يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل CD146

7.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53782

⸱

يونيو 17, 2016

 ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تقنية العزل للحصول على خلايا اللحمة المتوسطة انسجة الرئة المقيمين الأولية من الفئران، من خلال استخدام الهضم الأنزيمي، كثافة الفصل المتدرج، والتقيد البلاستيك وCD146 + اختيار حبة المغناطيسي.

الملخص

يتم التعرف على الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) على نحو متزايد لإمكاناتها العلاجية في مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك أمراض الرئة. إلى جانب استخدام نخاع العظام واللجان الدائمة الحبل السري لعلاج الخلايا خارجي، وهناك أيضا زيادة الاهتمام في إصلاح وإمكانات التجدد من اللجان الدائمة الأنسجة المقيمين. وعلاوة على ذلك، فإنها من المحتمل أن يكون لها دور في تطوير الجهاز العادي، ونسبت الأدوار في المرض، وخاصة تلك التي لها طبيعة متليفة. العقبة الرئيسية لدراسة هذه اللجان الدائمة الأنسجة المقيمة هو عدم وجود علامة واضحة لعزل والتعرف على هذه الخلايا. تقنية العزل الموصوفة هنا تنطبق خصائص متعددة من اللجان الدائمة المقيمين الرئة (L-اللجان الدائمة). على التضحية من الفئران، تتم إزالة الرئتين وتشطف عدة مرات لإزالة الدم. وبعد تفكك الميكانيكي بواسطة مشرط، يتم هضمها الرئتين لمدة 2-3 ساعة باستخدام مزيج من نوع كولاجيناز الأول، البروتيني محايد ونوع الدناز أولا obtaineيتم غسل د تعليق خلية واحدة في وقت لاحق، ومركبة على كثافة متوسطة الانحدار (الكثافة 1.073 غ / مل). بعد الطرد المركزي، ويتم غسل الخلايا من الطور البيني ومطلي في قوارير المعالجة الثقافة. الخلايا المستنبتة ل4-7 أيام في الفسيولوجي 5٪ O 2 و 5٪ CO 2 الشروط. في استنزاف الخلايا الليفية (CD146 -) وضمان عدد سكانها فقط L-اللجان الدائمة (CD146 +)، واختيار إيجابية للCD146 + الخلايا تتم من خلال اختيار حبة المغناطيسي. باختصار، هذا الإجراء ينتج موثوق يبلغ عدد سكانها الأساسي L-اللجان الدائمة لمزيد من الدراسة والتلاعب في المختبر. ونظرا للطبيعة البروتوكول، فإنه يمكن بسهولة أن تترجم إلى النماذج الحيوانية التجريبية الأخرى.

المقدمة

يتم التعرف على الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) على نحو متزايد لإمكاناتها العلاجية في مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك أمراض الرئة. إلى جانب استخدام نخاع العظام واللجان الدائمة الحبل السري لعلاج الخلايا خارجي، وهناك أيضا زيادة الاهتمام في إصلاح وإمكانات التجدد من اللجان الدائمة الأنسجة المقيمين. خلال التنمية، بما في ذلك الرئة، واللحمة المتوسطة تعد مصدرا مهما من العظة التنموية، واللجان الدائمة المقيمين هي المرشح المرجح أن يكون في مركز هذا. وعلاوة على ذلك، تظهر دلائل على ومضطرب أن اللجان الدائمة المقيمين في أمراض البالغين، بما في ذلك السرطان وتليف 1،2 3. العقبة الرئيسية لدراسة هذه اللجان الدائمة الأنسجة المقيمة هو عدم وجود علامة واضحة لعزل والتعرف على هذه الخلايا 4. الخلايا الجذعية مستضد 1 تم تحديد (SCA-1) في الفئران كعلامة لمجموعة متنوعة من الخلايا الجذعية الأنسجة، ويمكن استخدامها لعزل L-اللجان الدائمة 5، ولكن للاسفلا يعرف orthologs في الأنواع الأخرى 6. وأفاد الباحثون مجموعة متنوعة من أساليب العزلة مختلفة لعزل L-اللجان الدائمة سواء من أنسجة الرئة أو السوائل. هذه تختلف من مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) على أساس أساليب اختيار لCD31 - / CD45 - / CD90 + الخلايا 7، CD31 - / CD45 - / الظهارية خلية التصاق جزيء (EpCAM) - / هيئة السلع التموينية-1 + خلايا 8، المقاومة للأدوية المتعددة نقل ATP كاسيت ملزمة G (ABCG2) خلايا إيجابية 9 أو هويشت 33342 صبغ هروب رأس المال 10، إلى التقيد البلاستيك 11،12 والهجرة من مفروم النسيج 13.

مزايا الطريقة هنا المعروضة لعدة أضعاف. باستخدام الهضم الأنزيمي لطيف والتدرج الكثافة 14، واحد يحصل على جميع خلايا نطاق الكثافة التي تشمل اللجان الدائمة ولكنها تستبعد الخلايا الظهارية أو البطانية. الخطوة التزام البلاستيكية اللاحقة يضمن فقط mesenchخلايا ymal التمسك والبقاء في الثقافة، والقضاء على الكريات البيض. الأهم من ذلك، في خطوة اختيار CD146 + يسمح للقضاء على الخلايا الليفية، وهذه الخلايا لا تعبر عن CD146. يرتبط ارتباطا وتعبيرا عن التصاق الخلية الجزيء CD146 بإيجابية مع multipotency، وبالتالي فهي علامة جيدة للتخلص من الخلايا الليفية من سكان الخلية الوسيطة 15-19. هذا هو ميزة على استخدام CD90 كعلامة الاختيار، كما لا يعبر عنه إلا في اللجان الدائمة ولكن أيضا في lipofibroblasts 5،20. في هذا البروتوكول الذي اخترناه صراحة مجموعة مختارة حبة المغناطيسي، كما هو ألطف على الخلايا، والإجراء بأكمله يمكن أن يتم في ظروف معقمة. ميزة هامة أخرى من هذا الأسلوب العزلة بدلا من طريقة ثمرة، هو أنه سريع نسبيا، 6-10 أيام بدلا من شهر واحد أو أكثر للأسلوب ثمرة. بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من العزلة الأولية السكان الوسيطة جاهز للCD146 + سيلي ction. بعد 3-5 أيام آخر الخلايا CD146 + جاهزة لاستخدامها في التجارب أو يمكن تجميدها لاستخدامها لاحقا. الوقت انخفضت الثقافة يحسن نوعية الخلايا كما تحورها اللجان الدائمة نحو الخلايا الليفية لفترات طويلة خارج الحي الثقافة 19. وأخيرا، ونظرا للطبيعة البروتوكول، فمن الممكن تطبيق هذه الطريقة مع الأنواع الأخرى ببساطة عن طريق اختيار الأجسام المضادة المناسبة، أو حتى إلى أجهزة الجسم الأخرى عن طريق ضبط خيارات إنزيمات الهضم وفترة حضانة.

يعطى بروتوكول مفصل لهذا الأسلوب العزلة أدناه، وتقدم عرضا عاما من العزلة واختيار لاحقة من حيوانية CD146 + في الشكل 1A 1B وعلى التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تضمنت تفاصيل عن الركض، وتجميد والذوبان هذه الخلايا.

إعلان / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي لعزل الخلايا الرئوية الوسيطة (A) وCD146 لاحق + اختيار الخلية (ب) دقيقة = دقيقة؛ EDTA = ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل. 2 الثانية أب = الأجسام المضادة الثانوية؛ ألفا CD146 أب = الأساسي الأجسام المضادة لمكافحة CD146. خلايا، لقد = CD146 الخلايا السلبية. + لقد خلايا إيجابية الخلايا = CD146. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة أوتاوا (أخلاقيات الحيوان بروتوكول أوهري-1696). وقد أجريت رعاية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

1. عزل خلايا الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية

  1. تحضير مزيج انزيم في أنبوب 50 مل: في وزن 30 U البروتياز محايد، 2500 U كولاجيناز أنا و 500 U الدناز أولا هذه المبالغ تكفي لالرئتين من الماوس الكبار أو الجرو الفئران. إعداد في يوم من العزلة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. الجراء التضحية الفئران في يوم 13 عن طريق الحقن داخل الصفاق من الصوديوم بنتوباربيتال (0.2 مل، 65 ملغ / مل). استخدام إصبع القدم قرصة العاكسة لإقامة فقدان الوعي. ومن المؤكد أن موت الحيوان عن طريق فتح الصدر، على النحو المبين أدناه.
  3. تطهير الجلد عن طريق رش الحيوان مع الايثانول 70٪ وفتح بعناية القفص الصدري باستخدام مقص جراحي، بدءا من الحجاب الحاجز وقطع نحو الجانب منقاري، ويجري حريصا جدا على ألاإلى تلف الرئتين. نشر القفص الصدري مفتوحة استخدام المشابك مرقئ، أو بدلا من ذلك قطع القفص الصدري لتوفير الوصول إلى القفص الصدري.
  4. يستنزف الحيوان عن طريق إزالة القلب. لإزالة القلب، فهم الغدة الصعترية والقلب مع ملقط صغير وخفض هذه بعيدا مع مقص جراحي. وبعد ذلك مباشرة، وامتصاص الدم مع الشاش حتى يأتي لا دم أكثر من الشريان الأورطي مقطوعة والشريان الرئوي.
  5. إزالة الرئتين من القفص الصدري على النحو التالي: عقد القصبة الهوائية مع ملقط صغير، ثم قطع القصبة الهوائية مع مقص جراحي على الجانب منقاري. في حين سحب بلطف حزمة الرئة من الصدر، قطع أي نوع من الأنسجة الضامة على الجانب الظهري على طول القفص الصدري لتحرير الرئتين.
  6. قطع الرئتين من الشريان الأورطي والمريء عن طريق قطع على طول الحجاب الحاجز مع مقص جراحي. والآن بعد أن الرئتين خالية من الصدر تماما إزالة أي الدم المتبقي بلطف مع الشاش.
  7. إزالة القصبة الهوائية والشعب الهوائية مع سورمقص gical ونقل بعناية فصوص الرئة إلى أنبوب 50 مل الباردة التي تحتوي على 35 مل 30٪ السيترات-فوسفات-سكر العنب الأدينين (CPDA-1) للتخثر (26.30 ز سترات الصوديوم ثنائي الهيدرات، 3.27 غرام حمض الاسكوربيك الهيدرات، 2.22 غرام أحادية الصوديوم هيدروجين فوسفات، 31.80 ز مد الجلوكوز، 0.275 غرام الأدنين في 1 لتر تنقية H 2 O؛ تصفية العقيمة الحل باستخدام فلتر 0.22 ميكرون غشاء قبل الاستخدام) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة الدم والحطام.
  8. بعد شطف 5 دقائق في 30٪ CPDA-1 / برنامج تلفزيوني، ونقل الرئة إلى أنبوب 50 مل جديدة تحتوي على 35 مل الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) (RT)، عكس بلطف لإزالة سترات. نقل إلى أنبوب يحتوي على 35 مل Dulbecco لبرنامج تلفزيوني + الصوديوم-البيروفات + الجلوكوز (DPBS ++) (RT). كل خطوة الشطف وينبغي أن تأخذ حوالي 5 دقائق.
    ملاحظة: يمكن أن يؤمر DPBS ++ تجاريا أو تتكون على النحو التالي 21: الكالسيوم ثنائي الهيدرات كلوريد 132.4 ملغ، المغنيسيوم هيدرات كلوريد 100 ملغ، كلوريد البوتاسيوم (لا مائي) 200 مترز، فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (لا مائي) 200 ملغ، كلوريد الصوديوم (لا مائي) 8000 ملغ، فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (لا مائي) 1،144.5 ملغ، مد الجلوكوز 1000 ملغ، البيروفات الصوديوم 36 ملغ في 1 لتر H 2 O النقي، ودرجة الحموضة 7.3. تصفية العقيمة الحل باستخدام فلتر 0.22 ميكرون غشاء قبل الاستخدام.
  9. حل مزيج انزيم بإضافة 10 مل DPBS ++ (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية)، وعكس بلطف حتى يذوب.
  10. نقل الرئتين إلى أنبوب 50 مل الجديد وختم الرئة على جدار الأنبوب باستخدام مشرط حتى مفروم ناعما. يضاف مزيج انزيم إلى الأنسجة (10 مل انزيم مزيج / للبالغين الماوس / الفئران الجرو الرئة)، إغلاق الأنبوب بإحكام واحتضان عند 38 درجة مئوية مع الإثارة لطيف (إما في خلاط الحراري، حمام مائي تهتز، أو المياه حمام مع الإثارة اليدوي العادي). ومدة يعتمد على نوع من الأنسجة: أنسجة الجنين 60 دقيقة، الحدث / الكبار الأنسجة 90-120 دقيقة، التليفية الكبار الأنسجة 120-150 دقيقة.
  11. وقف عملية الهضم من خلال مخلبية الكاتيونات الثنائي التكافؤ ثإيث 200 ميكرولتر ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA، 0.15 م، ودرجة الحموضة 7.4. تصفية العقيمة الحل باستخدام فلتر 0.22 ميكرون غشاء قبل الاستخدام).
  12. إضافة 20 مل 5٪ الجنين المصل البقري (FBS) / برنامج تلفزيوني وتمرير تعليق بأكمله من خلال 100 مصفاة ميكرومتر الخلية في أنبوب 50 مل الجديد. شطف أنبوب ومصفاة الخلية مع 10 مل 5٪ FBS / PBS، ليصل بذلك إجمالي حجم 40 مل.
  13. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج، RT.
  14. إزالة طاف (يجب أن يكون بيليه واضحة للعيان)، resuspend في 40 مل 5٪ FBS / PBS وتكرار الطرد المركزي خطوة 1.13.
  15. Resuspend في 4 مل 5٪ FBS / PBS (RT) وطبقة بعناية أكثر من 3 مل سائل الإعلام التدرج الكثافة (1.073 جم / سم 3) في أنبوب 15 مل 14. للحصول على البيني جيد، فمن الأهمية بمكان أن طبقات من تعليق خلية واحدة تحدث في زاوية درجة> 45 على سرعة منخفضة جدا.
  16. الطرد المركزي 20 دقيقة في 900 x ج والمتوسطة (5/10) التسارع، والتباطؤ لا، 19 ° C.
  17. جمع الخلايا الموجودة في فيterphase و resuspend لهم في 10 مل العقيمة برنامج تلفزيوني.
  18. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج، 21 ° C.
  19. إزالة طاف و resuspend بيليه الخلية في 10 مل قبل تحسنت المتوسطة الانتهاء ثقافة L-MSC (الحد الأدنى وسائل الإعلام ضروري النسر، تعديل ألفا (αMEM)، على أن تستكمل مع 2 مليمول L-الجلوتامين لكل 500 مل αMEM، 20٪ المجلد / المجلد FBS و1٪ المجلد / المجلد البنسلين / الستربتوميسين / الامفوتريسين B.
  20. كرر الطرد المركزي خطوة 1.18. وفي وقت لاحق، وإزالة طاف و resuspend في 10 مل قبل تحسنت الثقافة المتوسطة الطازجة.
  21. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلايا ولوحة في مناطق ذات كثافة عالية، حيث أن الغالبية العظمى من الخلايا في هذه المرحلة ليست تمسكا البلاستيك. كثافة الطلاء الدقيق يعتمد على الأنواع الحيوانية والعمر، على سبيل المثال، هي المصنفة خلايا الرئة الماوس الكبار في 10 5 خلية / سم 2، في حين أن خلايا من رئة الفئران الجرو كثيفة بما فيه الكفاية في مناطق ذات كثافة البذر من 1-2 س 10 4 خلية / سم 2 . استخدام 0.2 مل L-MSC مستنبت / سم 2.
  22. ثقافة L-اللجان الدائمة في ترطيب 5٪ O 2 و 5٪ CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية.
  23. تغيير المتوسطة 24 ساعة بعد البذر الأولي، وبعد ذلك كل 3 أيام بعد الشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. يجب أن تكون الخلايا مثقف حتى 80-90٪ التقاء، والتي تأخذ 3-5 أيام في المتوسط ​​اعتمادا على الحيوان المنشأ. سوف التقاء أعلى تعزيز التمايز في الخلايا الليفية.

2. اختيار الخلايا CD146 + الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية

  1. طلاء من الخرز المغناطيسي مع الجسم المضاد الثانوي
    1. معطف حبات مغناطيسية مع الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز، في نسبة 10 ميكروغرام الضد الثانوية / حبات 100 ميكرولتر المغناطيسية في قاع جولة العقيمة 2 مل cryovial في ظروف معقمة. استخدام 10 ميكرولتر الضد الثانوية في المتوقع 0.5 × 10 6 خلايا، واستخدام ما لا يقل عن 100 ميكرولتر الخرز المغناطيسي و 10 ميكروغرام الأجسام المضادة.
      ملاحظة: نسبة لtibodies تستخدم في حجم حبات قد تختلف بين المصنعين، يرجى الرجوع إلى إرشادات الشركة المصنعة لحبات الاختيار. لهذا البروتوكول، يرجى الرجوع إلى الجدول 1 لحبات والأجسام المضادة التي تم استخدامها في الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول.
    2. احتضان في الدورية عينة خلاط لمدة 30 دقيقة في 30 تناوب / دقيقة (دورة في الدقيقة)، في RT.
    3. resuspend والخرز في 1.5 مل العقيمة 0.1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) / برنامج تلفزيوني ونقل إلى 3 مل الجولة أنبوب أسفل (قياس التدفق الخلوي أنبوب). شطف cryovial مع إضافي 1.5 مل 0.1٪ BSA / برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب 3 مل.
    4. وضع أنبوب على المغناطيس المناسب والانتظار 2 دقيقة حتى ترد على كل حبات على الجدار الخلفي للأنبوب ويبقى حل واضح. إزالة الجريان السطحي وتكرار غسل مع 3 مل 0.1٪ BSA / برنامج تلفزيوني مرتين.
    5. resuspend والخرز في 3 مل 0.1٪ BSA / برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء. استخدام خلال 5 أيام.
  2. وضع اللصاقات CD146 + L-اللجان الدائمة
    1. حصاد الخلايا الوسيطة بعد الشطف مع برنامج تلفزيوني باستخدام محلول لطيف غير التربسين.
      ملاحظة: تعتمد أحجام التداول في حجم قارورة الثقافة (0.2 مل / سم 2 متوسطة أو PBS).
      1. إزالة مستنبت وشطف خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
      2. إضافة حجم مناسب من حل لطيف غير التربسين (انظر الجدول 1). احتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة حتى يكون فصل الخلايا، ما يقرب من 10 دقيقة عند استخدام الحل في الجدول 1.
      3. تعطيل الإنزيم بإضافة L-MSC مستنبت، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
    2. إزالة طاف، وخلايا resuspend في 0.1٪ BSA / برنامج تلفزيوني وعدد الخلايا مع عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلايا.
      ملاحظة: حجم 0.1٪ BSA / برنامج تلفزيوني يعتمد على حجم قارورة الثقافة: نسعى لمدة 5 أو 10 مل 0.1٪ BSA / برنامج تلفزيوني.
    3. كرر الخطوة 2.2.2 و resuspend كمية متخصص من الخلايا في 3 مل 0.1٪ BSA / برنامج تلفزيوني (كتل الامم المتحدةمواقع الربط محددة ويحافظ على الخلايا على قيد الحياة). تبقي الخلايا على الجليد.
    4. إعداد 3 مل الجولة أنبوب أسفل مع الأجسام المضادة لمكافحة CD146 الأساسي، والحفاظ على الجليد.
      ملاحظة: إن تركيز الأجسام المضادة الأولية التي يتم إضافتها إلى المبلغ المخصص من الخلايا يعتمد على الأجسام المضادة التي يتم استخدامها. ليقترح مكافحة الفئران CD146 الأجسام المضادة انظر الجدول 1.
    5. إضافة الحجم الكلي للخلايا من الخطوة 2.2.3 إلى أنبوب مع الأجسام المضادة الأولية. إغلاق بإحكام واحتضان 30 دقيقة على الدورية عينة خلاط في 15 دورة في الدقيقة، 4 درجات مئوية.
    6. خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج، 4 درجات مئوية، وإزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 3 مل 0.1٪ BSA / برنامج تلفزيوني. خطوة الطرد المركزي كرر.
    7. resuspend الخلايا في حل 3 مل تحتوي على الأجسام المضادة المغلفة الخرز الثانوية الذي تم إعداده وفقا للتعليمات في القسم 2.1 واحتضان 30 دقيقة على الدورية عينة خلاط في 15 دورة في الدقيقة، 4 درجات مئوية.
  3. اختيار CD146 + L-اللجان الدائمة
    1. وضع الأنبوب الذي يحتوي على المسمى CD146 + L-اللجان الدائمة على مغناطيس. وسيتم اختيار الخلايا إيجابية إلى الجزء الخلفي من الأنبوب. دون تحريك أنبوب أو لمس الخرز، وحصاد طاف مع الخلايا السلبية ببطء مع ماصة باستور معقمة (وهذه يمكن إما جمع أو التخلص منها بناء على التصميم التجريبي).
    2. إزالة أنبوب من المغناطيس وresuspend الخلايا في 3 مل 10٪ BSA / برنامج تلفزيوني. تكرار إجراءات الاختيار هو موضح في الخطوة 2.3.1. أربعة أضعاف (خطوات Σ 5 اختيار).
    3. Resuspend وCD146 + L-اللجان الدائمة في درجة حرارة ما قبل مستنبت L-MSC والعودة إلى المغناطيس.
    4. إزالة طاف، resuspend في L-MSC مستنبت ولوحة في قارورة الثقافة بحجم مناسب (0.2 مل / سم 2). وكقاعدة عامة من الإبهام، وخلايا لوحة في نفس القارورة ثقافة حجم من التي رفعت الخلايا قبل حبة التحديد. عدد CD146 + L-اللجان الدائمة، وبالتالي فإن كثافة الطلاء، سوفتعتمد على العمر ونوع وسلالة من الحيوانات المصدر. تهدف دائما لكثافة الطلاء من ~ 5000 خلية / سم 2.
      ملاحظة: إن حبات لا تزعج نمو الخلايا وسوف تختفي تدريجيا كما تتكاثر الخلايا.

3. خلايا التجميد

  1. استخدام وسائل الإعلام تجميد التالية: 60٪ من محلول pentastarch (10٪ pentastarch في كلوريد الصوديوم 0.9٪)، و 20٪ FBS، 12.5٪ CPDA-1، و 2.5٪ كلوريد الصوديوم (0.9٪)، و 5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) 22.
    ملاحظة: إذا ليست كل المكونات المتاحة، محلول يحتوي على 5٪ DMSO، و 30٪ FBS و 65٪ αMEM هو بديل جيد.
  2. Resuspend الخلايا عند 0.5 × 10 6 خلية / مل، قسامة في cryovials من 1 مل لكل منهما وتجميد O / N في -80 درجة مئوية باستخدام وعاء التجميد.
  3. نقل إلى خزان تخزين النيتروجين السائل في اليوم التالي.

4. خلايا ذوبان

  1. ذوبان الجليد قارورة من الخلايا في 37 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق.
  2. Resuspend الخلايا في 10 ملقبل تحسنت مستنبت وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج، 21 ° C.
  3. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في مستنبت 10 مل. خلايا البذور في زراعة الخلايا سقف تنفيس تعامل قوارير في 5000 خلية / سم 2 في 0.2 مل / وسائل الإعلام CM2 (على سبيل المثال، 15 مل لمدة 75 سم 2 قارورة).
  4. خلايا الثقافة في 5٪ O 2 و 5٪ CO 2 حتى 80-90٪ متموجة للحصاد و / أو استخدام التجريبي. والإفراط في confluency لحث على التمايز. عندما البذر في 5000 خلية / سم 2، وسوف L-اللجان الدائمة تصل إلى 80-90٪ confluency في غضون 3-4 أيام من الثقافة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

اثنين من الخصائص الفيزيائية الأكثر موثوقية من اللجان الدائمة والكثافة والالتزام البلاستيك، وتستخدم في الجزء الأول من هذا البروتوكول إلى الحصول على جزء الخلية الوسيطة في الرئة يحتوي على L-اللجان الدائمة. على الرغم من أن البيني كثافة التدرج ستشمل حيدات والضامة بالإضافة إلى خلايا اللحمة المتوسطة الرئة، والالتزام البلاستيك تليها 3-5 أيام الثقافة يضمن أن تبقى فقط خلايا اللحمة المتوسطة الرئة. والواقع أن هذا السكان الخلية يعبر عن الكلاسيكية علامات سطح MSC...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تقدم العزلة وثقافة الأساسي L-اللجان الدائمة فرصة لفهم أفضل وظيفة وتفاعلها مع السكان خلية أخرى على المستوى الخلوي، ودورها في التنمية الرئة، والصحة والمرض. وهذا أمر مهم خاصة أن عدم وجود علامة واحدة معينة من هذه الخلايا تجعل من شبه المستحيل لدراسة هذه الخلايا في الموقع. كما هو الحال مع جميع السكان الخلية الأساسي، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن هذه الخلايا هي أكثر عرضة للتغيير طابعها ويعد يتم الاحتفاظ بها في الثقافة 19 (إعادة النظر في 24). للحفاظ على ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

JJPC مدعوم من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR). تحصل MAM على منحة استحقاق من المؤسسة الأكاديمية الوطنية الألمانية - Studienstiftung des Deutschen Volkes وتدعمها منحة من EFCNI (المؤسسة الأوروبية لرعاية الأطفال حديثي الولادة). يتم دعم BT من قبل CIHR وجمعية الرئة الكندية وشبكة الخلايا الجذعية ومستشفى الأطفال في معهد أبحاث شرق أونتاريو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ProteaseWorthington BiochemicalCorporation LS02104الاستعداد في يوم العزل وتخزينها في 4 درجات ؛ C حتى استخدام
Collagenase IWorthington Biochemical CorporationLS004196الاستعداد في يوم العزل وتخزينه في 4 درجات ؛ C حتى استخدام
DNAse ISigma-AldrichD5025التحضير في يوم العزل وتخزينه في 4 درجات ؛ C حتى استخدام
Pentobarbital sodium (القتل الرحيم)Bimeda-MTC Animal Health Inc ، دبلن ، أيرلندا-استخدم 0.2 مل لصغار الفئران بين 20-30 جم ؛ قد تحتاج الكبيرة إلى المزيد.
دولبيكو s PBS + الصوديوم البيروفات + تقنيات حياة الجلوكوز14287-072من الأهمية بمكان استخدام هذا النوع من D-PBS ، حيث يسهل الكالسيوم والمغنيسيوم الموجودان في D-PBS هذا الهضم الأنزيمي
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 جم / سم 3< / sup>)GE Healthcare17-5446-52وسائط تدرج الكثافة. للحصول على طور بيني جيد ، من الأهمية بمكان أن تحدث طبقات تعليق الخلية المفردة عند درجة >45 درجة ؛ زاوية بسرعة منخفضة جدا ، وأن الطرد المركزي اللاحق يتم عند 19 درجة مئوية.
& ألفا. MEMSigma-AldrichM8042دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
200 ملي مولار L-GlutamineLife Technologies25030-164
100x Antibiotic-AnticoticLife Technologies15240-062Penicillin / Streptomycin / Fungizone
M-280 DynabeadsLife Technologies11205Dالخرز المغناطيسي
النسيلة البيوتينيل للأرانب المضادة للفأر IgGDako ، Agilent TechnologiesE0464الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل الذي يتطابق مع الجسم المضاد CD146 المضاد للفئران الموصوف أدناه
مغناطيس DynaMag5-magnetLife Technologies12303Dالموصى به للاستخدام مع Dynabeads. ملاحظة: يجب اختيار المغناطيس بناء على الشركة المصنعة ' تعليمات من حبات المغناطيس من اختيار.
TrypLE express Life Technologies12605-028بديل لطيف غير التربسين ، استخدم 1 مل من TrypLE express / 25 سم 2< / sup> مساحة السطح. بعد الانفصال ، يكفي 10 مل من وسط ثقافة L-MSC لتعطيل 3 مل
الأجسام المضادة ل TrypLE CD146 المضادة للفئرانLifespan Biosciences Inc.C3584112.5 & لتر لكل 0.5 × 10 < سوب > 6 < / سوب> خلايا
بنتاسبان (محلول خماسي)بريستول مايرز سكويب كندا-يمكن الحصول عليها من خلال خدمات التبرع بالدم المحلية أو أقسام أمراض الدم. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام محلول PSI 20٪ Pentastarch (حلول الحفظ ، PST001) المخفف 1: 1 مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
حاوية التجميد السيد FrostyThermoFisher Scientific5100-0001يحسن الجدوى عند تجميد L-MSCs بين عشية وضحاها عند -80 درجة ؛ ج
شركة متعدد من

المراجع

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498(2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD146
عزل CD146
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.