مقالة منهجية

المناعية الفوسفات-الحواتم في مهدبة هيئات الجامع جبل الزرد الأجنة

DOI:

10.3791/53747

⸱

فبراير 19, 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

موصوفة التقنيات لimmunostain الفوسفات-الحواتم في الأجنة الزرد بأكملها ثم إجراء اللونين متحد البؤر الفلورسنت التعريب في الهياكل الخلوية صغيرة مثل أهداب الابتدائي. يمكن للتقنيات لتحديد والتصوير تحديد الموقع وحركية مظهر أو تنشيط بروتينات معينة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انتشار السريع للخلايا، والتعبير عن الأنسجة محددة من الجينات وظهور شبكات يشير تميز التطور الجنيني المبكر من جميع الفقاريات. حركية والمكان من الإشارات - حتى داخل الخلايا واحد - في الجنين النامي تكمل التعرف على الجينات التنموية الهامة. ووصف التقنيات المناعية التي ثبت لتحديد حركية إشارات الحيوان داخل الخلايا وكلها في هياكل صغيرة مثل أهداب الابتدائي. ويمكن الانتهاء من التقنيات لتحديد والتصوير ومعالجة الصور باستخدام ليزر المسح المجهر المركب متحد البؤر في عدد قليل من 36 ساعة.

الزرد (دانيو rerio) هو كائن مرغوب فيه للمحققين الذين يسعون إلى إجراء دراسات في أنواع الفقاريات تكون في متناول وصلة الأمراض التي تصيب البشر. يجب تأكيد بالضربة القاضية وراثية أو knockdowns من فقدان البروتين المنتج الفعلي. هذا التأكيد من فقدان البروتينيمكن تحقيق ذلك باستخدام الأساليب المذكورة هنا. ويمكن أيضا أن القرائن إلى مسارات إشارات فك شفرتها باستخدام الأجسام المضادة التي هي رد الفعل مع البروتينات التي تم تعديلها بعد translationally من الفسفرة. الحفاظ على وتحسين حالة فسفرته من حاتمة يعد أمرا حيويا بالنسبة لهذا القرار ويتم إنجاز هذا البروتوكول.

توضح هذه الدراسة تقنيات لإصلاح الأجنة خلال ساعة 72 الأولى من تطوير وشارك في توطين مجموعة متنوعة من الحواتم ذات الصلة مع أهداب في كوبفر في الحويصلة (KV)، والكلى والأذن الداخلية. هذه التقنيات هي واضحة، لا تحتاج إلى تشريح ويمكن الانتهاء في فترة قصيرة نسبيا من الزمن. إسقاط مداخن صورة متحد البؤر في صورة واحدة هو وسيلة مفيدة لتقديم هذه البيانات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التقنيات الموضحة هنا هي نتيجة الدراسات التي سعت إلى تحديد الأهداف النهائية لإشارات Ca2 + أثناء الأحداث التي تحدث أثناء التطور المبكر ، بما في ذلك الإخصاب والمعدة وتكوين الجذع والعين والدماغ والأعضاء. 1-3 كانت الاكتشافات الأصلية لإشارات Ca2+ الجنينية تعتمد على استخدام مؤشرات Ca2+ الطبيعية والمهندسة ، مثل aequorin4 و fura-2. 5 حتى مع التكنولوجيا الحالية ، يتطلب الكشف عن الارتفاعات العابرة ل Ca2+ أدوات تحليلية مرهقة ولا يكشف عن أهداف إشارات Ca2+ هذه.

يبحث هذا المختبر في إشارات Ca2+ التي تعمل من خلال بروتين كيناز (متعدد الوظائف) المعتمد على Ca2 + / calmodulin المعروف باسم CaMK-II ، وهو إنزيم يتم إثرائه في الجهاز العصبي المركزي وتم تحديده في الأصل كمنظم للتقوية طويلة المدى. 6 CaMK-II ليس خاصا بالدماغ ، ويتم التعبير عنه على نطاق واسع ويتم الحفاظ عليه بشكل كبير طوال العمر وأجسام الأنواع في جميع أنحاء مملكة ، بما في ذلك اللافقاريات. 7,8 يتمتع CaMK-II بقدرة فريدة على الحفاظ على نشاطه الخاص حتى بعد تضاؤل مستويات Ca2+ بسبب قدرته على الفسفرة الذاتية عند Thr287. في هذه الحالة ذاتية الفسفرة ، يظل CaMK-II نشطا بطريقة مستقلة عن Ca2 + / CaM ، حتى يتم إزالة الفسفرة. 6 وبالتالي ، فإن توطين CaMK-II الفسفوري (Thr287) يمكن أن يحدد الخلايا التي حدثت فيها ارتفاعات طبيعية ذات صلة Ca2+.

جسم مضاد ضد الثدييات CaMK-II المفسفرة الذاتية (P-Thr287) تم تمييزه جيدا وتم استخدامه في البداية لتوطين CaMK-II المنشط في أنسجة المخ. 9 أسماك الزرد (Danio rerio) لديها سبعة جينات CaMK-II10،11 تحتوي منتجاتها البروتينية على سلسلة من MHRQE [pT287] VECLK في هذه المنطقة. 10،11 هذا التسلسل مشابه جدا لمستضد الفوسفوببتيد المستخدم لإنشاء هذا الجسم المضاد متعدد النسيلة للأرانب (MHRQE [pT] VDCLK ؛ شمال الولاية / ميليبور) وبالتالي لم يكن مفاجئا تماما أن يتفاعل هذا الجسم المضاد مع سمك الزرد CaMK-II. أظهر هذا المختبر أن هذا الجسم المضاد يتفاعل مع أسماك الزرد CaMK-II بما يتناسب مع الفسفرة الذاتية والنشاط المستقل عن Ca2 + / CaM. 12 كما ثبت أن الأجسام المضادة CaMK-II الإضافية الخاصة بالعموم تتفاعل مع أسماك الزرد CaMK-II. 13

تم استخدام هذا الجسم المضاد لإثبات أن سمك الزرد CaMK-II يتم تنشيطه بشكل تفضيلي في الخلايا الموجودة على جانب واحد من حويصلة الزرد Kupffer's Vesicle (KV) ، وهو العضو المهدب الضروري لإنشاء عدم تناسق اليسار / الأيمن. 12 تم استخدام هذا الجسم المضاد لإثبات أن CaMK-II يتم تنشيطه بشكل عابر في أربع خلايا متجاورة على الجانب الأيسر من KV خلال نفس المرحلة التنموية بالضبط التي يتم فيها تحديد موضع الأعضاء. 12 بالإضافة إلى حويصلة Kupffer (KV) ، كان الفسفرة الذاتية (P-T287) موجودا أيضا في مواقع محددة داخل الخلايا في الأنسجة المهدبة الأخرى بما في ذلك الكلى والصواريخ العصبية والأذن الداخلية. 12،13 في كلية الزرد ، يتم إثراء P-T287-CaMK-II على طول الحدود القمية للخلايا الأقنية المهدبة وداخل الأهداب المذرقية حيث يؤثر على تجميعها. 13 أخيرا ، في الأذن الداخلية النامية ، يتركز P-T287-CaMK-II بشكل مكثف في قاعدة الأهداب ويؤثر على تمايز الخلايا من خلال مسار إشارة Delta-Notch. 14 باختصار ، أدى اكتشاف CaMK-II المنشط إلى تحديد مواقع إطلاق Ca2+ داخل الخلايا وإضاءة مسارات الإشارات الجديدة المحتملة.

كانت هذه الاكتشافات تعتمد كليا على تطوير طريقة حساسة ودقيقة لتوطين CaMK-II المنشط (P-T 287-autophosphorylated). يتم وصف طرق إصلاح وإزالة بقع مناعية لسمك الزرد KV والكلى والأذن الداخلية. كما يتم وصف حدود هذه التقنية. يجب أن تكون هذه التقنيات مفيدة لأي محقق يسعى للحصول على صور عالية الدقة في قناتين فلوريتين ليس فقط لحواتم الفوسفو ، ولكن لأي حاتمة ، أثناء التطور المبكر للفقاريات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على الإجراءات الزرد في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة فرجينيا كومنولث.

1. إعداد الكواشف

  1. 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني. تزن 8 غرام من بارافورمالدهيد (PFA) في غطاء الدخان. في حين لا يزال في غطاء الدخان، ويحل الجافة PFA في ~ 80 مل المقطر H 2 O مع التحريك والتدفئة إلى 50 درجة مئوية. مع التحريك، إضافة 3-10 قطرات من جديد 1N هيدروكسيد الصوديوم حتى يذوب تماما PFA ويوضح الحل. إزالة من الحرارة وإضافة 100 مل 2X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ليصل حجم 200 مل مع المقطر H 2 O. تبريد لRT وتأكيد الرقم الهيدروجيني من 7.4 قبل الاستخدام. مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية ولكن استخدام في غضون أسبوع واحد.
  2. استخدام الميثانول بنسبة 100٪ دون أي ملاحق. استخدام الايثانول 95٪ دون أي ملاحق.
  3. إعداد مخزنة الفوسفات توين (PBT). تكملة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS) مع 0.1٪ توين-20. إضافة 0.5 مل من 20٪ توين 20 المحلول الى 100 مل برنامج تلفزيوني 1X. تخزين في RT.
  4. إعداد مخزنة الفوسفات تريتون-X (PBTx). تكملة برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ تريتون X-100. إضافة 0.5 مل من 20٪ تريتون X-100 سهم إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني. تخزين في RT.
  5. إعداد 10٪ خ ع / PBTx. مصل الماعز العادي (خ ع) كتل مواقع الربط غير محددة. متجر خ ع في aliquots في -20 درجة مئوية. للاستخدام، إضافة 1 مل إلى 9 مل PBTx.
  6. تجهيز 50٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني. مزيج من أجزاء متساوية تماما من 2X في برنامج تلفزيوني و 100٪ الجلسرين. تخزين في RT.

2. الأجنة التثبيت

  1. . (. على سبيل المثال، بيتا الأكتين: CAAX-GFP) تربية الحصول على النوع البري (AB وويك) أو المعدلة وراثيا الأجنة من خلال التزاوج الطبيعية. إذا رغبت في ذلك، حقن الأجنة مع بنيات أو morpholinos، كما هو موضح. 15،16
  2. رفع الأجنة. جمع الأجنة واحتضان عند 28.5 درجة مئوية في وجود من 0.003٪ 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) لمنع تصبغ كما هو موضح. 17 P>
  3. إصلاح، وعندما وصلت الأجنة المرحلة التنموية المرجوة، 18 عاما،   تخدير الأجنة باستخدام MESAB، وإزالة الكثير من الماء نظام ممكن، وإضافة جديدة 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني لمدة 3-4 ساعة على RT. ملاحظة: في بعض الأحيان أقل من 20 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، وتحديد مسبق لdechorionation. في بعض الأحيان بعد 20 HPF، dechorionate قبل تثبيت باستخدام اثنين من أزواج من الملقط نقطة غرامة تحت المجهر تشريح.
  4. تغيير الحلول. نقل الأجنة باستخدام تتحمل الماصة واسعة، كما هو موضح 17 حلول تغيير في 1.5 مل توج أنابيب microcentrifuge، وذلك ببساطة عن طريق السماح للأجنة لتسوية عن طريق الجاذبية دون الطرد المركزي.
  5. بعد تثبيتي بعد 3 - 4 ساعات، وإزالة PFA / برنامج تلفزيوني، مع استبدال 100٪ الميثانول ومخزن في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 48 ساعة. ملاحظة: للحصول على أقصى مناعية ف CaMK-II، والحد من إجمالي وقت تخزين الميثانول لمدة أسبوع واحد.
"> 3. المناعية الجامع الأجنة

  1. وضع ما لا يقل عن 10 الأجنة لكل حالة تجريبية في توج أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، والتسمية عليها.
  2. السماح للأجنة ليستقر. إزالة والتخلص الميثانول وترطيب مع يغسل التقدمية التي تحتوي على 0.5 مل من خفض تركيزات الإيثانول، كما هو مبين في الخطوة التالية. كل خطوة هي غسل 5 دقائق مع هزاز.
  3. ترطيب تدريجيا مع هذه الحلول 5: 66٪ من الإيثانول / 33٪ PBTx، 33٪ من الإيثانول / 66٪ PBTx، 100٪ PBTx، 100٪ PBTx (وهذا هو تكرار الأول من PBTx)، و 100٪ PBTx (هذا هو تكرار الثاني من PBTx).
  4. إزالة غسل PBTx الماضي. إضافة 0.5 مل 10٪ خ ع / PBTx. احتضان لمدة لا تقل عن 1 ساعة على RT مع هزاز لطيف ثم إزالة وتجاهل الحل.
  5. يعد حل الأجسام المضادة الأولية عن طريق تمييع في 10٪ خ ع / PBTx. إذا شارك في المناعية، واستخدام أعلى تقارب الأجسام المضادة لأول مرة. لهذه الدراسة، واحتضان مع الماوس مكافحة الأسيتيل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة تويولين المخفف 1: 500. لالامثلهالبريد، إذا كان هناك 10 عينة، والجمع بين 6 ميكرولتر من محلول المخزون الأجسام المضادة مع 3 مل من 10٪ خ ع / PBTx ثم توزيع 0.3 مل من هذا إلى كل أنبوب.
  6. إضافة 0،2-0،5 مل من الأجسام المضادة الأولية المخفف إلى كل أنبوب لتزج جميع الأجنة. احتضان مع طيف هزاز O / N في RT.
  7. في الصباح، وإزالة وتجاهل حل الأجسام المضادة. إضافة 0.5 مل 2٪ خ ع / PBTx ليغسل الأجسام المضادة الأولية الزائدة. صخرة بلطف لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص حل. كرر مرتين.
  8. خافت الأضواء العلوية وتمييع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently مترافق المناسبة في 10٪ خ ع / PBTx بحيث تحتوي كل حالة على الأقل 0.5 مل. مع الأجسام المضادة الأولية تويولين الماوس مكافحة الأسيتيل، استخدم الأخضر الفلورسنت صبغة الماعز المضادة الماوس مفتش في التخفيف 1: 500.
  9. احتضان الضد الثانوية لمدة 4 ساعة مع هزاز لطيف في RT في الظلام. من الآن فصاعدا، عملية العينات تحت أضواء خافتة واحتضان في وعاء مظلم أو التفاف في رقائق الألومنيوم.
  10. في نهاية الحضانة، وإزالة والتخلص من حل الضد الثانوية. إضافة 0.5 مل 2٪ خ ع / PBTx لغسل. صخرة بلطف لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص حل. كرر مرتين.
  11. إذا شارك في المناعية، يجب الحصول على الأجسام المضادة الأولية الثاني من الأنواع المختلفة من أول الأجسام المضادة الأولية. في هذه الدراسات، اتبع الأرنب مكافحة الفوسفات CaMK-II الأجسام المضادة من قبل صبغ مترافق الماعز المضادة للأرنب مفتش الأضداد الثانوية أحمر فلوري.
  12. تمييع أرنب مكافحة الفوسفات CaMK-II الأجسام المضادة 01:20. لكل أنبوب للأجنة أو تعليق في 0.3 مل 10٪ خ ع / PBTx، ثم إضافة 15 ميكرولتر من محلول المخزون الأجسام المضادة.
  13. ضمان أن الأجنة مغمورة وخافتة الأضواء. احتضان مع طيف هزاز O / N في RT في الظلام.
  14. في الصباح تحت الأضواء الخافتة، وإزالة وتجاهل حل الأجسام المضادة. إضافة 0.5 مل 2٪ خ ع / PBTx. صخرة بلطف لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص حل. كرر مرتين.
  15. إبقاء الأضواء العلوية قاتمة وتمييع ما يكفي من fluorescently-conju المناسبالأجسام المضادة الثانوية مسور بحيث تحتوي كل حالة على الأقل 0.5 مل. في هذه الدراسة، يخفف من صبغ مترافق الماعز المضادة للأرنب مفتش الأضداد أحمر فلوري الثانوي (القناة الحمراء) 1: 500 في 10٪ خ ع / PBTx.
  16. احتضان الضد الثانوية الثانية لمدة 4 ساعة مع هزاز لطيف في RT في الظلام.
  17. في نهاية هذه الحضانة وتحت الأضواء الخافتة، إزالة والتخلص من حل الضد الثانوية. إضافة 0.5 مل PBTx. صخرة بلطف لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص حل. كرر مرتين. متجر في أي PBTx أو 50٪ الجلسرين / PBS تبعا لإجراء التصوير.

4. متحد البؤر التصوير والمعالجة

  1. جبل الأجنة للتصوير. ضع 1-5 الأجنة على شريحة زجاجية. إنشاء غرفة بين ساترة الرئيسية وشريحة باستخدام شظايا ساترة على كل جانب من الغرفة. عادة، يتم استخدام أربعة # 1 coverslips لجعل هذه المداخن هل دون الختم.
    ملاحظة: لا المتوسطة المتزايدة ضروري.
  2. استخدام الغمر النفط 100Xهدف لجلب جنين واحد إلى التركيز باستخدام الضوء النافذ. إيقاف ضوء. تشغيل المجهر متحد البؤر. تأكد من أن أشعة الليزر المناسبة (الأخضر و / أو حمراء) قيد التشغيل، وتعمل عن بعد ثانوي التركيز.
  3. تشغيل برنامج متحد البؤر. في "شريط اكتساب"، حدد الهدف الصحيح. في شريط "XY الأساسية"، وضبط حجم الصورة ل1024 من خلال النقر على زر 1024.
  4. في "ليزر وكشف عن" شريط، انقر على أحمر 488 مربع والأخضر 568 مربع لتشغيل الليزر وكاشف لكل قناة. تعيين الثقب إلى متوسطة وضبط الزيادة في شريط "كسب" من كل قناة لتصور.
  5. في شريط "اكتساب الإعدادات"، انقر فوق "لايف" لبدء الحصول على الصور. في شريط "عرض الإعدادات"، قم بإلغاء تحديد خانة "فرض متكاملة تكبير" إلى مركز في إطار "لايف".
  6. في شريط "اكتساب الإعدادات"، ضمن علامة التبويب "Z"، خطوة من خلال طبقات من الصورة. بعد تحديد نوmber من المقاطع البصرية على أن تدرج في الصورة، والانتقال إلى مرحلة ما في "مركز" للض الطائرة.
  7. تحت علامة التبويب "Z"، انقر فوق حمراء صغيرة مربع "مرجع". وهذا الصفر دأب على النقطة المختارة باسم "مركز". في المربع المسمى "الخطوة الحجم"، حدد سمك طبقات (بين 0.25 ميكرون و 2،0 ميكرون هو المثل الأعلى). الالتفات إلى مربع "حجم الملف" ومحاولة للحد من 1GB.
    ملاحظة: عادة، تصل إلى 40 المقاطع البصرية من 0،5-1،0 ميكرون ويتم الحصول على، ولكن يمكن تحديد عدد الأقسام تجريبيا.
  8. للعثور على أقصى العلوي من الصورة، انقر فوق الدائرة بجانب "الأعلى" والتحرك من خلال طبقات ض. الآن انقر فوق الدائرة بجانب "القاع"، الكمبيوتر سوف يستغرق الصورة مرة أخرى إلى طبقة والمركز. نقل مرة أخرى من خلال طبقات للعثور على أقصى السفلي من الصورة.
  9. انقر على "لايف" مرة أخرى في "اكتساب الإعدادات" مربع لوقف الليزراستحواذ. في هذه اللوحة، انقر فوق مربعات حمراء وصفت متوسط ​​وZ-المكدس. وهذه الصناديق يتحول إلى اللون الأخضر.
  10. في مربع "اكتساب الإعدادات"، انقر فوق "واحدة" للحصول على سلسلة كاملة من الصور. يمكنك مراقبة التقدم كما يمسح في كل القنوات وخلال كامل ض المكدس.
  11. لحفظ، انقر على نافذة حجم وانقر على "حفظ باسم" واسم الملف. حفظ كملف ".ids". إلى حجم جعل ملف بينما كومة ض لا يزال مفتوحا، اختر سحب البيانات القائمة المنسدلة وانقر على "حجم تجعل". حفظ الملف كما تصدر ملف شجار. هذه هي الصورة المتوقعة التي يتم عرضها في هذا المنشور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الظروف المثلى لتصور الفوسفات-الحواتم

وكانت وسائل اصفا immunolocalization الحواتم البروتين في الأجنة الزرد متفرق نسبيا بالمقارنة مع تلك التي للتوطين من mRNAs عبر التهجين في الموقع. وشملت المثبتات المستخدمة في توطين الحواتم بروتين في الخلايا المهدبة الأجنة الزرد 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني وتثبيتي دنت، والذي هو خليط من الميثانو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير طريقة / الميثانول PFA في هذا المختبر مع الهدف الرئيسي لتحقيق الاستفادة المثلى من immunolocalization من الفوسفات-T 287 -CaMK-II حاتمة خلال تطوير الزرد. هذه الطريقة المترجمة بنجاح ف CaMK-II خلال تشكيل عدة أجهزة مهدبة بما في ذلك KV الزرد، 12 الأذن الداخلية 14 والكلى. 13 ولا سيما في مرحلة KV، وكانت هذه التقنية اللازمة. ومن المرجح نجاح هذه الطريقة نتيجة لمزيج من أ) التقليل من تألق ذاتي، ب) الحفاظ على حاتمة الفوسفات-CaMK-II وج) تعزيز ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل منحة المؤسسة الوطنية للعلوم IOS-0817658.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-فينيل-2-ثيوريا (PTU)SigmaP-76290.12٪ محلول مخزون. تمييع 1:40 في ماء النظام
Alexa488 المضادة للفأر IgGLife TechnologiesA11001الماعز متعدد النسيلة ، استخدم في 1: 500
Alexa488 المضادة للأرانب IgGLife TechnologiesA11008الماعز متعدد النسيلة ، استخدم في 1: 500
Alexa488 phalloidinLife TechnologiesA12379يرتبط بشكل تفضيلي ب F-actin
Alexa568 المضاد للفأر IgGLife TechnologiesA11004الماعز متعدد النسيلة ، استخدم في 1: 500
Alexa568 المضادة للأرانب IgGLife TechnologiesA11011الماعز متعدد النسيلة ، استخدم في 1: 500
مضاد للأسيتيلات &# 945 ؛ -tubulinSigmaT7451أحادي النسيلة للفأر ، استخدم في 1: 500
مضاد للفوسفو-T287< / sup> CaMK-IIEMD Millipore06-881أرنب متعدد النسيلة ، استخدم في 1:20
مضاد للمجموع CaMK-IIBD BIOSCIENCES611292أحادي النسيلة للفأر ، استخدم في 1:20
درجة مختبر الإيثانولفيشرS96857، 95٪ ملقط مشوهة
أدوات العلوم الدقيقة11252-20Dumont # 5
أغطية زجاجيةVWR16004-330# 1  سمك
شرائح مجهر زجاجيفيشر12-550-15شرائح زجاجية قياسية
ميثانولفيشرA411يخزن في الفريزر
أنابيب الطرد المركزي الدقيقةVWR20170-038أنابيب مغطاة ، غير معقمة
مصل الماعز العاديتقنيات الحياة16210-064أنابيب Aliquot 1 مل ، تخزينها في الفريزر
ParaformaldehydeSigmaP-6148درجة الكاشف ،
ملحي مخزن بالفوسفات البلوري (PBS) الجودةالبيولوجية119-069-131محلول مخزون 10x أو مصنوع في المختبر
Triton X-100SigmaBP-151محلول 10٪ في الماء ، يخزن في RT
Tween-20Life Technologies85113محلول 10٪ في الماء ، يخزن في
RT مجهر مركبنيكونE-600جبل على طاولة خالية من الاهتزاز
C1 Plus ثنائي المسح الضوئي بالليزرنيكونC1 Plusيعمل بواسطة برنامج EZ-C1 ، ولكن الترقيات تستخدم " العناصر"
محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113(2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115(2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644(2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PFA CaMKII

مقالات ذات صلة