مقالة منهجية

مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

DOI:

10.3791/53818

⸱

مارس 28, 2016

 ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم تقديم إجراء لتنشيط بروتين عصبي بشكل انتقائي بنبضة قصيرة من الضوء عن طريق ترميز حمض أميني غير طبيعي تفاعلي ضوئي وراثيا في بروتين عصبي مستهدف يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية في الثقافة أو في الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحفيز الضوئي هو طريقة غير جراحية للتحكم في الأحداث البيولوجية بدقة مكانية وزمانية ممتازة. هناك طرق جديدة مطلوبة لتنظيم البروتينات الداخلية المعبر عنها في بيئتها الأصلية بضوئيا. هنا ، نقدم نهجا للتحكم بصريا في وظيفة البروتين العصبي مباشرة في الخلايا العصبية باستخدام حمض أميني غير طبيعي مشفر وراثيا (Uaa). باستخدام زوج مركب tRNA / aminoacyl-tRNA المتعامد لقمع الكودون الكهرماني ، يتم دمج UAA 4،5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) التفاعلي للضوء على وجه التحديد في مسام البروتين العصبي Kir2.1 ، وهي قناة بوتاسيوم مصححة داخليا. يقوم Cmn الضخم فعليا بحظر مسام القناة ، مما يجعل Kir2.1 غير موصل. تعمل الإضاءة الضوئية على الفور على تحويل Cmn إلى حمض أميني طبيعي أصغر Cys ، مما يؤدي إلى تنشيط وظيفة قناة Kir2.1. نعبر عن قنواتالبوتاسيوم (PIRK)المحفزة للفئران في الخلايا العصبية الأولية للحصين ، ونثبت أن التنشيط الضوئي ل PIRK يوقف إطلاق الخلايا العصبية بسبب تدفق تيار K + عبر قنوات Kir2.1 المنشطة. باستخدام التثقيب الكهربائي للرحم ، نعبر أيضا عن PIRK في القشرة المخية الحديثة للفأر الجنيني في الجسم الحي ، مما يدل على تنشيط الضوء ل PIRK في الخلايا العصبية القشرية الحديثة. لا يفرض التشفير الوراثي UAA أي قيود على نوع البروتين المستهدف أو الموقع الخلوي ، وتتوفر عائلة من Uaas التفاعلية ضوئيا لتعديل بقايا الأحماض الأمينية الطبيعية المختلفة. وبالتالي فإن هذه التقنية لديها القدرة على تطبيقها بشكل عام على العديد من البروتينات العصبية لتحقيق التنظيم البصري للعمليات المختلفة في الأدمغة. يقدم البروتوكول الحالي إجراء يمكن الوصول إليه لدمج UAA المعقد في الخلايا العصبية في المختبر وفي الجسم الحي لتحقيق التحكم الضوئي في نشاط البروتين العصبي على المستوى الجزيئي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقارنة التحفيز الكهربائي التقليدي، ضوئي يقدم أكبر القرار الزماني والمكاني مع الحد الأدنى من التدخل في النظام الفسيولوجي للعينات. منذ المظاهرة استخدام الليزر لتحفيز الخلايا العصبية في عام 1971 1، وقد تم اختراع العديد من الطرق الإبداعية للسيطرة خارجيا نشاط الخلايا العصبية مع الضوء. وقد استخدمت الافراج البصري للمنبهات photocaged فترة طويلة لدراسة الاستجابة الفسيولوجية للشبكة العصبية للجين 2،3،4. هذه التقنية محدودة خصوصية بسبب نشر منبهات قفص. ويتحقق خصوصية الوراثية بالإعراب عن ectopically قنوات أوبسين حساسة للضوء ومضخات 5،6،7، وقد تم تطبيقه بنجاح لتعديل الشبكات العصبية مختارة في الكائنات نموذج متنوعة. ومع ذلك، فإنه سيكون من الصعب تطبيق هذه الطريقة للسيطرة بصريا مختلف البروتينات العصبية الأخرى، منذ تطعيم photoresponsiveness من البروتينات أوبسين للبروتينات أخرى عواد تتطلب الهندسة المكثفة التي قد تغير الخصائص الطبيعية للبروتين قيد الدراسة. الربط كيميائيا ليجند حساس خارجي إلى البروتين وقد أثبتت طريقة أخرى للسيطرة على وظائف بروتينات قناة 8،9،10. وقدم يجند أو سحبها من موقع ملزم من البروتين من خلال الايزوميرة الضوئية شاردة آزوبنزين. الكيمياء الربط يحد من تطبيق أساسا إلى الجانب خارج الخلية من بروتينات الغشاء، باستثناء الجانب داخل الخلايا والبروتينات داخل الخلايا.

Photoresponsive Uaas، بعد أن تدرج في البروتينات، وتوفير استراتيجية عامة لمعالجة البروتينات مع الضوء. في الجهود المبكرة، tRNAs acylated كيميائيا مع وmicroinjected Uaas photocaged إلى البويضات القيطم لدمج Uaas إلى مستقبلات الغشاء والقنوات الأيونية 11، التي تقدمت فهم العلاقات هيكل وظيفتها 12،13،14.ويقتصر هذا النهج حقن مكروي أساسا إلى البويضات كبيرة. التأسيس الجيني للUAA يتجاوز تحديا تقنيا الحمض الريبي النووي النقال أسيلة وحقن مكروي باستخدام زوج الحمض الريبي النووي النقال / مخلقة متعامد، الذي يتضمن UAA عن طريق الترجمة البروتين الذاتية في الخلايا الحية 15،16،17،18. وقد تجلى UAA التأسيس إلى بروتينات الخلايا العصبية في الخلايا العصبية الأولية والخلايا الجذعية العصبية 19،20. وفي الآونة الأخيرة، تم دمج photoresponsive UAA وراثيا في بروتين الخلايا العصبية في أدمغة الثدييات في الجسم الحي لأول مرة 21. هذه التطورات تجعل من الممكن لدراسة البروتينات العصبية مع Uaas في البيئة الخلوية الأصلية الخاصة بهم.

تصحيح باطنه قناة البوتاسيوم Kir2.1 هو المعدل القوي الذي يمر K + التيارات بسهولة أكبر إلى من خارج الخلية، وأنه من الضروري في تنظيم العمليات الفسيولوجية بما في ذلك استثارة الخلايا، لهجة الأوعية الدموية ومعدل ضربات القلب، وإعادةتدفق الملح نال والأنسولين إطلاق سراح 22. overexpression من Kir2.1 hyperpolarizes إمكانات غشاء الخلايا العصبية المستهدفة، والتي تصبح أقل منفعل 23،24. للسيطرة على بصريا Kir2.1 في الخلايا موطنه الأصلي، كانغ وآخرون. أدرجت وراثيا، صور تستجيب أوا إلى Kir2.1 أعرب في خلايا الثدييات، الخلايا العصبية وأدمغة فئران جنينية 21. وكان نبضة قصيرة من ضوء قادرة على تحويل أوا إلى الأحماض الأمينية الطبيعية السيستئين، وبالتالي تفعيل الهدف البروتين Kir2.1. عندما أعرب عن هذا الصورة محرض تصحيح باطنه البوتاسيوم (PIRK) بروتين قناة في الفئران الخلايا العصبية الأولية الحصين، قمعت إطلاق الخلايا العصبية في استجابة لتفعيل الضوء. وبالإضافة إلى ذلك، أعرب عن قناة PIRK في القشرة المخية الحديثة الماوس الجنينية، وتم قياس PIRK الحالية تفعيلها للضوء في الخلايا العصبية القشرية. التنفيذ الناجح للتكنولوجيا UAA في الجسم الحي في أدمغة الثدييات يفتح الباب للسيطرة على بصريا بروتينات الخلايا العصبيةفي بيئتهم المحلية، الأمر الذي سيمكن تشريح البصرية من العمليات والآليات العصبية على المستوى الجزيئي.

في هذا البروتوكول وصفنا إجراءات التأسيس الجيني للUaas في الخلايا العصبية الأولية في الثقافة وفي مخ الفأر الجنينية في الجسم الحي. وتستخدم photoresponsive UAA CMN وKir2.1 لتوضيح هذه العملية. طرق لتقييم نجاح التأسيس UAA والسيطرة البصرية من نشاط البروتين الخلايا العصبية يتم توفيرها. هذا البروتوكول يوفر دليلا واضحا على ترميز وراثيا Uaas في الخلايا العصبية وفي الجسم الحي، وتنظيم بصريا وظيفة بروتين الخلايا العصبية عن طريق UAA photoresponsive. ونحن نتوقع هذا البروتوكول لتسهيل اعتماد تكنولوجيا في الجسم الحي أوا لعلم الأعصاب وعلم البصريات الوراثي الدراسات البيولوجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات في الدراسة الحالية باستخدام المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) وافق بروتوكولات التعامل مع الحيوانات في معهد سالك للدراسات البيولوجية، لا جولا، كاليفورنيا.

1. UAA التأسيس في Kir2.1 والتعبير عن الناتجة PIRK في الخلايا العصبية الثقافة الابتدائية

  1. البناء الحمض النووي
    1. تحديد موقع الهدف من Kir2.1 لأوا التأسيس. استغلال المعرفة السابقة والمعلومات حول بنية ووظيفة Kir2.1، حتى أن الموقع المختار مع photoresponsive UAA إنكوربوريتد يمكن تعديل البصرية وظيفة Kir2.1 21.
    2. بناء المؤتلف ترميز الحمض النووي Kir2.1 الجينات مع الموقع المختار تحور إلى TAG العنبر وقف كودون. استخدام تقنيات الاستنساخ القياسية 25 إلى استنساخ الحمض النووي Kir2.1-TAG إلى التعبير البلازميد الثدييات.
    3. الجينات / مخلقة استنساخ الحمض الريبي النووي النقال التي هي محددة لUAA ودمج UAA ردا علىكودون وقف TAG إلى التعبير الثدييات آخر البلازميد 21.
      ملاحظة: للحصول على أفضل التأسيس UAA والمروجين ومجموعات من أشرطة الجينات مختلف (على الحمض الريبي النووي النقال، مخلقة، وKir2.1) يمكن اختبارها في البلازميدات مختلفة.
    4. الحصول السلطات الوطنية المعينة بلازميد عالية الجودة باستخدام miniprep أو maxiprep مجموعات تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. حوالي 1.9 نسبة 260/280 هو الأمثل لالحمض النووي المنقى. عند الضرورة، إجراء الكهربائي للهلام الاغاروز للتحقق نقاء هيأهم DNA 25. Supercoiled السلطات الوطنية المعينة بلازميد مع نقاء عالية هي أفضل لترنسفكأيشن الخلايا العصبية.
  2. ثقافة الجرذ الحصين الابتدائية الخلايا العصبية
    1. coverslips مكان الزجاج (الدوائر، و 12 ملم في القطر) في 24 لوحات جيدة، ساترة واحدة على كل جانب، ومعطف كل بئر مع 250 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل بولي-D-ليسين (في 100 ملي العازلة بورات: 1.24 ز البوريك حامض و1.90 ز بورات ثنائي الصوديوم في 400 مل من منزوع الأيونات المقطر H 2 O أو [ده 2 O في درجة الحموضة 8.5) لأكثر من 10 ساعة في درجة حرارة الغرفة، مختومة. إعداد حوالي 10-12 coverslips المغلفة في الجرو.
    2. في يوم من تشريح، وجمع أدمغة الأطفال حديثي الولادة من الفئران الوليدة بعد الولادة (1-4 يوم ما بعد الولادة) بعد التخدير لهم مع isoflurane، وقطع رأس. تخدير الجراء في غرفة التخدير التي تحتوي على الأيزوفلورين (2-4٪). الانتظار حتى يفقد وعيه وتفشل في الاستجابة للمؤثرات عن طريق اللمس ومعسر من الكفوف.
    3. باستخدام تقنية القياسية 26، تشريح الحصين من المخ في الحارة (~ 37 درجة مئوية) المالحة (10 ملي HEPES و 20 ملي مد الجلوكوز وأضاف في محلول ملحي متوازن هانك)، وجمع الحصين في أنبوب مخروطي مع 4.5 مل المالحة الدافئة .
    4. إضافة 500 ميكرولتر من التربسين 2.5٪ إلى الحصين (0.25٪ تركيز التربسين النهائي)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    5. شطف جيدا الأنسجة بمحلول ملحي (3 × 10 مل)، ويسحن.
    6. استعادة الخلايا العصبية فصلها في 1 مل ثوسائط النمو الذراع التي تحتوي على الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 21.2 ملم مد الجلوكوز، 2 مم L-الجلوتامين، 2٪ B-27، و 0.1٪ الموسع المصل.
      ملاحظة: إضافة L-الجلوتامين وB-27 في يوم تشريح لإعداد وسائط النمو الطازجة.
    7. عدد الخلايا العصبية مع عدادة الكريات، ولوحة منها على coverslips في 24 لوحات جيدا في 1،0-1،5 × 10 5 خلية / جيد كثافة مع وسائل الإعلام نمو 500 ميكرولتر بعد تصفيتها من خلال شبكة من النايلون 40 ميكرون.
    8. احتضان ثقافة العصبية في 35 درجة مئوية في 5٪ CO 2: 95٪ الجوية حاضنة مرطب لمدة 2-3 أسابيع. للحصول على أفضل نتيجة، وتجنب إزعاج ثقافة قدر الإمكان أثناء الحضانة.
  3. فوسفات الكالسيوم (كا-P) ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الثقافة الابتدائية
    1. جعل الحلول الأسهم وتخزينها في 4 درجة مئوية: 0.5 M BES (N، N -bis [2-هيدروكسي إيثيل] -2-aminoethanesulfonic حامض) عازلة (10X)؛ 150 ملي نا 2 هبو 4 (100X)؛ 2.8 M كلوريد الصوديوم (10X)؛ ده العقيمة 2 O؛ معقم 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
    2. يوم ترنسفكأيشن، وجعل الطازجة 2.5 M CaCl 2 الحل في ده 2 O وتصفية العقيمة مع 0.22 ميكرون فلتر. جعل عازلة مخزنة BES-2X جديدة المالحة (BBS) يحتوي على 50 BES ملم، 1.5 ملم نا 2 هبو 4، و 280 ملي مول كلوريد الصوديوم في درجة الحموضة 7.00 (ضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم) وتصفية العقيمة مع 0.22 ميكرون فلتر.
      ملاحظة: حساب كمية CaCl 2 حل وعازلة BBS اعتمادا على عدد من coverslips أن transfected. ننظر أيضا في 1.3.4.
    3. استبدال وسائط النمو الثقافة مع 500 سائط النمو ترنسفكأيشن جديدة ميكرولتر قبل تحسنت. (وسائل الإعلام ترنسفكأيشن يمكن إجراء مع MEM بالإضافة إلى 21.2 ملي مد الجلوكوز).
      ملاحظة: لا تجاهل وسائل الإعلام القديمة.
    4. حساب كمية ده 2 O والاستعداد لإضافة لجعل الحل ترنسفكأيشن (33 ميكرولتر لكل ساترة) التي تحتوي على 1.65 ميكرولتر CaCl 2 و 0.7 ميكروغرام الحمض النووي، و 16.5 &# 181؛ ل 2X BBS.
    5. إعداد الحل ترنسفكأيشن فورا قبل إضافتها إلى الثقافة. لإعداد، والجمع بين أول CaCl 2 و ده 2 O بينما تهييج ببطء الأنبوب. تواصل التحريض وببطء إضافة الحمض النووي في حل. وأخيرا، إضافة العازلة 2X BBS قطرة من الحكمة في حين التحريض.
    6. على الفور إضافة 30 ميكرولتر من محلول ترنسفكأيشن إلى كل ساترة للثقافة العصبية.
    7. صخرة الطبق الثقافة عدة مرات لخلط الحل واحتضان عند 35 درجة مئوية في 5٪ CO 2: 95٪ الجوية ترطيب الحاضنة لمدة 45 دقيقة، 1 ساعة. بعد يتم تحضين الخلايا العصبية مع الحل ترنسفكأيشن، فإن الجميلة جدا رواسب الكالسيوم ف تشكل طبقة تغطي الخلايا العصبية.
    8. استبدال وسائل الاعلام ترنسفكأيشن مع 500 ميكرولتر قبل تحسنت غسل العازلة (135 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي HEPES، 4 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم نا 2 هبو 4، 10 ملي الجلوكوز في الرقم الهيدروجيني 7.3، عقيم تصفيتها مع 0.22 ميكرون فلتر) واحتضان عند 356؛ مئوية في 5٪ CO 2: 95٪ الجوية ترطيب الحاضنة لمدة 15-20 دقيقة. أن رواسب الكالسيوم ف تختفي بعد الخطوة غسل.
    9. استبدال غسل العازلة مع 500 ميكرولتر وسائط النمو الطازجة. مرة أخرى، استبدال وسائط النمو مع وسائل الإعلام الأصلي المحفوظة.
    10. إضافة UAA CMN (قبل مختلطة في 50 ميكرولتر وسائط النمو الحار) للثقافة ليصل إلى 1 ملي تركيز النهائي.
    11. احتضان الثقافة transfected عند 35 درجة مئوية في 5٪ CO 2: 95٪ الجوية حاضنة مرطب ل12-48 ساعة قبل المقايسات.
  4. تسجيل خلية كاملة مع تنشيط ضوء
    1. إعداد حلول إضافية / داخل الخلايا. يحتوي الحل داخل الخلايا 135 ملي غلوكونات البوتاسيوم، 10 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم MgCl 2 و 10 ملي HEPES، 1 ملي EGTA، 2.56 ملي K 2 ATP، و 0.3 ملي لي 2 GTP في درجة الحموضة 7.4. يحتوي الحل تسجيل خارج الخلية 150 مم كلوريد الصوديوم، 3 ملي بوكل، 5 ملي MgCl 2، 0.5 ملي CaCl 2 و 5 ملي الجلوكوز، و 10 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4.
    2. إعداد تلاعب الكهربية للخلية كاملة التصحيح لقط: المجهر مزودة 4X و20X الأهداف، تدخل الفرق المقابل (DIC)، وmCitrine فلتر (الإثارة: 495/10 نانومتر، والانبعاثات: 525/25 نانومتر)؛ مناور؛ مكبر للصوت التصحيح، المشبك. التحويل الرقمي. الحصول على البيانات وبرامج التحليل.
      1. تثبيت الصمام الثنائي الباعثة للضوء (LED) مع انبعاث 385 نانومتر بواسطة المجهر في تلاعب لتحقيق الضوء على نقطة محورية من 1 سم بعيدا في زاوية 45 درجة. تحقق قوة LED مع السلطة متر ضوء.
    3. سحب ماصات التصحيح من أقطاب الزجاج باستخدام مجتذب micropipette التجاري لديها 3-6 MΩ المقاومة ماصة. اتبع تعليمات الشركة الصانعة لإعداد مجتذب micropipette.
      1. لاختبار مقاومة ماصة، أولا ملء ماصة مع الحل داخل الخلايا وضعه على حامل الكهربائي. تراجع ماصة في صحن الثقافة 35 ملم مليئة حل خارج الخلية، وضعت على المجهر صlatform. تزج القطب الأرض في طبق لإكمال الدائرة.
      2. تشغيل مكبر للصوت / التحويل الرقمي وبدء برنامج الحصول على البيانات. مراقبة مقاومة ماصة مع اختبار البروتوكول الغشاء.
    4. إخراج ساترة للثقافة العصبية من الحاضنة وشطف مرة واحدة في حل خارج الخلية. استخدام الشحوم فراغ، اضغط باستمرار على ساترة في منتصف صحن الثقافة 35 ملم مليئة حل خارج الخلية الطازجة.
    5. ضع ساترة / طبق على منصة الكهربية المجهر.
    6. باستخدام تقنيات التصحيح لقط القياسية، والتصحيح الخلايا العصبية مع mCitrine مضان 27. نشاط الخلايا العصبية قياسي باستخدام المشبك الحالي (I-الشبك) الأسلوب. أولا، ضبط إمكانات يستريح إلى حوالي -72 بالسيارات عن طريق حقن تيار صغير. ثم، وضخ خطوة الحالية (10-200 باسكال) للحث على اطلاق النار المستمر (5-15 هرتز) من إمكانات العمل.
    7. يدويا أو باستخدام برنامج الحصول على البيانات، وميض نبض (خطيئةغلي نبض 100 ميللي ثانية -1 مدة ثانية) للضوء LED لالخلايا العصبية أثناء التسجيل، ومعرفة ما إذا كان تتأثر إمكانات العمل.
    8. إضافة 0.5 ملي بووتون 2 إلى الحمام، وتحقق ما إذا كان يتم استرداد إمكانات العمل.

2. UAA التأسيس في Kir2.1 والتعبير عن PIRK الناتجة في مخ الفأر الجنينية في فيفو

  1. البناء الحمض النووي
    1. تصميم DNA البلازميد بالمثل كما في الخطوة 1.1. في الجسم الحي التعبير، استخدم أحد المروجين قوي مثل المساعدة النقدية (الدجاج بيتا أكتين المروج مع CMV محسن).
    2. تنقية الحمض النووي مع maxiprep عدة التجارية خالية من الذيفان الداخلي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أداء استخراج الفينول كلوروفورم تليها الإيثانول هطول الأمطار 25 للحصول على الحمض النووي ذات جودة عالية للغاية (مختصرة إلى 2-5 ميكروغرام / ميكرولتر).
  2. في الرحم Electroporation لللالجنينية الماوس القشرة المخية الحديثة
    ملاحظة: TECHNI الأساسيوقد وصفت كيو لفي الرحم Electroporation للسابقا 28.
    1. تخدير ماوس الحوامل توقيت في اليوم الجنينية 14.5 (E14.5) مع بنتوباربيتال الصوديوم (الحقن داخل الصفاق، 50 ميكروغرام لكل غرام من وزن الجسم) أو الأيزوفلورين (استنشاق، 2-4٪). رصد عمق التخدير عن طريق فحص فقدان الوعي وعدم الاستجابة للمؤثرات عن طريق اللمس ومعسر من الكفوف.
    2. إجراء شق صغير في خط الوسط في البطن. فضح بلطف قرون الرحم مع ملقط وأطراف الأصابع.
    3. ضخ نحو 1 حل ميكرولتر الحمض النووي (2-5 ميكروغرام / ميكرولتر من كل البلازميد، اعتمادا على بناء) إلى البطين الجانبي من كل littermate مع ماصة الزجاج عبارة عن طريق جدار الرحم. في معظم الحالات، يتم حقن حوالي 60-80٪ من إجمالي الأجنة.
    4. Electroporate الأجنة مع electroporator (33-35 V، 50 ميللي ثانية مدتها، 950 مللي ثانية الفاصلة، 4-8 البقول).
    5. العودة قرون الرحم الى تجويف البطن برفق مع لالفطر الابيض وأطراف الأصابع. خياطة جدار العضلات ومن ثم الجلد مع خياطة الجراحية للسماح للأجنة لمواصلة التنمية.
  3. أوا حقن مكروي
    1. إجراء شق صغير في البطن خط الوسط مرة أخرى في E16.5، وفضح بلطف قرون الرحم مع ملقط وأطراف الأصابع.
    2. حقن حوالي 2-5 ميكرولتر CMN العلاء (500 ملم) على الجانب electroporated أو كلا الجانبين من البطين الجانبي مع ماصة الزجاج عبارة عن طريق جدار الرحم. لزيادة التوافر البيولوجي CMN، استخدم ثنائي الببتيد CMN علاء (CMN ألانين) لتسليم CMN في الجسم الحي 21.
    3. مرة أخرى، والعودة قرون الرحم الى تجويف البطن برفق مع ملقط وأطراف الأصابع. خياطة جدار العضلات ومن ثم الجلد مع خياطة الجراحية للسماح للأجنة لمواصلة التنمية.
  4. الحصول الحاد الدماغ شرائح
    1. جعل 1 لتر السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) التي تحتوي على 119 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 1.3 ملي MgCl 2، 2.5 ملي CaCl 2، 1 ملم ناه 2 ص 4، 26.2 ملم NaHCO 3، و 11 ملي الجلوكوز في درجة الحموضة 7.3.
    2. خذ 200 ACSF مل وسريع للتجمد عند -80 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. فقاعة بقية ACSF مع 5٪ CO 2: 95٪ O 2 الغاز في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعداد وتعقيم أدوات الجراحة لحصاد العقول من الأجنة. أيضا بإعداد دلو من الجليد.
    4. جعل ~ 100 مل 4٪ انخفاض درجة انصهار الحل الاغاروز في قارورة عن طريق تسخين في الميكروويف. تهدئة حل لنحو 5 دقائق قبل أن تبدأ لترسيخ.
    5. الموت ببطء ساعة الماوس 12-24 بعد الحقن CMN علاء بواسطة CO 2 جرعة زائدة. جعل شقوق كبيرة في منطقة البطن، وتشريح خارج الأجنة electroporated / microinjected من الرحم مع مقص الجميلة وملقط.
    6. أدمغة الحصاد من الأجنة مع مقص الجميلة وملقط.
    7. وضع كل الدماغ على طبق ثقافة 10 سم وضعت على دلو الجليد. تقسيم نصفين باستخدام شفرة حادة، ووضع كلنصف الكرة على طبق مع المستوى السهمي النصفي لمس قاع الطبق. صب بسرعة على حل الاغاروز على العقل (حوالي 500 ميكرولتر في نصف الكرة الأرضية).
    8. باستخدام شفرة حادة، وقطع ساحة الاغاروز حول الدماغ لجعل كتلة الاغاروز جزءا لا يتجزأ من الدماغ.
    9. باستخدام لاصق الأنسجة، والغراء أسفل سطح الطائرة السهمي النصفي من كتلة agarose على جبل لvibratome. ملء غرفة vibratome مع ACSF قبل المبردة وقطع 200 ميكرون شرائح الدماغ السهمي.
    10. احتضان شرائح الحادة في ACSF تستكمل مع 3 مم -inositol ميو، 0.4 ملي حمض الأسكوربيك، و2 مم البيروفات الصوديوم عند 33 درجة مئوية لمدة 42 دقيقة في حين ظهرت على السطح مع 5٪ CO 2: 95٪ O 2 الغاز.
    11. بعد 42 دقيقة، وإيقاف سخان والاستمرار في احتضان شرائح في درجة حرارة الغرفة مع السطح. بدء خلية كاملة التصحيح تسجيل 15 دقيقة على الأقل بعد إيقاف تشغيل جهاز التدفئة.
  5. تسجيل خلية كاملة مع تنشيط ضوء
    1. إعداد إنتراكحل ellular تحتوي على 130 ملي غلوكونات البوتاسيوم، 4 مم MgCl 2 و 5 ملي HEPES، 1.1 ملي EGTA، 3.4 ملي نا 2 ATP، 10 ملي الكرياتين فوسفات الصوديوم، و 0.1 ملي نا 3 GTP في درجة الحموضة 7.3 تعديلها مع KOH.
    2. سحب ماصات التصحيح من أقطاب الزجاج باستخدام مجتذب micropipette التجاري لديها 3-6 MΩ المقاومة ماصة.
    3. إعداد الكهربية تلاعب شريحة لكامل الخلية التصحيح لقط وsuperfuse غرفة تسجيل مع ACSF في 2 مل / دقيقة معدل مع مضخة نضح. ضبط درجة حرارة الغرفة إلى حوالي 33 درجة مئوية.
      ملاحظة: تم تجهيز تلاعب شريحة الكهربية مع غرفة التروية، وهو الهدف الغمر بالماء وتحكم في درجة الحرارة. أيضا، مرشح GFP مطلوبة (675/130 نانومتر الإثارة: 580/20 نانومتر الانبعاثات) (الإثارة: 480/30 نانومتر، وانبعاث 535/40 نانومتر) وmCherry التصفية.
      1. تثبيت الصمام مع انبعاث 385 نانومتر بواسطة المجهر في تلاعب لتحقيق الضوء على نقطة محورية من 1 سم بعيدا في 45 °زاوية. تحقق قوة LED مع السلطة متر ضوء.
    4. اختيار بعناية شريحة الدماغ مع ماصة الزجاج ووضعه في غرفة نضح. اضغط باستمرار على شريحة مع القيثارة.
    5. التصحيح الخلايا العصبية مع مضان mCherry / GFP من منطقة القشرة المخية الحديثة 27. النشاط PIRK سجل باستخدام المشبك الجهد (V-الشبك) الأسلوب. أولا، مع الاستمرار على غشاء المحتملة في -60 بالسيارات. ثم، والتيارات سجل في إمكانات الثابتة السلبية غشاء (-100 بالسيارات) أو سلالم الجهد (-100 بالسيارات إلى +40 بالسيارات). على وجه التحديد، ومراقبة Kir2.1 التيارات الداخل محددة في -100 بالسيارات.
    6. يدويا أو باستخدام برنامج الحصول على البيانات، وميض النبض (نبضة واحدة من 100 ميللي ثانية -1 مدة ثانية) للضوء LED لالخلايا العصبية أثناء التسجيل، ومعرفة ما إذا كان يتم تنشيط بروتينات PIRK. مرة واحدة يتم تنشيط PIRK، فإن التيارات الداخل في -100 بالسيارات زيادة كبيرة.
    7. إضافة 0.5 ملي بووتون 2 إلى الحمام، وتحقق ما إذا كان هو المعطل PIRK مرة أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدمج وراثيا أوا إلى البروتين في الخلايا العصبية، فإن الخطوة الهامة الأولى هي لتصميم الجينات المناسبة يبني لتقديم والتعبير عن الجينات بكفاءة في الخلايا العصبية. هناك ثلاثة مكونات وراثية لأوا التأسيس: (1) هذا الجين الهدف مع TAG العنبر وقف كودون قدم في الموقع الذي تم اختياره لأوا التأسيس (2) والحمض الريبي النووي النقال متعامد على التعرف على تحور توقف TAG كودون، و (3) وأمينوأسيل متعامد -tRNA مخلقة لتوجيه الاتهام الى UAA على الحمض الريبي النووي النقال م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحقيق فعال الصورة التشكيل، فإن الخطوة الأولى المهمة هي أن تقرر أين دمج UAA photoresponsive في البروتين المستهدف. المعلومات الهيكلية والوظيفية للبروتين المستهدفة هي مفيدة جدا لتوجيه اختيار المواقع المرشحة. وفي الوقت نفسه، فإن الغرض من التنظيم ضوء تحديد الموقع الذي هو الأكثر ملاءمة. بعد اختيار المواقع المرشحة، ونحن نوصي لاختبار المواقع في خطوط خلايا الثدييات مثل الكلى الجنينية البشرية (كلوة) خلايا لتسهيل الثقافة والتلاعب، وذلك قبل الشروع في الخلايا العصبية الأولية وفي الجسم الح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور S. Szobota على المناقشة المفيدة حول ثقافة الخلايا العصبية وتعداء Ca-P. يقر L.W. بالدعم المقدم من منحة Salk للابتكار ، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (RN1-00577-1) ، والمعاهد الوطنية للصحة (1DP2OD004744).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غطاء نظارات ، دوائر ، 12 مم ، سمك 0.13-0.17 ممكارولينا بيولوجيز633029
Corning BioCoat Poly-D-LysineCorning Discovery Labware354210
D- (+) - محلول الجلوكوزSigma-AldrichG8769
أداة العلوم الدقيقة المنحنية10092-12
سكين تشريح - طرفبزاوية دقيقةأداة العلومالدقيقة 10056-12
GlutaMAX-I SupplementLife Technologies35050-061
MITO + Serum ExtenderBD Biosciences355006
Falcon 40 & micro ؛ م مصفاة الخليةCorning Life Sciences352340
BES (N< / em>-Bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N< / em>-Bis (2-hydroxyethyl)taurine)Sigma-AldrichB6420
LED LIGHT SOURCE – أسود LED 385Prizmatix المحدودة
Agarose ، نقطة انصهار منخفضة ، درجة تحليليةPromegaV2111

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Kir2 1 PIRK

مقالات ذات صلة