لائحة ضبط من النسخ الجيني راء الجنينية قرار مصير الخلية. هنا، نحن تصف فحوصات مناعي لونين تستخدم لتحقيق التنظيم جينية من كل من التمايز القلب من الخلايا الجذعية والتنمية القلب من أجنة الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نسخ جين معين هو عملية بيولوجية الرئيسية التي تكمن وراء خلية قرار مصير أثناء التطور الجنيني. وتوسط في عملية بيولوجية من عوامل النسخ التي تربط المناطق التنظيمية الجينومية بما في ذلك القدرة والمروجين من الجينات المكونة القلب. يتم تغليف الحمض النووي حول الهستونات التي تخضع لتعديلات الكيميائية. يؤدي إدخال تعديلات على الهستونات أيضا على المكبوت، المنشط أو متوازنا النسخ الجيني، وبذلك مستوى آخر من تنظيم ضبط من النسخ الجيني. والخلايا الجذعية الجنينية (الخلايا ES) ألخص داخل هيئات مضغي (أي، وحدات الخلية) أو في الثقافة 2D الخطوات الأولى للتنمية في القلب. أنها توفر من حيث المبدأ ما يكفي من المواد لمناعي لونين (رقاقة)، وهي تقنية تستخدم على نطاق واسع لتحديد المناطق التنظيمية الجين. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا ES الإنسان تمثل نموذجا الخلية البشرية من تخلق القلب. في مراحل لاحقة من التطور، والماوس الأنسجة الجنينية تسمح لالتحقيق المناظر الطبيعية جينية معينة مطلوبة لتحديد هوية الخلية. هنا، نحن تصف بروتوكولات رقاقة، رقاقة متتابعة تليها PCR أو رقاقة التسلسل باستخدام خلايا ES والهيئات مضغي والمناطق الجنينية محددة القلب. تسمح هذه البروتوكولات في التحقيق في تنظيم جينية من النسخ الجيني القلب.
المقدمة
والقلب هو الجهاز الأول إلى أن تتشكل وتصبح وظيفية في الجنين. هو مبني على القلب من العديد من الأنساب الخلايا التي تنشأ عن الأولى والثانية الحقول القلب الجنينية 1. من الكيسة بعد الإخصاب المرحلة حتى على شكل قلب، والخلايا الجنينية وبالتالي إلى جعل العديد من القرارات مصير الخلية. وينظم الجينات النسخ بطريقة زمنية والتي تعتمد على الفضاء وهو عملية بيولوجية الرئيسية التي تكمن وراء خلية قرار مصير أثناء التطور الجنيني. وتتوسط هذه العملية من قبل عوامل النسخ المحددة التي تربط المناطق التنظيمية داخل الجينوم بما في ذلك القدرة والمروجين من الجينات المكونة القلب. يتم تغليف الحمض النووي حول الهستونات التي تخضع لتعديلات مثل أستلة،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الحمض النووي والبروتينات عبر ربط
- إصلاح في 15 مل أنابيب تحصد-ES الخلايا (2 × 10 6 خلايا لرقاقة منتظم، 2 × 10 5 خلايا للرقاقة)، والهيئات مضغي (EBS) التي تم إنشاؤها من خلايا ES وأنسجة القلب الجنينية تشريح من أجنة E9.5 الماوس (الأذينية البطينية القناة، تدفق المسالك والبطين) باستخدام 1٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني للخلايا أو في المخزن PB2 permeabilization عن الأنسجة الجنينية. وضع أنابيب على شاكر المداري بسرعة 60 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة بالضبط.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويوضح الشكل 1A أولا إعداد حبات ملزم الحمض النووي ومراقبة الجودة باستخدام الحمض النووي من مختلف الأحجام (1 كيلوبايت سلم). 0ne، وأضيف 2 و 2.5 مجلدات (1-3) من الخرز إلى حجم واحد من عينة لتنقية شظايا الحمض النووي ارتفاع وانخفاض حجم الجزيئي.
الأرقام 1 B، C، D أمثلة نموذجية من المواد الهلامية الحمض النووي من الحمض النووي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أصبح علم التخلق مجال هام للبحث في علم الأحياء التطوري. كيف يتم تنشيط البرنامج الجيني في الخلايا الجنينية للسماح للخلايا لاكتساب هوية محددة ضمن النسب الجنينية ظلت لفترة طويلة على السؤال الرئيسي لعلماء البيولوجيا التطورية.
وقد استخدم على نطاق واسع الشذرة خلال السنوات الماضية، والجمع بين لتسلسل الحمض النووي بعد التحسن في قرار التسلسل. وقد أصبح هذا الأسلوب قوية من أجل التحقيق في الجينوم بطريقة تعتمد اسعة المشهد جينية.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون بوكالات التمويل ، وبرنامج الجماعة الأوروبية IMI StemBANCC ، ومؤسسة leducq (SHAPEHEART) والوكالة الوطنية للأبحاث (Genopath)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الفورمالديهايد | تثبيت الخلايا Sigma | F8775 | |
| جلايسين | سيجما | G8898 | توقف الوصلة |
| المتقاطعة أبروتينين | فلوكا | 10820 | مثبط البروتياز |
| ليوببتين هيميسولفات | سيجما | L2882 | مثبط البروتياز |
| PMSF | Sigma | P7626 | مثبط البروتياز |
| البروتين أ الخرز المغناطيسي | تقنيات الحياة | 10001D | الترسيب |
| المناعي SPRI الخرز المغناطيسي | Thermo Scientific | 15002-01 | تنقية الحمض النووي |
| Proteinase K | Life تقنيات | 25530-015 | هضم البروتين |
| معيار الحمض النووي BR | نطاق معايرة تقنيات الحياة | Q32850 | |
| المجسات الجزيئية | الخضراء Syber | S-11484 | الحمض النووي |
| TE buffer ؛ | Invitrogen | P7589 | تكميم الحمض |
| النووي PBX 1x | تقنيات الحياة | 14190-094 | غسل |
| DNase RNase المياه | الحرة تقنيات الحياة | 10977-035 | التخفيف |
| أنبوب Axygen | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| <قوي > جسم مضاد ؛ < / قوي > | < قوي > شركة < / قوي > | < قوي > مرجع < / قوي > | < قوي > تركيز تشيب < / قوي > |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 & micro ؛ ز ل ESC و EBs ، 1 & micro ؛ ز للأنسجة |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) 3 | & micro; ز ل ESC و EBs ، 1 & micro ؛ ز للأنسجة |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) 3 | & micro ؛ ز ل ESC و EBs ، 1 & micro ؛ ز للأنسجة |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) 3 | & micro ؛ ز ل ESC و EBs ، 1 & micro ؛ ز للأنسجة |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 & micro; ز ل ESC و EBs ، 1 & micro ؛ ز للأنسجة |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) 3 | & micro ؛ ز ل ESC و EBs ، 1 & micro ؛ ز للأنسجة |
المراجع
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
