلك، فإن البروتوكول يمكن ترجمتها مباشرة إلى أي محرك بحث البروتين والتسجيل باستخدام برنامج واجهة المستخدم الرسومية. جميع الأوامر الواردة أدناه يمكن الوصول إليها في واجهات البرامج من خلال القوائم المنسدلة.
    1. أنشئ أو تحميل كائن حي المناسب تسلسل البروتين قاعدة البيانات من بيانات الجينوم أو قواعد البيانات بروتيوم المتاحة كما وصفها Apweiler وآخرون. 25
      ملاحظة: تشمل قواعد البيانات بروتيوم المشتركة السويسري بروت، TrEMBL، وNCBI، ولكن قد تكون بنيت من البيانات في المنزل أيضا.
  2. في داخل البرنامج، واختيار محرك البحث في قاعدة البيانات والمعلمات مختارة وفقا لنوعية البيانات التي حصل عليها وrigorousness للبحث المطلوب، كما وصفها بيركنز وآخرون. لالتميمة 26 أو المهندس وآخرون لSEQUEST 27.
    1. للحصول على بيانات عالية الدقة الشامل، تعيين المعلمات للبحث في البرنامج على النحو التالي: ماكس 2 غاب عن الانشقاقات، 5 جزء في المليون السلائف التسامح الشامل، و0.02 دا جزء التسامح الشامل (لالأمثل كشف دقيق نزع الأميد 22) وتشمل التعديلات الببتيد زيتية التالية : "carbamidomethyl (C)" تعديل ثابت و"نزع الأميد (N / Q)" و "ثورidation (M) "التعديلات الديناميكية. إذا كنت تستخدم 18 يا الهضم وضع العلامات، وتشمل" نزع الأميد 18 O (1) "باعتبارها تعديل ديناميكية إضافية.
    2. البحث باستخدام محرك المختارة، البيانات الببتيد الخام مقابل قاعدة بيانات البروتين (7.1.1).
      ملاحظة: يجب التحمل الجماعي يكون مناسبا لالأداة المستخدمة ويست منخفضة بشكل تعسفي.
      ملاحظة: اكتمال وظيفة البحث تلقائيا من قبل البرنامج باستخدام محرك البحث مختلف خوارزميات محددة. ويعمل الخوارزمية راووق (التميمة)، SEQUEST، أو مجموعات أخرى من خوارزميات لتحديد البروتينات من الببتيدات وليسجل صحة الضربات. وتغطي مزيد من المعلومات حول الأدوات المتاحة في مراجعة من غونزاليس Galarza آخرون 28،29. اعتمادا على البرنامج، قد تحتاج إلى اختيارها وفقا للسلطة التقديرية للمستخدم المعلمات بحث إضافية.
  3. تصدير الببتيدات التي تم تحديدها لكرأيشن اليدوي وفورثتحليل إيه.
  • الإشراف على قائمة من الببتيدات التي تحتوي على نزع الأميد التعرف على الهليونين من N يدويا -linked عزر بالغليكوزيل (NX- (S / T)، حيث X ≠ P). عبر التحقق من صحة هذه المواقع بزخارف بالغليكوزيل معروفة من الأدب وإنشاء اثنين من حمامات النتائج (التحقق من صحة ونظري).
  • استخدام العد الطيفي 30 مقارنة الإشغال في المئة من موقع بالغليكوزيل تعطى عن طريق مقارنة وفرة من أشكال deamidated وغير deamidated.

    • 8. الكميات النسبية غليكان

    ملاحظة: تم الانتهاء من تحديد وتقدير التالية باستخدام برنامج XCalibur. ومع ذلك، أي البرنامج الذي يحلل البيانات الخام وتلقائيا يدمج قد تكون بديلا قمم الكروماتوغرافي.

    1. إنشاء قائمة النظرية من المؤلفات غليكان من التوليفات الممكنة بيولوجيا hexoses، ديوكسي-hexoses، hexosamines والأحماض اللعابي، وغيرها من ساccharides. لهذا الغرض، وقد تم نشر قاعدة بيانات غليكان الإنسان ووكر وآخرون. 15، ويمكن استخدامه كما هو. لقواعد البيانات النظرية، يجب فرض قيود البيولوجية أنواع محددة على مساحة اندماجي، ويتم وصف هذه القواعد Kronewitter وآخرون. 31.
    2. حساب الجماهير monoisotopic غليكان (M) من الكتل الذرية للكل تكوين للدول تهمة بروتون + 1-3. تعديل الجماهير monoisotopic لتشمل إضافة NAT (254،14191 غ / مول) أو سيل (260.162042 غ / مول) العلامة P2GPN.
    3. فتح برنامج "الإعداد تجهيز" من وجهة النظر خارطة الطريق في XCalibur. إنشاء طريقة معالجة كما هو موضح بالضبط في المواد التكميلية من ووكر وآخرون. 15 استخدام قائمة التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.2 يحتوي على الجماهير monoisotopic النظرية ل[M + H] 1+، [M + 2H] 2+، و [ M + 3H] 3+ الأنواع.
      ملاحظة: لتأكيد هوية غليكان أبعد دقيقةكتلة، لNAT / سيل duplexed أشواط، فتأكد NAT وسيل N أزواج -glycan المشارك أزل مع الوقت الاحتفاظ نفسه. نوعيا، عبر التحقق من صحة تحديد الهوية مع أطياف MS 2، والذي يجب أن يحتوي على قمم تابعة لأوكسونيوم أيون سلسلة 32.
    4. تصدير، استخراج اللوني ايون متكامل (XIC) المناطق إلى Excel للحصول على الكميات المتوفرة من سيل وNAT كما هو موضح بالضبط في المواد التكميلية من ووكر وآخرون. 15
    5. في Excel، برنامج الخلايا في عمود جديد لحساب تصحيح الوزن الجزيئي التداخل عن طريق تعديل وفرة سيل وفقا للمعادلة التي نشرتها ووكر وآخرون 1 5:
      figure-protocol-1 ،
      حيث A هو ذروة monoisotopic والتداخل النظائر النظري، figure-protocol-2 قد يكون حساب مستقل في تكوينها.
    6. في العمود الثاني، برنامج الخلايا لتطبيع القنوات NAT وسيل باستخدام معادلة لمجموع عامل غليكان تطبيع (TGNF)، في الطيف، كما وصفها ووكر وآخرون 1 5:
      figure-protocol-3 ،
      حيث N هو عدد N -glycans فوق الحد الكمي.
    7. في عمود جديد، برنامج الخلايا لتأخذ نسبة من سيل: glycans NAT (أو العكس بالعكس) لحساب التغير أضعاف في تركيز بين العينتين.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    figure-results-1
    الشكل 1: يتم إعطاء مخطط طريقة الأنياب-P2GPN علامات مسعور جانب (الطريقة أ) لالبروتينات وglycomics جنبا إلى جنب تحليل الخطوات التي تختلف بين تجهيز وجنبا إلى جنب glycomics glycomics فقط وتحليل البروتينات، مع تحديد المواقع بالغليكوزيل، وتسليط الضوء عليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    وفي خط البروتينات وglycomics، تم التحقق القائم على تصفية P2GPN مسعور طريقة وضع علامات (الطريقة أ) لتحديد الهوية، والكميات، والوزن الجزيئي التحيز باستخدام الدجاجة المجمعة عينات البلازما (الشكل 1). لمجرد تجارب glycomics، بين المقارنات في وفرة N -glycans المستخرجة من طريقةأ إلى carbograph SPE (الذهب القياسية، الطريقة ب) قدمت (الشكل 2). لم تكن هناك اختلافات كبيرة في وفرة glycans بين الطريقتين. وجرى تقييم للالتباين داخل أيضا عن طريق قياس سيل: NAT نسبة glycans استخراج بنفس الطريقة. كان سجل 2 -distributions كل أساليب التمويه، تركزت على الصفر، ولا تختلف كثيرا (الشكل 3A-B). ويتراوح الوزن الجزيئي بين اثنين من بروتوكولات المتراكبة تماما، مما يشير إلى أن المرشح لا تميز N -glycans على أساس النطاق الوزن الجزيئي وhydrophilicity (الشكل 4).

    figure-results-2
    الشكل 2: مزيج متساوي المولية من NAT وسيل N -glycans المستخرجة من الطريقة أ أو الطريقة ب أعد من 2.5 ميكرولتر من البلازما الدجاجة (N = 4) وكانت عينات الشرج.yzed التي كتبها UPLC-MS وفقا لمعايير أوصى المقترح في القسم 6. والكميات المتوفرة لكل غليكان، في كل قناة NAT / سيل، وحسبت من خلال دمج المنطقة تحت اللوني ايون المستخرج (MMA = 3 جزء في المليون)، وتصحيح لالجزيئية الوزن التداخل، وضبط من قبل TGNF. وتظهر هذه النسب مع أخطائهم القياسية. وكانت الطريقة للتطبيق غير -glycans لا تختلف كثيرا (P> 0.05): وفرة من الطريقة ب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    figure-results-3
    الرقم 3: داخل التغير في (أ) الطريقة أ (N = 133) أو (ب) الطريقة ب (N = 123) ومقارنة الاستراتيجيات. NAT وسيل خليط متساوي المولية من -glycans N، من نفس نظام استخراج ، وقد تم تحليل أكثر من ثلاثة مكررات التقنية. تركزت سجل 2 -distributions على الصفر، وكانت لا تختلف كثيرا بين سير العمل اثنين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    figure-results-4
    وتمت مقارنة يتراوح الوزن الجزيئي للglycans من كل استراتيجية: الرقم 4. أسفرت سير العمل اثنين من glycans تمتد على نفس النطاق الوزن الجزيئي. N -glycans الكشف في بروتوكول واحد مقابل سقط الآخر فقط أعلى من الحد من الكشف (1 × 10 5 فرة) ولا تعكس تحيز منهجي. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

    ضمن الصفحات = "1"> الإبقاء على البروتينات deglycosylated بواسطة عامل تصفية الوزن الجزيئي تمكين في خط بروتيوم واسعة التحليل والموقع بالغليكوزيل تحديد الهوية. وتمت مقارنة بروتوكولات متعددة لتنقية جنبا إلى جنب من glycans والبروتينات لإعداد FASP التقليدي دون deglycosylation (الجدول 5). أدى لدينا نموذجي 18 ساعة مرشح القائمة على PNGase F الهضم، تليها FASP التربسين هضم (بروتوكول الأمراض المنقولة جنسيا) في مستويات عالية من نزع الأميد غير محددة، والتي يمكن أن تتداخل مع تحديد glycosites. لذلك، تم استكشاف طريقة الاستفادة من فترة حضانة أقصر عند درجة حرارة مرتفعة (50 درجة مئوية)، وخطوة ارتفاع في PNGase F (بروتوكول SPI) كبديل، جنبا إلى جنب مع بروتوكول الميكروويف الهضم (بروتوكول MD)، للحد من عدم نزع الأميد محددة. كانت glycans لوحظت في أساليب الهضم الجديدة لا تختلف كثيرا في التراكيب أو الكميات المتوفرة من القياسية 18 ساعة، 37 ° C مرشح PNGase F هضم ( (جدول رقم 5).

    البروتينات الببتيدات الببتيدات Deamidated Glycosites بروتينات سكرية
    + - + - + - + - + -
    FASP 3083 795 5 5
    18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18
    MD 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7
    SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8

    الجدول 5: المقارنة بين البيانات البروتين من التربسين القياسية هضم مقابل قدمت طريقة وضع علامات في خط الأنياب-P2GPN أجريت الاستعدادات مع (+) وبدون (-) PNGase F لتحديد معدلات خلفية نزع الأميد وتقدير غير محدد glycosite معدلات إيجابية كاذبة. وقد تم تحديد البروتينات مع 1٪ معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت)؛ تم تصفيتها الببتيدات على أساس "عالية" الثقة الببتيد في بروتيوم مكتشف 1.4 (ف <0.01)؛ تم identifi glycositesإد على أساس تسلسل فريدة من نوعها تحتوي على نزع الأميد من بالغليكوزيل عزر محفوظ (NXS / T)؛ وحددت بروتينات سكرية كما تحتوي على البروتينات التي تم تحديدها واحد على الأقل glycosite التي تم تحديدها.

    figure-results-5
    وقد وضعت تقصير بروتوكولات لglycans للحد من نزع الأمين في العينات ومقارنة مع 18hr الأنياب PNGase F هضم: الرقم 5. كان متوسط ​​الفروق في الكميات المتوفرة 10٪ و 5٪ للMD (2.2.3) وSPI (2.2.2) البروتوكولات، على التوالي. من 48 glycans التي تم تحديدها، عرض 90٪ أقل من التباين 1.5 أضعاف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    هناك حاجة إلى طرق كمية عالية الإنتاجية لتسهيل التحليل الروتيني للجليكان. على مدى الثلاثين عاما الماضية ، اقتصر تحليل السكريات على مجموعة فرعية من المجموعات البحثية ، على الرغم من أهميته في الأمراض والتطبيقات السريرية والمستحضرات الصيدلانية. تقوم طريقة تنقية FANGS-P2GPN ووضع العلامات على علم السكر والبروتينات بإجراء نفس التحليل على جزء واحد من العينة ، مما يقلل من تكلفة الإمدادات وكمية المواد المطلوبة (مهم بشكل خاص في الدراسات البشرية والفئران). علاوة على ذلك ، فإن الجهود المبذولة لتقليل التباين في المستحضرات مهمة للغاية ، حيث تساهم كل خطوة إضافية في الخطأ ، مما قد يخفي تغييرات مهمة ولكنها منخفضة وفرة في دراسات الحالات والشواهد. يسمح اقتران FANGS بوضع علامات الهيدرازيد الكارهة للماء بتشغيل عينات البروتين والجليكان على نفس عمود RPLC ، ويعزز تأين الجليكان ، ويوفر القياس الكمي النسبي ، ويمكن تطبيقه كميا على البلازما.

    لتحليل N-glycan ، من الأهمية بمكان استخدام المستوى المقترح من PNGase F لتحقيق إزالة الارتباط الكامل بالجليكوزيل. على الرغم من أن الجليكان مكشوفة للمذيبات ، إلا أن تمسخ البروتينات والإنزيم الزائد يساعد على ضمان انقسام فعال وكامل. من أجل القياس الكمي الدقيق للجليكان ، من الضروري التأكد من تجفيفها تماما بعد الاشتقاق لإخماد التفاعل ومنع التفاعلات المتقاطعة عند خلط أنواع NAT و SIL. أخيرا ، عند توسيع سير العمل إلى تحليل الجليكوزيت ، يعد توقيت الخطوات أمرا بالغ الأهمية لتقليل التخويف غير المحدد. تعمل البروتوكولات المعدلة المنصوص عليها لتحليل السكريات والبروتينات المشتركة بشكل متسق عند إجراؤها وفقا لذلك.

    يحقق سير العمل الكمية النسبية الدقيقة ل N-glycans من البلازما مقارنة بطريقة SPE القياسية الذهبية. لا يوجد تحيز واضح في أنواع الجليكان المستخرجة من حيث الوزن الجزيئي ، والماء ، والبنية التركيبية. على الرغم من أننا لم نستكشف التحليل النوعي للجليكانات المرتبطة ب O ، إلا أننا نتوقع أن FANGS يمكن أن تستوعب إضافة خطوة التخلص β بعد هضم PNGase F للجليكانات المرتبطة ب N. ومع ذلك ، ستتطلب الإجراءات تعديلا كبيرا لتنظيف الكاشف قبل قياس الطيف الكتلي ، وسيتأثر تحليل الببتيد بشكل كبير. بالنسبة للبروتينات ، يتم تحقيق نفس عمق تغطية البروتين مقارنة بطرق FASP التقليدية. الأهم من ذلك ، أن الطرق تحقق الحد الأدنى من معدل الاكتشاف الخاطئ لإزالة الجليكان N-glycan. في حين أن الطريقة متوافقة مع وضع العلامات 18O ل Asn خلال خطوة هضم PNGase22،23 ، فإن معدل الاكتشاف الخاطئ لموقع الارتباط بالجليكوزيل المنخفض يشير إلى أنه قد لا يكون ضروريا ، مما يقلل من التكاليف والتعقيد.

    لا يتم إثراء البروتينات السكرية في هذه الطريقة ، والتي لها مزايا وعيوب. قد لا يتم الكشف عن بعض البروتينات السكرية منخفضة الوفرة في التحليل. ومع ذلك ، يمكن مقارنة احتلال مواقع الجليكوزيلات لكل بروتين بين العينات البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التخلص من الخطأ والتحيز الناتج عن تنقية تقارب الليكتين أو التخصيب الكيميائي. في الختام ، يؤدي اقتران FANGS إلى تطبيع الفردية عند وضع العلامات باستخدام استراتيجية علامات الجليكان هيدرازيد إلى طريقة مبسطة وكمية وعالية الإنتاجية للتحليل الترادفي للجليكوم والبروتيوم مع إمكانات كبيرة للتطبيق في دراسات الحالات والشواهد السريرية.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    لدينا علاقة تعاونية مع مختبرات كامبريدج للنظائر (CIL) لنشر كاشف وتكنولوجيا P2GPN إلى المجتمع العلمي الأوسع في شكل منتج (GTK-1000). ومع ذلك ، لا نتلقى أي إيرادات بناء على بيع هذا المنتج.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    تم تمويل هذا البحث بسخاء من قبل منحة برنامج NIH NCI IMAT R33 (CA147988-02) ، وتدريب الخريجين NIH NIGMS في التكنولوجيا الحيوية الجزيئية في منحة ولاية نورث كارولاينا (T32GM008776) ، وبرنامج زمالة GAANN لوزارة التعليم الأمريكية في التكنولوجيا الحيوية الجزيئية في منحة ولاية نورث كارولاينا (P200A140020) ، ومؤسسة WM Keck ، وجامعة ولاية كارولينا الشمالية. تم الحصول على بلازما الدجاجة بمساعدة الدكتور جيمس ن. بيتيت وريبيكا ويسوكي في قسم علوم الدواجن بجامعة ولاية نورث كارولاينا.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    حمض الخليك (50٪)Sigma Aldrich   ؛45754
    أسيتونيتريل ، HPLC الصفبورديك & جاكسون AH015-4
    بيكربونات الأمونيومسيجما ألدريتش   ؛A6141
    كاشف برادفوردسيجما ألدريتش   ؛B6916البديل: مجموعة حمض البيسنشونيك (سيجما ألدريتش BCA1)
    كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش & nbsp ؛C1016
    Eppendorf5804 Rأجهزة الطرد المركزي البديلة التي تصل إلى 14,000 × جم مناسبة
    DL-Dithiothreitol ، 1 & nbsp ؛ م في الحلسيجما ألدريتش  646563
    Easy-nLC 1000Thermo ScientificLC120ستنتج LCs النانو البديلة أو ذات الضغط العالي جدا بيانات مماثلة ، مثل: 1. Dionex UltiMate & Ograve ؛ 3000 LC (علمي حراري) ؛ 2. Acquity UPLC (المياه).
    رف أنبوب عائمTedPella20831-20
    FetuinNew England Biolabs   ؛P6042S
    فيشر Scientific Isotemp أفران المختبر القياسيةفيشر Scientific11-690-625Fحاضنات بديلة تصل إلى 56   ؛ ° C مناسبة
    حمض الفورميكSigma Aldrich & nbsp ؛56302
    GE فرن ميكروويفجنرال إلكتريك57B5 E82904أي ميكروويف مع إعدادات طاقة قابلة للتعديل مناسب
    INLIGHT Glycan Tagging Kit  مختبرات كامبريدج للنظائرGTK-1000توفر مجموعة INLIGHT إصدارات NAT و SIL من كاشف P2GPN.
    IodoacetamideSigma Aldrich A3221
    Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 المرحلة الثابتة السائبةPhenomenex الوسائط السائبة: أي C18< / sub> المرحلة الثابتة 5 & nbsp ؛
    برنامج mM Mascot Daemon وبديلمصفوفةالخادم: برنامج Proteome Discoverer (Thermo Scientific)
    الميثانول ، HPLC الصفBurdick & amp جاكسون AH230-4
    عمود الحزمة الذاتية PicoFrit: 360   μ م ، OD 75   ؛ μ م ID, 15  μ م طرف ، غير مطلي ، 5 لكل صندوق ، 50 سمهدف جديد1 5 PF360-75-15-N-5
    PNGase F (خالي من الجلسرين) ، 75,000   ؛ وحدات / ملنيو إنجلاند BioLabsP0705L
    Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap مطياف الكتلةالحراري العلميالبديل دقة الكتلة العالية (5 & nbsp; جزء في المليون) ستوفر مطياف الكتلة بيانات مماثلة
    RNase BNew England Biolabs   ؛P7817S
    التربسين من الخنازير والبنكرياسSigma Aldrich T6567-5X
    اليورياسيجما ألدريتش  51456
    مكثف الفراغSavant SPD131DDA SpeedVac مكثفحراري علميSPD131DDAمكثفات فراغ بديلة مناسبة
    لمرشحات Vivacon 500 30 kDa Sartorius Stedim BiotechVN01H22البديل: Amicon Ultra 0.5 وحدات تصفية الطرد المركزي مع Ultracel-10 & nbsp ؛ غشاء kDa (Millipore UFC501096)
    الماء ، HPLC الصفبورديك & جاكسون AH365-4
    Water ، 18< / sup>OCambridge Isotope LaboratoriesOLM-240-97-1تعد إضافة 18< / sup>O في خطوة هضم PNGase F اختيارية وقد لا تكون ضرورية لدراسات إزالة الإزالة المكتملة بثقة 95٪
    Xcalibur 2.0Thermo ScientificXCALIBUR20
    Zwittergent TestMerck Millipore693030
    أجهزة الطرد المركزي بديل علوم Kit

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
    2. Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
    3. Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
    4. Roseman, S. Reflections on glycobiology. J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).
    5. Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
    6. Zaia, J. Mass spectrometry and glycomics. Omics. 14, 401-418 (2010).
    7. Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
    8. Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
    9. Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
    10. Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
    11. Kim, Y. -G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
    12. Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
    13. Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
    14. Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
    15. Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
    16. Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
    17. Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
    18. Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
    19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
    20. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
    21. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
    22. Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
    23. Yen, T. -Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
    24. Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
    25. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).
    26. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
    27. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
    28. Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
    29. Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
    30. Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
    31. Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
    32. Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    مقالات ذات صلة