يصف هذا العمل في المختبر بروتوكول التمايز لإنتاج الصباغية، الخلايا الصباغية ناضجة من خلايا جذعية المحفزة الإنسان عبر قمة العصبية وميلانينية المرحلة المتوسطة باستخدام، بروتوكول خالية من تغذية 25 يوما.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمثل
الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) منصة لدراسة التنمية البشرية في المختبر في ظل الظروف الطبيعية والمرضية. يمكن للباحثين توجيه تمايز hPSCs إلى نوع الخلية ذات الأهمية من خلال التلاعب بظروف الثقافة لتلخيص الإشارات التي شوهدت أثناء التطور. أحد أنواع الخلايا هو الخلايا الصباغية ، وهي خلية منتجة للصبغة من أصل القمة العصبية (NC) مسؤولة عن حماية الجلد من الأشعة فوق البنفسجية. يقدم هذا البروتوكول امتدادا لبروتوكول تمايز القمة العصبية المتاح حاليا في المختبر من hPSCs لزيادة تمييز NC إلى خلايا ميلانينية مصطبغة بالكامل. يمكن إثراء سلائف الخلايا الصباغية من بروتوكول Neural Crest عبر التعرض الموقوت لمنشطات إشارات WNT و BMP و EDN3 في ظل ظروف تثبيط SMAD المزدوج. ثم يتم تنقية سلائف الخلايا الصباغية الناتجة ونضجها إلى خلايا ميلانينية مصطبغة بالكامل عن طريق الاستزراع في وسط انتقائي الخلايا الصباغية الناتجة مصطبغة بالكامل وتلطخ بشكل مناسب للبروتينات المميزة للخلايا الصباغية الناضجة.
المقدمة
الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) توفير منصة لتقليد التمايز الطبيعي بطريقة قابلة للنمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاجات البديلة للخلية 1-6. ذات أهمية خاصة، hPSCs تفتح آفاقا لدراسة الصعب عزل أو أنواع الخلايا نادرة / عابرة حيث عينات المرضى شحيحة. وعلاوة على ذلك، التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمكن الباحثون لدراسة تطوير والنمذجة المرض بطريقة محددة المريض لكشف آليات فريدة 1،2،7-11. يتطلب بروتوكول نشرت سابقا عن تمايز الخلايا الصباغية من hPSCs تصل إلى 6 أسابيع من التفرقة وينطوي على خلايا زراعة مع المتوسط مكيفة من خلايا L-Wnt3a 12. بروتوكول قدمت لأول مرة من قبل ميكا وآخرون وصفت هنا تنتج الخلايا الصباغية في ثلاثة أسابيع وإزالة الغموض والتناقضات المرتبطة المتوسطة مشروط.
الخلايا الصباغية عالبريد المستمدة من قمة العصبية، والسكان المهاجرين من خلايا فريدة من نوعها لالفقاريات. يتم تعريف قمة العصبية خلال المعيدة ويمثل السكان من الخلايا على حافة لوحة العصبية، على الحدود بين العصبية والأديم الظاهر غير العصبية. أثناء تكون العصيبة، النسيج العصبي يتطور من لوحة العصبية لتشكيل طيات العصبية، التي تلتقي في خط الوسط ظهري مما أدى إلى 13،14 الأنبوب العصبي.
الخلايا قمة العصبية الخروج من لوحة سطح الأنبوب العصبي، مقابل الحبل الظهري، وتخضع لالظهارية للانتقال الوسيطة قبل أن يهاجر بعيدا أن تؤدي إلى مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا المتمايزة. وتعرف مصير الخلايا قمة في جزء من الموقع التشريحي لوحة السقف على طول محور جسم الجنين. وتشمل العصبية المشتقات خلية قمة الأنساب مميزة لكل من الأديم المتوسط (خلايا العضلات الملساء، بانيات، الخلايا الشحمية، غضروفية) وخلايا الأدمة (الخلايا الصباغية، شوان جملتعلمي اللغة اإلنكليزية، الخلايا العصبية) 14. العصبية الخلايا الجذعية قمة upregulate عامل النسخ SOX10، ويمكن أن تكون معزولة من قبل مضان تنشيط الخلايا الفرز مع الأجسام المضادة لP75 وHNK1.
الخلايا العصبية قمة الطالع أن تصبح الخلايا الصباغية تمر عبر مرحلة ميلانينية وupregulate KIT وMITF (المرتبط صغر عامل النسخ) 6،21 MITF هو منظم رئيسي للتنمية الخلايا الصباغية وهو عامل النسخ المسؤولة عن السيطرة على جزء كبير من تطوير الخلايا الصباغية 22- 24. melanoblasts الإنسان تهاجر إلى الطبقة القاعدية من البشرة التي يقيمون فيها سواء في انتفاخ الشعر أو تحيط بها الخلايا الكيراتينية في البشرة (تشكيل وحدة تصبغ) لتكون بمثابة السلائف إلى ناضجة، الخلايا الصباغية المصطبغة. والتمايز والنضج من melanoblasts إلى الخلايا الصباغية مصطبغة يحدث ما يصاحب ذلك مع الاستعمار لبصلة الشعر والتعبير عن مسار إنتاج الميلانين (TYRP1، صور، OCA2 وPMEL) 25،26.
عزل الخلايا الصباغية الإنسان وmelanoblasts من المرضى غير مكلفة، وصعبة وتحد في الكمية. يتيح هذا البروتوكول الباحثون أن نفرق hPSCs (محدث أو الجنينية) في الخلايا الصباغية أو السلائف الصباغية في طريقة واضحة المعالم، السريع، قابلة للتكرار، قابلة للتطوير، وغير مكلفة من دون فرز الخلايا. تم استخدام بروتوكول سابقا لتحديد العيوب مرض محدد عند التفريق iPSCs من المرضى الذين يعانون من اضطرابات تصبغ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: بروتوكول الصباغية المذكورة هنا وقد تجلى أول مرة من قبل ميكا وآخرون.
1. إعداد الثقافة المتوسطة، المغلفة أطباق وصيانة hPSCs
- إعداد المتوسطة
ملاحظة: مخزن جميع المتوسطة في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 2 أسابيع. تصفية جميع المتوسطة للتعقيم.- إعداد DMEM / FBS 10٪. مزيج 885 مل DMEM، 100 مل FBS، 10 مل القلم / بكتيريا و 5 مل L-الجلوتامين. مرشح للتعقيم.
- إعداد HESC متوسطة. مزيج 800 مل DMEM / F12، 200 مل KSR، 5 مل L-الجلوتامين، 10 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية، 1 مل β-المركابتويثانول، و 5 مل القلم / بكتيريا. بعد تصفية إضافة 10 نانوغرام / مل جمعية جيل المستقبل-2.
- إعداد المتوسطة KSR-التمايز: اخلطي 820 مل خروج المغلوب DMEM، 150 مل KSR، 10 مل L-الجلوتامين، 10 مل القلم / بكتيريا، 10 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية و 1 مل β-المركابتويثانول. مرشح للتعقيم.
- إعداد المتوسطة N2-التمايز. حل 12 ز DMEM / F12 مسحوق طن 980 مل درهم 2 O. إضافة 1.55 ز الجلوكوز، 2 غرام بيكربونات الصوديوم و 100 ملغ APO ترانسفيرين الإنسان. مزيج 2 مل O 2 درهم مع 25 ملغ الأنسولين البشري و 40 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم. مرة واحدة المنحل، إضافة الخليط إلى المتوسطة. إضافة 100 ميكرولتر هيدروكلوريد بوتريسين، 60 سيلينات ميكرولتر، 100 البروجسترون ميكرولتر. جلب الحجم النهائي إلى 1 لتر مع DH 2 O قبل الترشيح.
- إعداد المتوسطة الصباغية كامل. الجمع بين 50٪ Neurobasal المتوسطة، و 30٪ انخفاض DMEM الجلوكوز، و 20٪ MCDB201. لهذه الإضافة: 0.8٪ ITS +، 250 نانومتر L-الجلوتامين، و 100 ميكرومتر حمض الأسكوربيك (L-AA)، 50 نانوغرام / مل الكوليرا السم، 50 نانوغرام / مل SCF، 0.05 ميكرومتر ديكساميثازون، 100 نانومتر EDN3، 4 نانوغرام / FGF2 مل . تصفية العقيمة ثم إضافة الكواشف المتبقية: 2٪ B27 الملحق، 25 نانوغرام / مل BMP4، CHIR99021 3 ميكرومتر، 500 ميكرومتر المخيم.
- طلاء من أطباق الثقافة
- تنفيذ الطلاء باستخدام بروتين هلامي مثل Matrigel. عند فتح قسامة، وتجميد Matrigel إلى 1 مل أجزاء لتجنب تكرار تجميد ذوبان الجليد جycles. ذوبان الجليد وإعادة تعليق 1 مل المجمدة قسامة مع 19 مل DMEM / F12. لوحة 5 مل على طبق 10 سم. احتضان الأطباق لمدة 1 ساعة على RT. نضح البروتين هلامي فورا قبل طلاء الخلايا ويغسل مع DMEM / F12.
- تنفيذ الطلاء باستخدام بولي-L ornithin هيدروبروميد / الماوس Laminin-I / فبرونيكتين (أ ف ب / لام / الجبهة الوطنية). طبق معطف مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 15 ميكروغرام / مل بولي-L ornithin هيدروبروميد. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب. نضح الحل وتغسل الصحون مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات قبل طلاء مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميكروغرام / مل الماوس Laminin-I و 2 ميكروغرام / مل فبرونيكتين. احتضان الأطباق O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب.
- قبل طلاء الخلايا، ونضح الحل والسماح لوحات تجف تماما من دون غطاء في نسيج الثقافة هود. السماح لوحات لتجف لمدة حوالي 10-15 دقيقة.
ملاحظة: أطباق جافة وجاهزة للطلاء الخلية عندما تظهر هياكل الكريستال على السطح عن طريق العين. بلاتوفاق يمكن أن تظل مع برنامج تلفزيوني تحتوي على لام / الجبهة الوطنية في الحاضنة لمدة أسبوعين، طالما لا يتبخر السائل. يمكن أن تبقى لوحات المجففة في RT لبضع ساعة.
- قبل طلاء الخلايا، ونضح الحل والسماح لوحات تجف تماما من دون غطاء في نسيج الثقافة هود. السماح لوحات لتجف لمدة حوالي 10-15 دقيقة.
- صيانة hPSCs
يتم الاحتفاظ hPSCs على الجيلاتين 0.1٪ والفأرة المعطل ميتوتيكلي الخلايا الليفية الجنينية (MEFS) في HESC المتوسطة: مذكرة. يجب تقسيم الخلايا كل 6-8 أيام.- معطف طبق 10 سم مع الجيلاتين 0.1٪ في برنامج تلفزيوني على RT لمدة 5 دقائق.
- ذوبان الجليد MEFS المجمدة بسرعة في حمام الماء 37 درجة مئوية.
- نضح الجيلاتين ولوحة الخلايا. MEFS لوحة في كثافة ~ 50000 خلية / سم 2 في DMEM / FBS 10٪. احتضان MEFS عند 37 درجة CO / N قبل إضافة hPSCs.
- نضح٪ FBS DMEM / 10 من لوحة MEF مستعدة، وغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 10 مل HESC متوسطة مع hPSCs. تمرير hPSCs في نسبة 1: 5/10 اعتمادا على كثافة قبل الركض.
ملاحظة: إذا كان يتم إذابة hPSCs أو passaged كما الخلايا وحيدة، سوبplement مع 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد (ROCKi) حتى مرور الأول. - تغذية خلايا يوميا مع الطازجة 10 مل HESC متوسطة.
- قبل بدء المفاضلة إزالة أي مستعمرات المحفزة التي يبدو أنها تحتوي على خلايا متباينة، حدود غير منتظمة، أو مراكز شفافة 28. ميكانيكيا طرد ونضح المستعمرات غير النظامية مع ماصة تحت غطاء تدفق الصفحي مع المجهر تشريح.
2. طلاء من hPSCs للتمايز
ملاحظة: يتم وصف الظروف التمايز عن 10 سم الأطباق.
- إعداد 10 سم أطباق Matrigel قبل بدء المفاضلة كما هو موضح في الخطوة 1.3.1.
- عندما تصفيح hPSCs للتمايز تبدأ مع لوحة من hPSCs في مناطق ذات كثافة جاهزة للمرور (~ 80٪ متموجة) نضح HESC المتوسطة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من التربسين 0.05٪-EDTA على الخلايا.
- هزة بقوة الأفقية طبقذ لمدة 2 دقيقة في حين تصور تحت المجهر حتى رفع MEFS قبالة كما الخلايا وحيدة. يجب أن تظل المستعمرات hPSC تعلق كما المستعمرات.
- نضح التربسين بعد أن رفع MEFS ولكن قبل فصل المستعمرات hPSCs.
- إضافة 10 مل من HESC متوسطة تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد لوحة وفصل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا على المستعمرات.
- نضح الحل Matrigel من الطبق 10 سم أعدت في الخطوة 2.1 ويغسل مع DMEM / F12 لإزالة كتل. لوحة للhPSCs في نسبة 1: 2 على لوحة Matrigel. إضافة HESC متوسطة تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد حتى 10ML. احتضان عند 37 درجة CO / N.
ملاحظة: هذا الطلاء ينبغي أن يؤدي إلى ما يقرب من 100،000 خلية / سم 2.
3. تحريض العصبية التمايز
ملاحظة: يجب أن تبدأ في التمايز (يوم 0) عندما hPSCs هي 80٪ متموجة. الخلايا ويمكن تغذية يوميا مع HESC المتوسطةتحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد حتى بداية التمايز.
- في اليوم 0 ويوم 1، تغذية الخلايا مع 10 مل من المتوسط KSR-التمايز تحتوي على 100 LDN193189 نانومتر و 10 ميكرومتر SB431542.
- في يوم 2، تغذية الخلايا مع 10 مل من المتوسط KSR-التمايز تحتوي على 100 نانومتر LDN193189، 10 ميكرومتر SB431542 و 3 ميكرومتر CHIR99021.
- في يوم 3، وإطعام الخلايا مع 10 مل من المتوسط KSR-التمايز تحتوي على 10 ميكرومتر SB431542 و 3 ميكرومتر CHIR99021.
- في أيام 4 و 5 تغذية الخلايا مع 15 مل من 75٪ المتوسطة KSR-التفاضل و 25٪ متوسطة N2 تمايز تحتوي على 3 ميكرومتر CHIR99021.
ملاحظة: لا تندهش لرؤية كمية كبيرة من موت الخلايا من حيث الخلايا العائمة. وهذا أمر طبيعي ومتوقع. - في أيام 6 و 7 تغذية الخلايا مع 15 مل من 50٪ المتوسطة KSR-التفاضل و 50٪ متوسطة N2 تمايز على حد سواء التي تحتوي على 3 ميكرومتر CHIR99021، 25 نانوغرام / مل BMP4، و 100 نانومتر EDN3.
- في أيام 8و9 تغذية الخلايا مع 20 مل من 25٪ المتوسطة KSR-التفاضل و 75٪ متوسطة N2 تمايز على حد سواء التي تحتوي على 3 ميكرومتر CHIR99021، 25 نانوغرام / مل BMP4، و 100 نانومتر EDN3.
- في أيام 9 و 10 إعداد أطباق PO / لام / FN كما هو مبين في 1.2.2 لإعادة الطلاء للخلايا في يوم 11.
- في يوم 10 خلايا تغذية مع 20 مل من المتوسط N2 تمايز تحتوي على 3 ميكرومتر CHIR99021، 25 نانوغرام / مل BMP4، و 100 نانومتر EDN3.
4. Replating في قطرات للمواصفات NC
- في يوم 11 نضح لام / FN من PO / لام / لوحات FN مستعدة ويجف تماما.
- إزالة المتوسطة اعتبارا من يوم 11 خلية، وغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة 4 مل من محلول خلية مفرزة مثل Accutase في صحن 10 سم. احتضان لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من الصباغية كاملة المتوسطة إلى الطبق وresuspend الخلايا بواسطة pipetting يدويا صعودا وهبوطا مع ماصة 10 مل حتى رفع جميع الخلايا قبالة اللوحة. نقل تعليق على أنبوب 15 مل.
- تدورخلايا لمدة 5 دقائق في 200 x ج و resuspend الخلايا في 2 × 10 6 خلايا لكل مل في الصباغية كاملة المتوسطة. عد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق على عدادة الكريات أو تقنية مماثلة.
- قطرات لوحة 10 ميكرولتر قريبة من بعضها البعض (دون أن لمس) على المجففة PO / لام / FN 10 سم الأطباق. إذا كانت لوحة تم تجفيفها بشكل كاف، يجب قطرات حددت جيدا الحواف ويتم تشغيل.
ملاحظة: هذا يخلق بيئة المحلية ذات الكثافة العالية للخلايا، وهو أمر مهم عندما replating الخلايا، مع الحفاظ على غرفة داخل صحن للتوسع. - السماح لقطرات للوقوف على RT لمدة 10-20 دقيقة للسماح للخلايا على الانضمام، ثم ببطء (لا تعكر صفو خلايا المرفقة) إضافة 10 مل من الصباغية كاملة المتوسطة. نقل الطبق إلى الحاضنة.
5. التوسع الصباغية أسلاف
- تواصل تغذية مع متوسط الصباغية كامل كل 2 إلى 3 أيام.
ملاحظة: التصبغ ينبغي أن تبدأ لتكون واضحة ثithin مجموعات من الخلايا في نهاية الأسبوع الأول وأصبح واضحا جدا في الأسبوع الثاني. عرض لوحة على خلفية بيضاء مثل ورقة لتمييز هذه في وقت مبكر، مجموعات صغيرة مظلمة. وسوف تصبح الخلايا تدريجيا أكثر المصطبغة مع مرور الوقت، حتى لوحة كلها مصطبغة موحد (انظر الشكل 2B). - خلايا مرور مرة واحدة في الأسبوع على نسبة من ~ 1: 6 (الطلاء كما قطرات لم يعد من الضروري في هذه المرحلة). استخدام Accutase لفصل الخلايا ويغسل مرتين مع المتوسطة Neurobasal عادي قبل إعادة الطلاء في الصباغية كاملة المتوسطة. الحفاظ على الخلايا على PO / لام / لوحات FN.
ملاحظة: لقد وجدنا أن المتوسط الصباغية كامل الأنسب للحفاظ على وتوسيع HESC والخلايا الصباغية المستمدة التوجيهية. ومع ذلك، يمكن أن تكون الخلايا مثقف لفترة وجيزة في المتوسط M254 المتاحة تجاريا ولكن وسائل الإعلام مبسطة يزيد من خطر الخلايا الميتة ورفع قبالة لوحة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوفر هذا البروتوكول طريقة لاستخلاص المصطبغة تماما، الخلايا الصباغية ناضجة من hPSCs في في المختبر خالية المغذية، فعالة من حيث التكلفة، وقابلة للتكرار الطريقة. وعلى النقيض من فانغ بروتوكول آخرون المحددة سابقا لالخلايا الصباغية المستمدة hPSC، بروتوكول المبينة لا تتطلب المتوسطة مكيفة ويقلل من متطلبات الوقت. بروتوكول فانغ وآخرون الاستفادة المتوسطة مشروط من خط خلايا الفئران المنتجة للWNT3A واستغرق مدة تصل إلى 6 أسابيع لتصور تصب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لالتمايز الناجح الخلايا الصباغية من hPSCs ينبغي أن تؤخذ في الاقتراحات التالية بعين الاعتبار. أولا وقبل كل شيء، لا بد من العمل في ظل ظروف ثقافة عقيمة في جميع الأوقات. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن تبدأ مع المحفزة، hPSCs غير متمايزة تماما. إذا كان السكان بدءا يحتوي على خلايا متباينة العائد سوف ينخفض دائما كما الملوثات لا يمكن أن تكون موجهة نحو الخلايا الصباغية وحتى قد تزيد من تعطيل الخلايا التفريق بشكل صحيح.
لضما...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل الزمالة للباحثين سرطان الجلد من مؤسسة جوانا م نيكولاي ومن قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت روث L. جائزة الخدمة القومي للبحوث كيرشتاين F31. وأيد هذا العمل كذلك من خلال المنح المقدمة من NYSTEM ومبادرة الخلايا الجذعية ثلاثي المؤسسية (مؤسسة ستار).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo ترانسفيرين البشري | Sigma | T1147 | |
| حمض الأسكوربيك (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 ملي |
| مولار B27 (مكمل B27) | Invitrogen | 17504044 | |
| & beta - Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 مجم / مل |
| BMP4 | R & D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R& D Systems | 4423 | 6 ملي توكسين |
| الكوليرا | سيجما | C8052 | 50 مجم / مل |
| cAMP (دوري | سيجما | D0627 | 100 ملي مولار |
| ديكساميثازون | سيجما | D2915-100 ملغ | 50 مو ؛ M |
| DMEM - تقنيات النسر المعدل المعدل | Gibco-Life | 11985-092 | |
| DMEM / F12 - وسط النسر المعدل من Dulbecco: خليط المغذيات F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| مسحوق DMEM / F12 | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3 ، الإنسان) شركة | الببتيد الأمريكية | 88-5-10B | 100 & mu ؛ إم |
| فيبرونيكتين | BD للعلوم البيولوجية | 356008 | 200 مو ؛ جم / مل |
| جيلاتين (PBS بدون Mg / Ca) | في المنزل | 0.1٪ في PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| الأنسولين البشري | Sigma | I2643 | |
| ITS + مكمل الثقافة العالمي Premix ؛ | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (استبدال مصل بالضربة القاضية) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| منخفض الجلوكوز DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| مصفوفة Matrigel | BD Biosciences | 354234 | تذوب 1:20 في DMEM / F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM الحد الأدنى من محلول الأحماض الأمينية الأساسية | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| الخلايا الليفية الجنينية للفأر (7 ملايين خلية / قارورة) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R & D Systems | 3400-010-01 | 1 مجم / مل |
| متوسط عصبي | القاعدي Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U / ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg / ml & nbsp ؛ |
| البروجسترون | سيجما | P8783 | 0.032 جم في 100 مل 100٪ إيثانول |
| بوتريسين ثنائي هيدروكلوريد | سيجما | P5780 | |
| FGF2 (مؤتلف بشري FGF أساسي) | R & D Systems | 233-FB-001MG / CF | 10 مجم / مل |
| SB431542 | Tocris-R & D Systems | 1814 | 10 mM |
| السيلينيت | Sigma | S5261 | |
| بيكربونات الصوديوم | Sigma | S5761 | |
| SCF (عامل الخلايا الجذعية ، الإنسان المؤتلف) ؛ | شركة Peprotech | 300-07 | 50 مو ؛ جم / مل |
| TYRP1 (G-17) الأجسام المضادة | سانتا كروز | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 الأجسام المضادة | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05٪) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد | Tocris-R & أنظمة D | 1254 | 10 ملم |
المراجع
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064(2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
