أنشأنا تقنية لعزل وتوصيف المظهري والتحليل الوظيفي للخلايا المناعية من اللثة الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب شبكات الخلايا المناعية في الأنسجة دورا حيويا في التوسط في المناعة المحلية والحفاظ على توازن الأنسجة ، ومع ذلك لا يعرف سوى القليل عن مجموعات الخلايا المناعية المقيمة في الغشاء المخاطي للفم واللثة. لقد أنشأنا تقنية لعزل ودراسة الخلايا المناعية من أنسجة اللثة في الفئران ، وهي منطقة تعرض مستمر للميكروبات وموقع عرضة لمرض التهابي شائع ، التهاب دواعم السن. يسمح بروتوكولنا بتوصيف مظهري مفصل لمجموعات الخلايا المناعية المقيمة في اللثة ، حتى في حالة المستقرة. ينتج عن إجراءنا أيضا خلايا كافية ذات قابلية عالية للحياة لاستخدامها في الدراسات الوظيفية ، مثل تقييم إفراز السيتوكين خارج الجسم الحي. يجب أن يساعد هذا المزيج من التوصيف الظاهري والوظيفي لشبكة الخلايا المناعية اللثوية في التحقيق في الآليات التي تنطوي عليها مناعة الفم وتوازن اللثة ، ولكنه سيعزز أيضا فهمنا للآليات التي ينطوي عليها علم الأمراض المناعية الموضعي.
المقدمة
أنسجة اللثة المحيطة البشرية والأسنان الفئران ويتعرضون باستمرار لبيوفيلم معقد من الأسنان 1. شبكة الخلايا المناعية الشرطة على حاجز اللثة أمر حيوي للحفاظ على سلامة الأنسجة، وضمان التوازن مع الميكروبات المتعايشة المحلية و، في نفس الوقت، وتوفير حصانة فعالة ضد التحدي الإمراض 2. لتحقيق التوازن، تم تصميم جهاز المناعة بعناية للبيئة اللثة خلق درجة عالية من التخصص، شبكة الخلايا المناعية، ولكن كما هو معروف التفاصيل الصغيرة من السكان الخلايا المناعية اللثة ودورها في الحفاظ على مناعة الأنسجة 2.
عندما تتعطل توازن المناعة في اللثة، إما من خلال زيادة قابلية المضيف و / أو وجود المجتمعات الميكروبية dysbiotic، وهو حالة التهابية، اللثة تنشأ 3 4. التهاب اللثة هو مرض التهابي المشترك، مما يؤدي إلى فقدان الأسنان الصورةهياكل upporting. وينظر في أشكاله الشديدة في ما يقرب من 10٪ من عموم السكان 5. وقد ثبت تشريح العوامل الرئيسية المشاركة في حساسية اللثة والتقدم الصعب 6. ومع ذلك، فإن نماذج حيوانية مفيدة للغاية في فهم آليات بدء اللثة وتقدم 7. نماذج يمكن استخدامها لتحديد السكان الخلية الرئيسيين والوسطاء الجزيئية التي تعد حيوية للحفاظ على توازن المناعة وتطوير محرك اللثة. وهذه فكرة تحويل فهمنا لضبط اللثة محددة من توازن المناعة وتزيد من فهمنا الحالي للإمراض المرض.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وجاءت جميع الإجراءات التجريبية المبينة في هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية اللازمة وتمت الموافقة من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام، NIDCR / المعاهد الوطنية للصحة.
1. إعداد مقدما
- إعداد وسائل الاعلام كاملة: RPMI تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين و 10٪ FBS.
- إعداد وسائل الاعلام الدناز: 50 مل من وسائل الاعلام RPMI تستكمل مع 7.5 ميكروغرام الدناز (جعل الطازجة، والحفاظ على الجليد في جميع الأوقات).
- إعداد وسائل الاعلام كولاجيناز الدناز: 5 مل من وسائل الاعلام الدناز بالإضافة إلى 3.2 ملغ / مل من كولاجيناز النوع الرابع (جعل الطازجة، والحفاظ على الجليد في جميع الأوقات).
- FACS العازلة قبل بارد: 0.5٪ FBS مخففة في برنامج تلفزيوني.
- الطرد المركزي قبل بارد إلى 4 درجات مئوية.
- الدافئة شاكر حاضنة إلى 37 درجة مئوية.
2. عزل، تشريح، وعزل الخلايا من اللثة كتل
- الموت ببطء الفئران عن طريق تعريضها إلى CO 2 في غرفة المناسبة، وفقا للمبادئ التوجيهية أراك. <لى> فتح التجويف الصدري والبطن لفضح القلب والدورة الدموية. ليروي، إجراء شق في الوريد الأجوف السفلي ويروي 3 مل من برنامج تلفزيوني عبر البطين الأيسر باستخدام حقنة 3 مل مع إبرة 27 G.
- لشل حركة الجسم والرأس من الماوس على وسادة مع المعدة مواجهة.
- قطع كل صوار الشفة نحو الرقبة مع مقص، وفصل الجلد الذي يغطي الفك والعنق المنطقة، وفضح الأنسجة والعضلات الأساسية. تشريح الشفة السفلى للكشف عن الفك السفلي.
- قطع ما بين القواطع السفلية لفصل جانبي الفك السفلي وشل كل جانب للوصول إلى تجويف الفم.
- تصور وتشريح الحنك بعيدا عن تجويف الأنف.
- تشريح المناطق باستخدام شفرة 10 وتشمل المناطق الرحى العلوية والسفلية مع توضيح اللثة (الشكل 1). جعل شقوق عمودية فقط الأمامي إلى الضرس الأول والخلفي للالضرس الثالث وشق أفقي فيحدود اللثة (ذوي الياقات البيضاء الأسنان الأنسجة المحيطة).
- وضع الفك العلوي والفك السفلي كتل في 50 مل أنبوب مخروطي مع 5 مل كولاجيناز / الدناز (الحفاظ على الجليد).
- احتضان في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وخلال 5 دقائق الأخير من الحضانة إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
- إضافة 5 مل من وسائل الاعلام الدناز البارد إلى أنبوب 50 مل مع الأنسجة ودوامة بلطف لمزج.
- نقل 4 كتل من الأنسجة في طبق بتري، وتغطي مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الدناز. إزالة اللثة من كل كتلة من الأنسجة، وذلك باستخدام شفرة مشرط ولافتا نصل إلى المناطق اللثة وبين الأسنان.
- نقل الأنسجة وسائل الإعلام من طبق بتري وكذلك وسائل الإعلام الدناز السابقة التي استخدمت خلال تشريح، إلى أنبوب 50 مل جديد من خلال مصفاة الخلية (70 ميكرومتر حجم). يغسل مع وسائل الإعلام الدناز (3-5 مل) كل من الأدوات المستخدمة والتصفية.
- باستخدام المكبس من العقيمة حقنة 3 مل، هرس الأنسجة ضد مصفاة،تصفية مع وسائل الإعلام الدناز الباردة (30-35 مل).
- غسل مصفاة الخلية مع وسائل الإعلام الدناز البارد.
- أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 6 دقائق.
- تجاهل طاف، وإعادة تعليق في 1 مل من وسائل الإعلام كاملة.
- عدد الخلايا (المبلغ المتوقع أن يتراوح بين 8 × 10 5-1،2 × 10 6 خلايا مع بقاء> 80٪) باستخدام عداد الخلية الآلي.
3. تحفيز وFACS تلون خلايا اللثة
- تحفيز تعليق خلية واحدة مع سلطة النقد الفلسطينية (50 نانوغرام / مل)، وIonomycin (2.5 ميكروغرام / مل) في وجود 1 ميكرولتر / مل من Brefeldin أ.
- احتضان لمدة 3.5 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تدور باستمرار وتغسل مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية. 314 x ج لمدة 6 دقائق.
- وصمة عار على الخلايا باستخدام وصمة عار الجدوى باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- وصمة عار للعلامات خارج الخلية (CD45، TCRγδ، TCRβ، CD4، CD8، TCRγδ أو نملةibodies الاختيار) باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- غسل الخلايا مع العازلة FACS الباردة وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- دوامة بلطف لعرقلة بيليه الخلية.
- إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 2٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مع العازلة FACS الباردة، الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق وصمة عار لالسيتوكينات داخل الخلايا.
- ملء أنابيب FACS بمحلول بارد 0.5٪ سابونين المخفف في المخزن FACS وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- إضافة 300 ميكرولتر من 0.5٪ محلول سابونين للأنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية، واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية ثم الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- وصمة عار على الخلايا لعلامات داخل الخلايا (IL-17A وIFNγ أو السيتوكينات من خيار) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. غسل الخلايا مع 0.5٪ محلول سابونين وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- يغسل مرة أخرى مع نظام مراقبة الأصول الميدانيةالعازلة وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من FACS العازلة.
- تحليل النتائج على الكريات التدفق.
4. تحليل التدفق الخلوي
- تصور الخلايا لتحليلها في الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SCC) وبوابة لاستبعاد الحطام.
- حدد الخلايا واحدة مع منطقة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) مقابل المعلمات (FSC-H) الارتفاع.
- خلايا البوابة التي يعيش (كما يتضح من تلطيخ الجدوى) وايجابية علامة CD45 + المكونة للدم لمزيد من التحليل (الشكل 2A و 2C).
- مواصلة تحليل علامات محددة كما هو مبين في الشكل (2) والشكل (3).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتوضيح تطبيق البروتوكول، وتبين لنا نتائج ممثل فحص شبكة الخلايا المناعية في اللثة من الفئران مع وبدون اللثة (WT مقابل LFA - / -، الشكل 2A - C). FACS تمثيلية المؤامرات تظهر CD45 + لدم الخلايا الحية في اللثة (الشكل 2A، 2C). عزل ومعالجة الخلايا المناعية مع هذا البروتوكول ينتج خلايا كافية لتنفيذ المجراة سابقا التحفيز وتوصيف أنماط خلوى إفراز. هنا نعرض IL-17...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذه التقنية الحالية غلة بنجاح عددا كبيرا من الخلايا المناعية (من ماوس واحدة) مناسبة، ليس فقط لتوصيف المظهري، ولكن أيضا للدراسات وظيفية خارج الحي. ان مجموعة اخرى تنطبق على بروتوكول لعزل وتوصيف الخلايا المناعية اللثة الفئران وعرض قيمة استخدام متعدد الألوان التدفق الخلوي في دراسة اللثة في النماذج الحيوانية 9. وبعد استكشاف الأخطاء وإصلاحها كبيرا في تعديل رئيسي في هذا البروتوكول كان لتشمل تشريح كتل كاملة من الأنسجة لتشمل كل من المناطق طوق اللثة واللثة بين الأسنان
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه
شكر وتقدير
< p class = 'jove_content'> تم تمويل المؤلفين جزئيا من خلال البرنامج الداخلي ل NIDCR (N.M.M) وبدعم من زمالة Wellcome Trust Stepping Stones (097820 / Z / 11 / B to JEK) ومن خلال منحة مركز مانشستر التعاوني لأبحاث الالتهابات (إلى JEK). يشكر المؤلفون تيريزا وايلد على مراجعة المخطوطة بشكل نقدي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مقص ناعم | أدوات العلوم الدقيقة | 14058-11 | |
| مقبض مشرط # 3 | أدوات العلوم الدقيقة | 10003-12 | |
| شفرات مشرط # 10 | أدوات العلوم الدقيقة | 10010-00 | |
| ملقط منظيا | Integra Miltex | 6-304 | |
| إبر مع شطبة عادية ؛ | BD | Medical 305109 | 27 جم ، طول 12.7 مم |
| محاقن أحادية الوجه | Covidien | 8881513934 | طرف قفل لور ، 3 مل |
| PBS ، درجة الحموضة 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | بدون الكالسيوم والمغنيسيوم |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | بدون L-glutamine |
| DNase I من البنكرياس البقري | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| كولاجيناز من النوع الرابع | Gibco (بواسطة Life Technologies) | 17104-019 | |
| مصل الجنين | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg / ml | جودة بيولوجية | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (بواسطة Life Technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (بواسطة Life Technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 م EDTA درجة الحموضة 8.0 | جودة بيولوجية | 351-027-721EA | |
| 50 مل أنابيب | Corning | 352070 | بولي بروبيلين ، معقم |
| 70 مو ؛ مصافي إم سيل | كورنينج | 352350 | |
| أطباق بتري | كورنينج | 351029 | معقمة |
| 5 مل أنابيب FACS | كورنينج | 352052 | معقمة |
| BD جولجي بليج | بي دي بايوسينس | 555029 | يحتوي على محلول بريفيلدين فوربول |
| 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) | سيجما ألدريتش | P8139 | |
| الكالسيوم الأيونوميسين | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin من لحاء quillaja | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE / DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| مكافحة الفأر TCR بيتا APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| مكافحة الفأر دلتا جاما TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| مكافحة الفأر IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| مكافحة الفأر IFN- & جاما ؛ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| مضاد للفأر NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| مضاد للفأر CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| مضاد للفأر CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| مضاد للفأر CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| مضاد للفأر CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| مضاد للفأر CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| مكافحة الفأر TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| مكافحة الفأر Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| مكافحة الفأر Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
المراجع
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
