يصف هذا العمل في المختبر بروتوكول التمايز لإنتاج الصباغية، الخلايا الصباغية ناضجة من خلايا جذعية المحفزة الإنسان عبر قمة العصبية وميلانينية المرحلة المتوسطة باستخدام، بروتوكول خالية من تغذية 25 يوما.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمثل
الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) منصة لدراسة التنمية البشرية في المختبر في ظل الظروف الطبيعية والمرضية. يمكن للباحثين توجيه تمايز hPSCs إلى نوع الخلية ذات الأهمية من خلال التلاعب بظروف الثقافة لتلخيص الإشارات التي شوهدت أثناء التطور. أحد أنواع الخلايا هو الخلايا الصباغية ، وهي خلية منتجة للصبغة من أصل القمة العصبية (NC) مسؤولة عن حماية الجلد من الأشعة فوق البنفسجية. يقدم هذا البروتوكول امتدادا لبروتوكول تمايز القمة العصبية المتاح حاليا في المختبر من hPSCs لزيادة تمييز NC إلى خلايا ميلانينية مصطبغة بالكامل. يمكن إثراء سلائف الخلايا الصباغية من بروتوكول Neural Crest عبر التعرض الموقوت لمنشطات إشارات WNT و BMP و EDN3 في ظل ظروف تثبيط SMAD المزدوج. ثم يتم تنقية سلائف الخلايا الصباغية الناتجة ونضجها إلى خلايا ميلانينية مصطبغة بالكامل عن طريق الاستزراع في وسط انتقائي الخلايا الصباغية الناتجة مصطبغة بالكامل وتلطخ بشكل مناسب للبروتينات المميزة للخلايا الصباغية الناضجة.
المقدمة
الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) توفير منصة لتقليد التمايز الطبيعي بطريقة قابلة للنمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاجات البديلة للخلية 1-6. ذات أهمية خاصة، hPSCs تفتح آفاقا لدراسة الصعب عزل أو أنواع الخلايا نادرة / عابرة حيث عينات المرضى شحيحة. وعلاوة على ذلك، التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمكن الباحثون لدراسة تطوير والنمذجة المرض بطريقة محددة المريض لكشف آليات فريدة 1،2،7-11. يتطلب بروتوكول نشرت سابقا عن تمايز الخلايا الصباغية من hPSCs تصل إلى 6 أسابيع من التفرقة وينطوي على خلايا زراعة مع المتوسط مكيفة من خلايا L-Wnt3a 12. بروتوكول قدمت لأول مرة من قبل ميكا وآخرون
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: بروتوكول الصباغية المذكورة هنا وقد تجلى أول مرة من قبل ميكا وآخرون.
1. إعداد الثقافة المتوسطة، المغلفة أطباق وصيانة hPSCs
- إعداد المتوسطة
ملاحظة: مخزن جميع المتوسطة في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 2 أسابيع. تصفية جميع المتوسطة للتعقيم.- إعداد DMEM / FBS 10٪. مزيج 885 مل DMEM، 100 مل FBS، 10 مل القلم / بكتيريا و 5 مل L-الجلوتامين. مرشح للتعقيم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوفر هذا البروتوكول طريقة لاستخلاص المصطبغة تماما، الخلايا الصباغية ناضجة من hPSCs في في المختبر خالية المغذية، فعالة من حيث التكلفة، وقابلة للتكرار الطريقة. وعلى النقيض من فانغ بروتوكول آخرون المحددة سابقا لالخلايا الصباغية المستمدة hPSC، بروتوكول المبينة لا تتطلب المتوسطة مكيفة ويقلل من متطلبات الوقت. بروتوكول فانغ وآخرون الاستفادة المتوسطة مشروط من خط خلايا الفئران المنتجة للWNT3A واستغرق مدة تصل إلى 6 أسابيع لتصور تصب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لالتمايز الناجح الخلايا الصباغية من hPSCs ينبغي أن تؤخذ في الاقتراحات التالية بعين الاعتبار. أولا وقبل كل شيء، لا بد من العمل في ظل ظروف ثقافة عقيمة في جميع الأوقات. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن تبدأ مع المحفزة، hPSCs غير متمايزة تماما. إذا كان السكان بدءا يحتوي على خلايا متباينة العائد سوف ينخفض دائما كما الملوثات لا يمكن أن تكون موجهة نحو الخلايا الصباغية وحتى قد تزيد من تعطيل الخلايا التفريق بشكل صحيح.
لضما.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل الزمالة للباحثين سرطان الجلد من مؤسسة جوانا م نيكولاي ومن قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت روث L. جائزة الخدمة القومي للبحوث كيرشتاين F31. وأيد هذا العمل كذلك من خلال المنح المقدمة من NYSTEM ومبادرة الخلايا الجذعية ثلاثي المؤسسية (مؤسسة ستار).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo ترانسفيرين البشري | Sigma | T1147 | |
| حمض الأسكوربيك (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 ملي |
| مولار B27 (مكمل B27) | Invitrogen | 17504044 | |
| & beta - Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 مجم / مل |
| BMP4 | R & D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R& D Systems | 4423 | 6 ملي توكسين |
| الكوليرا | سيجما | C8052 | 50 مجم / مل |
| cAMP (دوري | سيجما | D0627 | 100 ملي مولار |
| ديكساميثازون | سيجما | D2915-100 ملغ | 50 مو ؛ M |
| DMEM - تقنيات النسر المعدل المعدل | Gibco-Life | 11985-092 | |
| DMEM / F12 - وسط النسر المعدل من Dulbecco: خليط المغذيات F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| مسحوق DMEM / F12 | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3 ، الإنسان) شركة | الببتيد الأمريكية | 88-5-10B | 100 & mu ؛ إم |
| فيبرونيكتين | BD للعلوم البيولوجية | 356008 | 200 مو ؛ جم / مل |
| جيلاتين (PBS بدون Mg / Ca) | في المنزل | 0.1٪ في PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| الأنسولين البشري | Sigma | I2643 | |
| ITS + مكمل الثقافة العالمي Premix ؛ | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (استبدال مصل بالضربة القاضية) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| منخفض الجلوكوز DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| مصفوفة Matrigel | BD Biosciences | 354234 | تذوب 1:20 في DMEM / F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM الحد الأدنى من محلول الأحماض الأمينية الأساسية | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| الخلايا الليفية الجنينية للفأر (7 ملايين خلية / قارورة) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R & D Systems | 3400-010-01 | 1 مجم / مل |
| متوسط عصبي | القاعدي Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U / ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg / ml & nbsp ؛ |
| البروجسترون | سيجما | P8783 | 0.032 جم في 100 مل 100٪ إيثانول |
| بوتريسين ثنائي هيدروكلوريد | سيجما | P5780 | |
| FGF2 (مؤتلف بشري FGF أساسي) | R & D Systems | 233-FB-001MG / CF | 10 مجم / مل |
| SB431542 | Tocris-R & D Systems | 1814 | 10 mM |
| السيلينيت | Sigma | S5261 | |
| بيكربونات الصوديوم | Sigma | S5761 | |
| SCF (عامل الخلايا الجذعية ، الإنسان المؤتلف) ؛ | شركة Peprotech | 300-07 | 50 مو ؛ جم / مل |
| TYRP1 (G-17) الأجسام المضادة | سانتا كروز | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 الأجسام المضادة | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05٪) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد | Tocris-R & أنظمة D | 1254 | 10 ملم |
المراجع
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
