يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة الخلايا الأولية الأنف طلائي من الأطفال وإعادة برمجة وإلى خلية جذعية مستحثة وافرة القدرة

11K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53814

⸱

مارس 10, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

< ص الفئة = 'jove_content'>يوضح هذا المنشور طرقا لأخذ العينات الناجحة واستزراع الغشاء المخاطي الظهاري الأنفي من الأطفال ، وإعادة برمجة هذه الخلايا إلى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs).

الملخص

الخلايا الظهارية الأنفية (NECs) هي جزء من الشعب الهوائية يستجيب لملوثات الهواء وهي الخلايا الأولى المصابة بفيروسات الجهاز التنفسي. كما أنها تشارك في العديد من أمراض مجرى الهواء من خلال استجابتها المناعية الفطرية وتفاعلها مع الخلايا اللحمية المناعية ومجرى الهواء. تحظى NECs بأهمية خاصة للدراسات التي أجريت على الأطفال نظرا لإمكانية الوصول إليها أثناء الزيارات السريرية. تم إنشاء الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPSCs) من أنواع متعددة من الخلايا وهي أداة قوية لنمذجة التنمية البشرية والمرض ، وكذلك لتطبيقاتها المحتملة في الطب التجديدي. هذا هو البروتوكول الأول الذي يضع طرقا لنجاح توليد iPSCs من NECs المستمدة من المشاركين في طب الأطفال لأغراض البحث. يصف كيفية الحصول على الخلايا الظهارية الأنفية من الأطفال, كيفية توليد ثقافات NEC الأولية من هذه العينات, وكيفية إعادة برمجة NECs الأولية إلى iPSCs مميزة بشكل جيد. تعتبر عينات الغشاء المخاطي للأنف مفيدة في الدراسات الوبائية المتعلقة بآثار تلوث الهواء عند الأطفال ، وتوفر أداة مهمة لدراسة أمراض مجرى الهواء. يمكن أن تكون الخلايا الأنفية الأولية و iPSCs المشتقة منها أداة لتوفير مواد غير محدودة للأبحاث الخاصة بالمريض في مجالات متنوعة من البيولوجيا الظهارية لمجرى الهواء ، بما في ذلك أبحاث الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن.

المقدمة

الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة من عينات الإنسان (hiPSCs) هي تكنولوجيا سريعة النمو أبحاث الخلايا الجذعية. أنها توفر بديلا لأبحاث الخلايا الجذعية الجنينية (HESC) مع عدد أقل بكثير من العيوب الأخلاقية والمعنوية 1،2. على الرغم من أنها ليست متطابقة epigenetically إلى hESCs 3-5، hiPSCs تقدم طريقة فريدة من نوعها لنموذج الظواهر التنمية والمرض، وأنها يمكن أن تستمد من الأنسجة ذات الصلة للدولة مرض 5-8. يجري باستمرار استكشاف طرق جديدة لتوليد hiPSCs لتحديد أنواع الخلايا الأمثل لتبدأ، باعتبارها وسيلة لإعداد iPSCs GMP ذات جودة مناسبة لزراعة الأعضاء، وأيضا إلى زيادة في الوقت المناسب وكفاءة عملية إعادة برمجة 6،9-11.

الهوائية الخلايا الظهارية حاسمة في تطور الالتهاب التحسسي 12، وظهارة هي المحرك الرئيسي للاستجابات الحساسية وإعادة مجرى الهواء من خلال التفاعل مع إمانه وانسجة الخلايا. ظهارة الهوائية تلعب دورا أساسيا في نشأة واستمرار أمراض الرئة مثل الربو. ومع ذلك، أقل الهوائية الخلايا الظهارية من الصعب الحصول عليها في عملية إعداد سريرية، وخاصة من المرضى الأصحاء والأطفال. بيانات من عدة دراسات تدعم فرضية أن الخلايا الظهارية من الغشاء المخاطي للأنف هي وكيل صالح والعملي لانخفاض مجرى الهواء الخلايا الظهارية 13-20، وخاصة عند دراسة الاستجابات لملوثات الهواء والمواد المسببة للحساسية. يتكون الغشاء المخاطي للأنف من أكثر من 90٪ الهوائية مهدبة الخلايا الظهارية وأخذ عينات من هذه الخلايا الظهارية الأنفية (NECS) لا يمكن أن يؤديها بسهولة في أطفال لا تتجاوز أعمارهم سن أربعة أو خمسة، كما أنه أقل الغازية من أساليب أخذ العينات الأخرى خلية / الأنسجة وغير يرتبط مع الحد الأدنى من خطر الآثار الجانبية مثل العدوى 20-23. ويقدم وسيلة سريعة وبسيطة لأخذ عينات الأطفال الأصحاء والأطفال المريضة دون طويلة، لا لزوم لها، وغالبا ما تكون مؤلمة procedu القصباتالدقة التي تتطلب التخدير. وقد وجدت دراسات سابقة أن الأنواع الفرعية مرض يتصل شدة الربو ويمكن التمييز في كل من الغشاء المخاطي للأنف وكذلك عينات من الخلايا الهوائية يؤخذ من الأطفال المصابين بالربو، وكان التعبير الجيني بين أنواع الأنسجة اثنين مماثل في حوالي 90٪ من الجينات غير كل مكان 22 24. كمصدر للiPSCs، NECS تقديم مزايا أكثر أنواع الخلايا الأخرى المستخدمة بشكل متكرر. وغالبا ما تستخدم الخلايا الليفية لتوليد التوجيهية، ولكن على الرغم من أن هذه الخلايا يمكن بسهولة مثقف من خزعة الجلد، وهذه العملية عادة ما يتطلب تخدير موضعي، شق، والخيوط الجراحية، ويرتبط مع بعض مخاطر العدوى. لذلك، والحصول على الموافقة المسبقة من المرضى لهذا النوع من الخزعة قد يكون من الصعب 25. بديل واحد إلى الخلايا الليفية هي هامشية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs). ومع ذلك، قد يكون من الصعب الحصول على كمية كافية من الدم لتوليد IPSC من الأطفال المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، هناك قيود ا ف ب المصبplications لالليفية وiPSCs خلايا الدم المشتقة منها، خصوصا قدرة التمايز لبعض أنواع الخلايا 5،26. لذلك، نظرا لإمكانية الوصول النسبي وانخفاض مخاطر الآثار الجانبية التالية جمعها، تمثل NECS مصدر خلية مثالية لتوليد IPSC من السكان الأطفال.

وقد تلقى iPSCs الكثير من الاهتمام في الآونة الأخيرة كمنصة لدراسة التنمية البشرية، وتوليد نماذج المرض جديدة، وكمصدر محتمل للخلايا لعلاجات شخصية. قبل الإمكانات الكاملة لهذه التكنولوجيا يمكن أن تتحقق، في حاجة إلى الأسس الجزيئية لعملية إعادة البرمجة إلى توضيح، ولكن في الوقت الحالي فإن هذا البروتوكول والإجراءات المبينة في إلقاء الضوء على الدراسات البحثية التي تركز على التعرض مجرى الهواء، وكذلك توفر منبرا لل دراسة آثار الأدوية شخصية تنطوي على iPSCs.

وقد أدى العمل التعاوني من عدة مختبرات للgeneratioن من تقنية ناجحة ليس فقط لأخذ عينات من الغشاء المخاطي للأنف، ولكن أيضا زراعة NECS، وإعادة برمجة هذه الخلايا iPSCs 23. وتنص هذه المادة على الخطوط العريضة لبروتوكول لأخذ العينات المثلى، زراعة، وشروط إعادة برمجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتبع بروتوكول التالية للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث الإنسان والمؤسسات.

1. أخذ عينات من النسيج المخاطي

ملاحظة: الحصول على عينات من الاشخاص الذين تكون خالية من علامات العدوى الفيروسية في الجهاز التنفسي.

  1. إعداد 15 مل الطازجة المخروطية قبل الزيارة مشارك وإضافة 2 مل BEGM (الشعبي طلائي متوسط ​​نمو الخلايا) بالإضافة إلى 20 ميكرولتر العقيمة بن / بكتيريا / Fungizone (P / S / F) (0.01٪).
  2. فتح فرشاة علم الخلايا قبل أخذ عينة، ومما لا شك فيه للحفاظ على فرشاة معقمة ولا لمسها إلى أي الأسطح إلى جانب الأسطح الأنفية.
  3. اسأل المشاركين على الجلوس لا يزال وإمالة الرأس حتى نحو السقف. يكون أصغر أو الأطفال أكثر قلقا الجلوس على أيديهم و / أو الاستلقاء لتفادي السحق فرشاة بعيدا.
  4. تهدف فرشاة في الجزء الخلفي من الأنف حيث يضيق الممر (يبدو وكأنه ثقب أسود صغير). حرك الفرشاة أسفل وتطور المعصمين كما هو إزالة فرشاة من nostriل.
  5. وضع الفرشاة في المخروطية ويغرق في BEGM. قطع فرشاة الزائدة واستبدال الغطاء على أنبوب. لا الدوامة.
    ملاحظة: إذا كان المشارك على استعداد، للحصول على فرشاة الثانية بنفس الطريقة ولكن في المنخر الثاني. والحصول على بالفرشاة من فتحتي الأنف يؤدي إلى ارتفاع احتمال أن أخذ العينات ستكون ناجحة. أخذ عينات من نفس الأنف قد يؤدي إلى النزيف وسوف لا يحتمل تحسين العينة.
  6. الاحتفاظ بعينات أقرب إلى 37 درجة مئوية وقت ممكن أثناء النقل باستخدام الدورق مع الماء الدافئ.

2. عدد خلايا وCytospin

  1. تستنهض الهمم بلطف فرشاة في BEGM ويستغرق 10 ميكرولتر من عينة لعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. إضافة 10 ميكرولتر من / وصمة عار الميتة الحية والاعتماد فقط تعيش الخلايا تحت المجهر.
  2. خذ 50 ميكرولتر من العينة وتمييع إلى 200 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني 1X. إضافة إلى قمع cytospin تعلق على شريحة زجاجية وتدور في 300 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. السماح الشريحة الجافة O / N وصمة عار شريحة followinتعليمات ز المصنعة. السماح ليجف O / N، ويفضل أن يكون في الظلام.
  3. الشريحة وصمة عار مع هيما 3 وصمة عار
    1. نقل كل حل (هيما تثبيتي والأزرق الفاتح، هيما 3 الحل الأول، وردي، وهيما 3 الحل الثاني والأزرق العميق) في طبق تلطيخ. حافظ على تغطيتها عندما لا تكون قيد الاستعمال. إدراج الشرائح في قارب تلطيخ الشريحة
    2. تراجع الشرائح بشكل مستمر في تثبيتي لمدة 30 ثانية، ثم تسمح الزائدة لاستنزاف. تراجع الشرائح بشكل مستمر في الحل الأول لمدة 30 ثانية، ثم السماح الزائدة لاستنزاف. تراجع الشرائح بشكل مستمر في الحل الثاني لمدة 30 ثانية، ثم السماح لاستنزاف فائض
    3. شطف مع الماء منزوع الأيونات حتى ينتهي الماء واضحة. السماح ليجف O / N، ويفضل أن يكون في الظلام
  4. انظروا إلى شريحة تحت المجهر الخلايا والعد، وتحديد النسبة المئوية للخلايا الظهارية. يجب أن تكون 90٪ أو أكثر إذا أخذ العينات جيدة.

3. خلايا البذر

ملاحظة: القيام بجميع إجراءات زراعة الخلايا في نسيج الثقافة الصحيحة والمعتمدةغطاء محرك السيارة باستخدام تقنية معقمة.

  1. لوحات معطف مع الأبقار عن طريق الجلد الكولاجين (BDC)، نوع 1. إضافة 0.5 مل من 3 ملغ / مل BDC مخففة في 49.5 مل برنامج تلفزيوني 1X. إعداد أقل إذا كان سيتم استخدامها فقط لوحات قليلة. معطف قارورة T25 مع 2 مل BDC واحتضان في العقيمة هود O / N أو عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، إذا لزم الأمر.
  2. بعد الحضانة، ونضح أي السائل المتبقي. كشف قوارير للأشعة فوق البنفسجية ل30min في في غطاء العقيمة. تخزين قوارير لمدة تصل إلى شهر واحد في 4 درجات مئوية، ولكن تقديمهم إلى RT أو 37 درجة مئوية قبل البذر الخلايا.
  3. إبقاء فرشاة والخلايا في BEGM عند 37 درجة مئوية حتى جاهزة للالبذور. بلطف فرشاة حفيف داخل المخروطية، ولكن لا الدوامة.
    1. لوحة 7 × 10 5 خلايا في قارورة T25. إذا كان هناك أقل، واستخدام وعاء أصغر، وأيضا مثل واحد من لوحة 6 جيدا. هذه لوحة حجم يتطلب حوالي 3 × 10 5 خلايا.
      ملاحظة: إذا لم تكن هناك العديد من هذه الخلايا، ومن غير المستحسن للمتابعة.
  4. تحت غطاء العقيمة، واتخاذ فرشاة للخروج من أنبوب وجنرال الكتريكntly تدوير الفرشاة على سطح القارورة المغلفة، والحرص على عدم خدش الطلاء. تجاهل فرشاة في وعاء واقية مناسبة.
  5. ببطء ماصة الخلايا المتبقية في BEGM من المخروطية وفي قارورة T25. مراقبة الخلايا تحت المجهر. وسيراعى عدد الخلايا العائمة ويمكن أن يكون هناك بعض الحطام من الأنف، والتي هي مقبولة في هذه المرحلة (الشكل 3A).

الثقافة 4. خلية

  1. بعد البذر الخلايا، والسماح لهم تسوية لمدة 48 ساعة دون انقطاع (الشكل 3). بعد 48 ساعة، ببطء وبرفق إضافة 2 مل دافئ BEGM و 20 ميكرولتر العقيمة بنسلين / الستبرتوميسين / Fungizone (P / S / F).
    ملاحظة: لا نضح الأصلي 2 مل من وسائل الاعلام.
  2. في اليوم ال 4 بعد الغرس، ونضح بعناية كل السائل، واستبدالها مع 4 مل جديدة، تحسنت BEGM زائد 1X القلم / بكتيريا (fungizone لم يعد ضروريا). تغيير وسائل الاعلام كل يومين وتقييم خلايا لإرفاقمنة، والنمو، والتقاء. عندما تصل خلايا ~ 80٪ التقاء، عادة في غضون 2-3 أسابيع، وتكون جاهزة للpassaged.
  3. واحد قارورة T25 (حوالي 2.5 × 10 6 خلايا عندما متموجة) يمكن passaged إلى ثلاث قوارير T25 أو قارورة T75 واحد. بعد مرور الأول، وينبغي أن تكون خلايا قوية وصحية، والوصول إلى نقطة التقاء حول كل ثلاثة أيام.

5. الخلايا الركض

  1. نضح بلطف وسائل الإعلام من لوحة. إضافة 1 مل 0.05٪ حل التربسين في قارورة T25 لوحة ووضعه في الحاضنة لمدة 4min، أو حتى فصل الخلايا من لوحة. فحص مستوى مفرزة من الخلايا كل دقيقة 2 و لا تترك التربسين لفترة أطول من 10 دقيقة.
  2. إضافة 5 مل التربسين تحييد الحل (TNS)، أو وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل لتحييد الانزيم. إزالة جميع السائل والخلايا من القارورة ووضعه في أنبوب مخروطي 15 مل.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج (تسارع 0 التباطؤ 0) لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه الخلية. نضح supernaتانت و resuspend الخلايا في BEGM + P / S في حجم اللازمة لقوارير جديدة (4 مل قارورة T25، 10 مل قارورة T75)
  4. أداء عدد الخلايا مع / وصمة عار الميتة الحية كما هو موضح أعلاه (2.1). إضافة كمية مناسبة من BEGM والخلايا إلى قوارير المغلفة والعودة إلى الحاضنة. الحفاظ على النحو المفصل أعلاه أو cryopreserve في تجميد المتوسطة (70٪ BEGM، و 20٪ FBS و 10٪ DMSO) بتركيز 0.5-2 × 10 6 خلايا لكل مل.

6. إعادة برمجة لiPSCs

ملاحظة: قبل أن تولد iPSCs، وضمان الالتزام بجميع القواعد المؤسسية التي تحكم توليد واستخدام iPSCs الإنسان. تقنية معقمة أهمية خاصة للثقافات التوجيهية، كما مستنبت لا يحتوي بشكل روتيني المضادات الحيوية. ومن الأهمية بمكان أن NECS تظهر صحية وغير التكاثري لإعادة البرمجة الناجحة بقوة.

  1. لوحة 5 × 10 5 NECS لكل بئر من 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة. بعد 24 ساعة، إضافة polybreneلBEGM إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل وتنبيغ NECS بإضافة جزيئات lentiviral معربا عن Oct4، Sox2، Klf4، ج. Myc على وسائل الإعلام. نهدف إلى تحقيق وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من ~ 5 27.
    1. لتحديد وزارة الداخلية، وإعداد التخفيفات المسلسل من الأسهم مركزة lentiviral وتنبيغ الخلايا HT1080 مع هذه التخفيفات. بعد الكشف لأول مرة بشكل لا لبس فيه التعبير dTomato في الخلايا HT1080، وحساب عدد من "وحدات transducing / مل" بتسجيله عدد dTomato إيجابية خلية / كتل صغيرة من الخلايا في كل تخفيف.
      ملاحظة: عادة، سوف يكون هناك التخفيفات التي هي عالية جدا (كل شيء dTomato إيجابية) ومنخفضة جدا (لا شيء أو اثنين فقط من خلايا إيجابية).
    2. أداء التهديف من التخفيفات التي يتم فيها تحديد خلايا إيجابية منفصلة / كتل صغيرة من الخلايا. تحديد عيار عن طريق تصحيح عدد من transducing وحدة / مل مع عامل التخفيف المناسبة. وزارة الداخلية وقتئذ نسبة عددمن transduced الخلايا إلى عدد من جزيئات الفيروس 27.
      ملاحظة: يفترض كل dTomato خلية إيجابية / أجمة صغيرة ينبغي ان ينطلق من جسيمات الفيروس واحد.
  2. حوالي 3 ساعة بعد تنبيغ، وإزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع BEGM جديدة. تجاهل وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروسة البطيئة باستخدام الإجراءات المعتمدة مؤسسيا. العودة NECS transduced إلى الحاضنة لمدة 3 أيام.
  3. في يوم 3، واستبدال وسائل الإعلام مع BEGM جديدة، ومن ثم احتضان لمدة 3 أيام أخرى. قضى نضح وسائل الإعلام، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 1 مل 0.05٪ التربسين حل جيد. خلايا مرور مع التربسين كما هو مكتوب أعلاه (القسم 5). بعناية نضح خلايا وطاف resuspend في 4 مل BEGM + P / S. الخلايا يمكن passaged إلى بئر جديد من لوحة 6 جيدا المغلفة مع BDC، أو تضاف إلى الثقافات MEF، لو كان على استعداد (راجع الخطوة التالية).
  4. إعداد MEF لوحات المغلفة. في يوم 4 إضافة 0.1٪ محلول الجيلاتين (1 مل / جيد) إلى 2 آبار ل6 جيدا (لتنفيذ +/- Thiazovivin (SPT) راجع الخطوة 6.6). على التالياليوم، ذوبان الجليد قارورة من MEFS المعطل 28.
  5. وضع MEFS إلى 10 مل من وسائل الاعلام MEF (DMEM + 1X NEAA + 10٪ عملية DfCS). تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق لبيليه. resuspend في وسائل الإعلام MEF. الجيلاتين نضح من لوحة 6 جيدا وإضافة 1.87 × 10 5 MEFS لكل بئر من لوحة 6 جيدا المغلفة الجيلاتين. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، أو لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
  6. نقل 2 مل من BEGM تحتوي على خلايا transduced لكل بئر إلى 2 آبار المغلفة سابقا لوحة 6 جيدا واحتضان O / N. في اليوم التالي، استبدال BEGM مع 2.5 مل لكل بئر من وسائل الإعلام HESC القياسية التي تحتوي على 4 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية. تغذية الخلايا مع وسائل الإعلام HESC جديدة +/- SPT يوميا لمدة 10 أيام
    ملاحظة: من الممكن لإضافة مزيج من جزيئات صغيرة (SB431542، PD0325901، وThiazovivin (SPT) كوكتيل) لتعزيز الكفاءة وحركية برمجة لل NECS 23.
  7. بعد عشرة أيام، والاستمرار في تغذية يوميا باستخدام HESC وسائل الإعلام دون الفرعية. تغذية الثقافات يوميا حتى المستعمرات مثل HESCتظهر (الشكل 5A، P0 مستعمرة). تحديد المستعمرات إيواء iPSCs المفترضة من قبل نواة العالية: نسبة حشوية ونويات بارزة.
  8. يدويا المكوس ونقل المستعمرات مع التشكل مثل HESC لفصل آبار للثقافة والتوسع كخطوط منفصلة في نظام خالية المغذية. يجب المستعمرات رفعه التكيف بسرعة مع هذه الظروف.
    1. بعد طلاء رفعه المستعمرات تعتبر هذه الخطوط التوجيهية المفترضة منفصلة الآن مرور 1 (P1). الثقافات تغذية يوميا مع mTeSR1. مرور وتوسيع خطوط التوجيهية باستخدام إجراءات القياسية. قد يستغرق عدة أيام إلى أسبوع للمستعمرات P1 للوصول إلى الحجم الذي ينبغي أن تكون passaged.

7. الحفاظ على iPSCs في الثقافة

  1. تغذية وتقييم الثقافات يوميا. يدويا المناطق المكوس نستعرض التمايز العلني عن طريق كشط مع ماصة زجاجية معقمة أو الجزئي طرف ماصة. تغيير وسائل الاعلام بعد قطف اليومي.
  2. خلايا مرور بعد approximately كل أربعة أيام: بلطف وسائل الاعلام نضح، إضافة 1 مل Dispase الدافئة (1 ملغ / مل) لكل بئر من لوحة 6 جيدا (نصف حجم التغذية)، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. وحواف المستعمرات تبدأ لرفع، الذي يبدو وكأنه مخطط أبيض حول المستعمرة. نضح بلطف Dispase وغسل 3X مع درجة حرارة DMEM / F12.
  3. إضافة 2 مل mTeSR1 واستخدام رافع الخلية إلى رفع مستعمرات من لوحة. استخدام ماصة 5 مل المصلية أو micropipette P1000 ليسحن بلطف الخلايا حتى يتم تقسيم المستعمرات إلى مجموعات أصغر.
    1. تجنب إنتاج مجموعات صغيرة جدا أو الخلايا وحيدة، والبقاء على قيد الحياة وانتشار لاحقة ستكون دون المستوى الأمثل. عندما المستعمرات إعادة الطلاء، 1: 4-1: 6 وانقسام حفاظ على كثافة مستعمرة المثلى. إزالة بلطف المستعمرات وسائل الاعلام من لوحة وإضافة إلى آبار جديدة،-Matrigel المغلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الجزء الأول من الأنف، ودعا دهليز الأنف، هي منطقة محاطة غضروف 29. تحتاج الفرشاة لتسير بسلاسة الماضي هذا المجال من الأنف، وراء صمام الأنف (الباطنة الفوهة، أو "الثقب الأسود" رأيت في الجزء الخلفي من n هل)، ويتم الحصول على عينة من المحارة أدنى (الشكل 1). المحارات الأنفية هي هياكل عظمية التي تزيد من مساحة سطح الأنف 29، مما يجعلها موقعا مثاليا لأخذ العينات. واصطف المنطقة أيضا الأنسجة المخاطية أوعية دموية، و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخلايا الظهارية الأنفية (NECS) هي منصة الوصول إليها لدراسة أمراض الشعب الهوائية، واللجنة الوطنية للانتخابات، iPSCs توفر وسيلة مثيرة لاستكشاف تطور المرض والعلاج والعلاج 1،31،32. يمكن الحصول عليها NECS دون إجراءات ضارة المجهدة أو يحتمل أن تكون 6،23. في تجربتنا، وعينة من الغشاء المخاطي للأنف كما هو موضح في هذا البروتوكول على ما يبدو أقل إرهاقا وينظر أفضل من جمع الدم للأطفال. لذلك، قد يكون هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص في السكان مرضى الأطفال وذات الصلة لدراسة أمراض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أنوه المحفزة مرفق الخلايا الجذعية والتصوير الأساسية متحد البؤر في مستشفى سينسيناتي للأطفال. وأيد هذا العمل من قبل R21AI119236 (HJ)، R21AI101375 (HJ)، المعاهد الوطنية للصحة / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ)، U19 AI070412 (HJ) و2U19AI70235 (GKKH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل مخروطيفيشر Scientific14-959-49Dبروتوكول الخطوة 1.1.
بروتوكول BEGMLonzaCC-3170الخطوة 1.1.
بنسلفانيا / البكتيريا / مبيداتلتقنيات الحياة15240-062بروتوكول الخطوة 1.1.
Penn / StrepLife Technologies15140-122بروتوكول الخطوة 4.أ.
فرشاة علم الخلايا السيتوسوفتيةفيشر Scientific22-263-357بروتوكول الخطوة 1.2.
تريبان الأزرقفيشر ScientificMT-25-900-CIبروتوكول الخطوة 2.1.
مقياس الدمفيشر Scientific02-671-54بروتوكول الخطوة 2.1.
بروتوكول PBSFisher ScientificBP2438-4الخطوة 2.2.
مقاطع قمع علم الخلايافيشر العلمي10-357بروتوكول الخطوة 2.2.
قمع السيتوبينفيشر العلمي23-640-320بروتوكول الخطوة 2.2.
Cytospin 4بروتوكول A78300003 العلمي فيشرالخطوة 2.2.
شريحة فارغةفيشر ScientificS95933بروتوكول الخطوة 2.2.
مجموعة بقع هيما 3فيشر Scientific22-122-911بروتوكول الخطوة 2.2.
الكولاجين الجلدي البقري ، النوع 1الحياةA1064401بروتوكول الخطوة 3.2.
قارورة T25فيشر Scientific08-772-45بروتوكول الخطوة 3.3.
التربسينلونزاCC-5012الخطوة 5.2.
حل تحييد التربسينبروتوكول LonzaCC-5002الخطوة 5.2.
مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، معقم بالحرارة عند 65 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقةSigma-AldrichF2442الخطوة 5.5.
ثنائي ميثيل سلفوكسيد Hybri-Max & trade ؛ ، مصفى معقم ، كاشف حيوي ، مناسب للورم الهجين ، & ge ؛ 99.7٪Sigma-AldrichD2650الخطوة 5.5.
polycistonic lentivirus * على سبيل المثال < / em> MilliporeSCR511بروتوكول الخطوة 6.4.  ؛
يتم سرد مصدر تجاري لإعادة برمجة المتجه. نحن نستخدم بشكل روتيني البلازميد 4 في 1 الذي أبلغ عنه Voelkel et al (PMID: 20385817) لتوليد فيروس العدسات العصبي VSV-G-pseudotyped polycistronic في المنزل. يمكن الحصول على هذا البلازميد عن طريق الاتصال ب  
بوليبرينسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-134220بروتوكول الخطوة 6.4.
CF1 MEFsالمشع GlobalStem GSC-6301Gالخطوة 6.4.
وسائط hESCانظر الوصفة المضمنة فيبروتوكول الخطوة 6.11.
SB4315426.11 لبروتوكول Stemgent04-0010
PD03259016.11 لبروتوكول Stemgent04-0006
Thiazovivin Stemgent04-0017البروتوكول الخطوة 6.11.
6.13المؤهلة من hESC MatrigelBD Biosciences354277
لوحة كورنينج ، 6 آبارفيشر ساينتفيك08-772-1Bبروتوكول الخطوة 6.13.
mTeSR1StemCell5850الخطوة 6.13.
قارورة فلتر 250 مل يمكن التخلص منها (0.22 وميكرو ؛ م)فيشرSCGP-U02-RE 
تباعدStemCell7923الخطوة 7.3.
DMEM / F12Life Technologies11320-033بروتوكول الخطوة 7.3.
رافع الخلايافيشر Scientific08-100-240بروتوكول الخطوة 7.4.
hESC Media **خطوة البروتوكول 6.11.
ثم تعقيمها بالترشيح. يمكن الاحتفاظ بالوسائط عند 4 درجات ؛ ج لمدة تصل إلى أسبوعين. عند تسخين وسائل الإعلام ، لا تترك عند 37 درجة ؛ C أطول من 15 دقيقة
DMEM-F12 50/50 وسائل الإعلامInvitrogen  11330-032نهائي
KO بدائل المصل (KO-SR)Invitrogen10828-0280.2
200 mM L-glutamineInvitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-mercaptoethanolInvitrogen21985-0230.1 mM
100x الأحماض الأمينية غير الأساسيةInvitrogen11140-0501x
2 & micro; جم / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (b-FGF)Invitrogen13256-0294 نانوغرام / مل
الشكل الفطريات تقنيات بروتوكول بروتوكول بروتوكول بروتوكول الخطوة . الخطوة .الخطوة .بروتوكول بروتوكول يجب خلط مكونات تركيز

المراجع

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076(2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة الخلايا الأولية الأنف طلائي من الأطفال وإعادة برمجة وإلى خلية جذعية مستحثة وافرة القدرة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.