تظهر الكريات البيض الرئوية الهامشية خصائص فريدة ووظائف مناعية مميزة مقارنة بمجموعات الكريات البيض الأخرى. نصف هنا الحصاد الانتقائي لهذه المجموعة الفرعية من الكريات البيض الرئوية ، عن طريق التروية القسرية للرئتين في الفئران والفئران. تبدو الكريات البيض الرئوية الهامشية حاسمة في تحديد القابلية للإصابة بالأمراض المنقولة بالدم والأمراض المرتبطة بالرئة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حصاد الانتقائي للMarginating-الرئوية الكريات البيضاء
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الكريات البيض الهامشية الرئوية (MP) هي كريات البيض التي تلتصق بالبطانة الداخلية للشعيرات الدموية الرئوية. تبين أن الكريات البيض MP تظهر تركيبة وخصائص فريدة مقارنة بكريات البيض في الأقسام المناعية الأخرى. تشير الدلائل إلى سمية خلوية أعلى للخلايا القاتلة الطبيعية ، وملف تعريف مميز مؤيد ومضاد للالتهابات لمجموعة الكريات البيض MP مقارنة بالخلايا المناعية المنتشرة أو الطحالية. تتيح الطريقة المعروضة هنا الحصاد الانتقائي للكريات البيض MP عن طريق التروية القسرية للرئتين في الفئران أو الفئران. على عكس الطرق الأخرى المستخدمة لاستخراج الكريات البيض في الرئة ، مثل طحن الأنسجة والتدهور البيولوجي ، فإن هذه الطريقة تنتج حصريا الكريات البيض من الشعيرات الدموية الرئوية ، غير ملوثة بالخلايا المتني والخلالي والخلايا السنخية. بالإضافة إلى ذلك ، تحافظ تقنية التروية بشكل أفضل على سلامة والبيئة الفسيولوجية لكريات البيض MP ، دون إحداث استجابات فسيولوجية بسبب معالجة الأنسجة. تقع مجموعة الكريات البيض MP الفريدة هذه في موقع استراتيجي لتحديد الخلايا المنتشرة غير الطبيعية والتفاعل معها ، حيث يتم احتجاز جميع الخلايا الخبيثة المنتشرة والخلايا المصابة أثناء مرورها عبر الشعيرات الدموية الرئوية ، والتفاعل الجسدي مع الخلايا البطانية والكريات البيض المقيمة. وبالتالي ، فإن الحصاد الانتقائي للكريات البيض MP ودراستها في ظل ظروف مختلفة قد يعزز فهمنا لأهميتها البيولوجية والسريرية ، وتحديدا فيما يتعلق بالتحكم في الخلايا الشاذة المنتشرة والأمراض المرتبطة بالرئة.
المقدمة
الكريات البيض في الانضمام إلى الشعيرات الدموية في الرئتين (أي marginating الرئوي (MP) الكريات البيض) عرضت 1 لعرض تكوين الكريات البيض متميزة وفريدة من نوعها النشاط بالمقارنة مع الكريات البيض من المقصورات المناعية الأخرى (على سبيل المثال، تداول والطحال ونخاع العظام) 2- 4. على سبيل المثال، معرض MP-الكريات البيضاء أعلى القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا السمية الخلوية ضد الخلايا السرطانية المختلفة، بالمقارنة مع تعميم والطحال الخلايا القاتلة الطبيعية، وكذلك مستويات متباينة الرنا المرسال (مرنا)، وزيادة إفراز السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات. ويختلف تكوين خلايا أيضا من الكريات البيض المتداولة كما MP-الكريات البيض لديهم نسبة أعلى من الفطرية مناعة / التكيف مقارنة تعميم الكريات البيض (50٪ مقابل 30٪ على التوالي). الهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تمكين الحصاد الانتقائي للMP-الكريات البيض، من أجل دراسة هذه المقصورة المناعة هامة وفريدة (السكان الخلية)، وelucidate تأثير مختلف التلاعب (على سبيل المثال، تنشيط جهاز المناعة) على هذه الخلايا المحددة.
لفهم أهمية هذه الفئة من السكان فريدة من نوعها، من المهم أن نلاحظ أن نظام المناعة يمكن التحكم تعميم الخلايا السرطانية، micrometastases، والمرض المتبقية من خلال وظائف في الجسم الحي من مناعة خلوية (CMI). هذه القدرة هو واضح على الرغم من فشل سابقة من الجهاز المناعي للسيطرة على الورم الرئيسي، وبدعم من وافرة في دليل المجراة في مرضى السرطان والنماذج الحيوانية 5. الأهم من ذلك، هذه النتائج غالبا ما تكون متناسقة مع في المختبر، وبحكم الدراسات المجراة، التي تفيد أن معظم الخلايا السرطانية ذاتي مقاومة لسمية الخلايا من خلال تعميم الكريات البيض في عينات الدم من البشر والحيوانات (التي تقاس فحوصات السمية الخلوية) 6،7. ويمكن أن يعزى هذا التفاوت إلى وجود في الجسم الحي من السكان الكريات البيض متميزة، مثل السالفةالمذكور السكان الكريات البيض النائب، وعلى وجه التحديد في من السكان من الخلايا القاتلة الطبيعية تنشيط 3. في الواقع، عرضت خلايا الورم مسانج (MADB106)، التي وجدت لتكون مقاومة للتعميم والكريات البيض الطحال، إلى أن هي lysed الخلايا MP-NK 3،8. وبالتالي، يتم التحكم في "المقاومة NK 'يزعم خلايا MADB106 أن metastasize إلى الرئتين من fischer344 (F344) الفئران بخلايا MP-NK، ولكن ليس من خلال تعميم أو الخلايا القاتلة الطبيعية الطحال، والتي عادة دراستها نظرا سهولة وصولها.
النقاء ونشطة MP-الكريات البيض لا يمكن الوصول إليها من خلال أساليب الحصاد القياسية من الكريات البيض من الرئتين، والتي تقوم على طحن أنسجة الرئة أو التدهور البيولوجي 9. نهجنا واثنين من المزايا الرئيسية مقارنة بالنهج معالجة الأنسجة. أولا، النهج نضح يحصد انتقائي MP-الكريات البيض، التي تفصلها عن غيرها من الخلايا التي تنشأ من متني الرئة، بيني، وcompar النزلة السنخtments. ثانيا، تقنية نضح أفضل تحافظ على سلامة وبيئة الفسيولوجية MP-الكريات البيض، على عكس الطحن والمعالجة البيولوجية النهج التي تتلف الخلايا، يغير التشكل، وتحفز إنتاج وإطلاق العوامل المختلفة التي تعدل النشاط المناعي، وعلى وجه التحديد قمع NK السمسة 10.
الرئتين هي جهاز هدفا رئيسيا لورم خبيث من السرطان والأمراض المعدية المختلفة. كل الخلايا الخبيثة المنتشرة والخلايا المصابة تمر من خلال الشعيرات الدموية في الرئة، حيث أنها تحتاج إلى تشوه والتفاعل مع الخلايا البطانية الشعرية والكريات البيض المقيم. في ظل هذه الظروف، والخلايا المنتشرة يمكن أن تستهدف بسهولة عن طريق MP-الكريات البيض المقيم. وهكذا يبدو من المفيد من الناحية البيولوجية أن يكون الكريات البيض تفعيلها في هذا الحيز المناعة، وأنه من المهم دراسة هذه فريدة من نوعها MP-السكان في إعدادات البيولوجية، التجريبية، وسريرية مختلفة. ومن الجدير بالذكر أن سيتفعيل stemic المناعي عن طريق مختلف، استجابة معدلات البيولوجية (على سبيل المثال، حمض polyinosinic-polycytidylic (بولي الأول: C) أو oligodeoxynucleotides نوع C الدليل السياسي الشامل (الدليل السياسي الشامل-C ODN)) وقد ثبت أن تفعيل MP-الكريات البيض أكثر من تعميم الكريات البيضاء 3، 8،11.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) في جامعة تل أبيب.
1. بروتوكول الجرذ
- الاستعدادات
- ترتيب 2 فراشة 21 الإبر G. اختياريا، وإعداد 2 فراشة 21 G الإبر ذو حدين صريحا عن طريق تقديم حافة حادة من الإبرة.
- تعقيم الأدوات الجراحية: 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، مرقئ، ملقط الأسنان الأنسجة تعقيم بواسطة الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على وضع (الجاف) الجاذبية.
- إعداد heparinized برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين لكل مل من الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني 1X) حل. استخدام في RT. 35 مل هو حجم الحد الأدنى اللازم للحيوان.
- تيار heparinized برنامج تلفزيوني في خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة لتجنب فقاعات الهواء.
- نضح من الرئتين وجمع MP-الكريات البيض
- الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. تأكيد القتل الرحيم التي وقف مراقبة التنفس.
- على وقف التنفس، وفتح على الفور تجاويف البريتوني والصدر باستخدام مقص العقيمة وملقط الأسنان الأنسجة. إجراء شق البطن خط الوسط على طول البطن وصولا إلى عملية الخنجري.
- رفع القص باستخدام ملقط، وقطع بحذر القفص الصدري على كلا الجانبين، دون ثقب أي عضو داخلي أو الأوعية الدموية الكبيرة. المشبك مرقئ على القص، وrostrally أضعاف القفص الصدري لفضح مجمع القلب.
- اضافة الى وجود إبرة فراشة في البطين الأيمن من القلب، وخلال حوالي دقيقة وجمع حجم القصوى من الدم إلى حقنة (~ 6 مل من 250 غرام الحيوان).
- المشبك الوريد الأجوف مع مرقئ لتجنب نضح الوراء الكبد (انظر مناقشة).
- عقد إبرة فراشة داخل البطين الأيمن في حين استبدال حقنة تحتوي على الدم مع أنبوب تدفق عمضخة eristaltic.
- اضافة الى وجود إبرة فراشة الثانية متصلة حقنة حصاد 5 مل إلى البطين الأيسر، وتجنب اختراق الحاجز بين البطينين.
- بدوره على مضخة تحوي بسرعة حوالي 5 مل / دقيقة، وجمع بلطف في حقنة وملليلتر الأولى من الإرواء أن تكون ملوثة بالدماء. تستمر حتى يتحول لون سائل الإرواء من الظلام إلى شاحب اللون الأحمر. (تجاهل perfuste الملوثة بالدم).
- دون وقف ضخ تحوي استبدال بسرعة حصاد حقنة 5 مل مع حقنة 20 مل الحصاد وجمع 20 مل من سائل الإرواء الرئة يعمل بسرعة أعلى من نضح (ما يصل إلى 7 مل / دقيقة). تراقب باستمرار تدفق سائل الإرواء في حقنة جمع، مع تجنب تشكيل فراغ.
- وقف تدفق المضخة تحوي.
- الكريات البيض استخراج
- أجهزة الطرد المركزي سائل الإرواء لمدة 10 دقيقة في 400 × ز.
- نضح السوائل.
- إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني أو المتوسطة، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السوائل. كرر هذه الخطوة مرتين. استخدام برنامج تلفزيوني أو المتوسطة يعتمد على يترتب على ذلك من استخدام العينة.
- إضافة 20 مل برنامج تلفزيوني أو المتوسطة، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السوائل.
- إعادة الخلايا إلى التركيز المطلوب، على أساس استخدام عينة (نظام مراقبة الأصول الميدانية، PCR، وما إلى ذلك).
2. بروتوكول ماوس
- الاستعدادات
- ترتيب 2 فراشة 25 الإبر G. اختياريا، وإعداد 2 ذو حدين صريحا فراشة 25 G الإبر عن طريق تقديم حافة حادة من الإبرة.
- تعقيم الأدوات الجراحية: 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، مرقئ، ملقط الأسنان الأنسجة تعقيم بواسطة الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على وضع (الجاف) الجاذبية.
- إعداد heparinized برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين في مل من محلول برنامج تلفزيوني 1X. استخدام في RT. 25 مل هو حجم الحد الأدنى اللازم للحيوان.
- تعزيز بنية الشعأنا heparinized برنامج تلفزيوني في خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة لتجنب فقاعات الهواء.
- نضح من الرئتين وجمع MP-الكريات البيض
- الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. تأكيد القتل الرحيم التي وقف مراقبة التنفس.
- على وقف التنفس، وفتح على الفور تجاويف البريتوني والصدر باستخدام مقص العقيمة وملقط الأسنان الأنسجة. إجراء شق البطن خط الوسط على طول البطن وصولا إلى عملية الخنجري.
- رفع القص باستخدام ملقط، وقطع بحذر القفص الصدري على كلا الجانبين، دون ثقب أي عضو داخلي أو الأوعية الدموية الكبيرة. المشبك مرقئ على القص، وrostrally أضعاف القفص الصدري لفضح مجمع القلب.
- المشبك الوريد الأجوف مع مرقئ لتجنب نضح الوراء الكبد (انظر مناقشة).
- اضافة الى وجود إبرة فراشة متصلا أنابيب تدفق المضخة تحوي في فين الصحيحtricle من القلب، وإبرة فراشة الثانية متصلة حقنة حصاد 2 مل إلى البطين الأيسر من القلب، avoidingpenetration من الحاجز بين البطينين.
- بدوره على مضخة لسرعة حوالي 2 مل / دقيقة وجمع ملليلتر الأولى من الإرواء الملوثة الدم في حقنة الحصاد حتى يتحول سائل الإرواء من الظلام إلى شاحب اللون الأحمر (تجاهل perfuste الملوثة بالدم).
- دون وقف ضخ تحوي استبدال بسرعة حصاد حقنة 2 مل مع حقنة 10 مل الحصاد وجمع 10 مل من سائل الإرواء الرئة يعمل بسرعة أعلى من نضح (تصل إلى 4 مل / دقيقة). تراقب باستمرار تدفق سائل الإرواء في حقنة جمع، مع تجنب تشكيل فراغ.
- وقف تدفق المضخة تحوي.
- الكريات البيض استخراج
- أجهزة الطرد المركزي سائل الإرواء لمدة 10 دقيقة في 400 × ز.
- نضح السوائل.
- إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني أو المتوسطة، الطرد المركزي في 400x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السوائل. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. استخدام برنامج تلفزيوني أو المتوسطة يعتمد على يترتب على ذلك من استخدام العينة.
- إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني أو المتوسطة، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السوائل.
- إعادة الخلايا إلى التركيز المطلوب، على أساس استخدام عينة (نظام مراقبة الأصول الميدانية، PCR، وما إلى ذلك).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
المعرض MP-المقصورة مختلف تكوين الكريات البيض فرعية مقارنة تعميم الكريات البيض. باستخدام تحليل التدفق الخلوي، وقد تم تحديد الفئات السكانية الكريات البيض وكميا لتحديد خصائص تكوين كلا تعميم والكريات البيض النائب. وقد تم تحديد المحببة والخلايا الليمفاوية استنادا إلى الأمام والجانب يفرق. داخل الخلايا الليمفاوية، وقد تم تحديد NKRP-1 خلايا مشرقة كما الخلايا القاتلة الطبيعية، CD3 + شكل خلايا T، RM1 + كما حيدات، وCD4 +<...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة المعروضة هنا تمكن حصاد انتقائي وتدرس من السكان فريدة من MP-الكريات البيض. مقارنة تعميم أو الكريات البيضاء الطحال، ويتميز سكان النائب كتبها متميزه وتكوينها من القطعان الكريات البيض، ومستويات أعلى تفعيل، وإطلاق سراح أعلى من مختلف السيتوكينات، ومستويات مرنا أعلى من المؤيدين والسيتوكينات المضادة للالتهابات 2،3. على وجه التحديد، لقد أظهرنا أن الخلايا MP-NK هي أكثر السامة للخلايا من الخلايا القاتلة الطبيعية في الدورة الدموية ضد مختلف الخلايا المستهدفة 3،4، ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
تم دعم المؤلفين وهذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NCI منحة # R01CA172138 (لSBE).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| معججة أوتوكلد | |||
| إبرة فراشة | OMG | 26G | |
| إبرة فراشة | OMG | 21G * 3/4 " | |
| حقنة | الموافقة المسبقة عن علم | 1 مل | |
| حقنة الموافقة المسبقة عن علم | 2.5 مل | ||
| حقنة الموافقة المسبقة عن علم | 5 مل | ||
| حقنة | محلول الموافقة المسبقة عن علم | 10 مل | |
المراجع
- Kuebler, W. M., Goetz, A. E. The marginated pool. Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).
- Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
- Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
- Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
- Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
- Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
- O'Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
- Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).
- Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
