يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

14.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53877

⸱

مارس 12, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا المفردة من أجنة الزرد ، وإثراء الخلايا ذات الأهمية ، والتقاط خلايا الزرد في أنظمة تعدد الإرسال أحادية الخلية القائمة على الموائع الدقيقة ، وتقييم التعبير الجيني من الخلايا المفردة.

الملخص

الزرد (Danio rerio) هو كائن حي نموذجي قوي لدراسة تطور الفقاريات. على الرغم من وصف العديد من جوانب التطور الجنيني لسمك الزرد على المستوى المورفولوجي ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل عن الأساس الجزيئي للتغيرات الخلوية التي تحدث مع تطور الكائن الحي. مع التطورات الحديثة في الموائع الدقيقة وتقنيات تعدد الإرسال ، أصبح من الممكن الآن توصيف التعبير الجيني في الخلايا المفردة. يسمح ذلك بالتحقيق في عدم التجانس بين الخلايا الفردية لمجموعات خلايا معينة لتحديد وتصنيف الأنواع الفرعية للخلايا ، وتوصيف الحالات الوسيطة التي تحدث أثناء تمايز الخلايا ، واستكشاف الاستجابات الخلوية التفاضلية للمنبهات. تصف هذه الدراسة بروتوكولا لعزل الخلايا المفردة القابلة للحياة من أجنة أسماك الزرد لمقايسات تعدد الإرسال عالية الإنتاجية. يمكن تطبيق هذه الطريقة بسرعة على أي نوع من الخلايا الجنينية لسمك الزرد بعلامات الفلورسنت. يمكن أيضا استخدام امتداد لهذه الطريقة مع تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية لتوصيف نسخ الخلايا المفردة بشكل كامل. كدليل على المبدأ ، تم تقييم الوفرة النسبية لعلامات التمايز القلبي في الخلايا المفردة المعزولة المشتقة من أسلاف القلب الإيجابية nkx2.5. من خلال تقييم التعبير الجيني على مستوى الخلية المفردة وفي نقطة زمنية واحدة ، تدعم البيانات نموذجا يتعايش فيه أسلاف القلب مع ذرية ممايزة. الطريقة وتدفق العمل الموصوف هنا قابل للتطبيق على نطاق واسع على مجتمع أبحاث أسماك الزرد ، ولا يتطلب سوى خط أسماك معدلة وراثيا والوصول إلى تقنيات الموائع الدقيقة.

المقدمة

وتستند معظم الدراسات الحالية من الخلية والبيولوجيا الجزيئية على المعدلات السكانية. ومع ذلك، قد يكون حجب الأحداث البيولوجية الهامة من قبل هذه التحليلات التقليدية القائمة على السكان منذ السكان البسيط يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في العمليات البيولوجية ونتيجة المرض. فهم التعبير الجيني في السكان غير متجانسة على مستوى خلية واحدة يمكن (وديه) يؤدي إلى رؤى البيولوجية والسريرية ذات الصلة 1،2. من تهم دراسات التطور الجنيني، في عدد أكبر من السكان من الخلايا، الخلايا الاولية غالبا ما تكون ممثلة تمثيلا ناقصا، مما يجعلها صعبة للكشف عن التغييرات الطفيفة في التعبير الجيني التي تبدأ في نهاية المطاف القرارات مصير الخلية 3. وبالمثل، قد يكون نوع خلية واحدة ملامح التعبير المختلفة ردا على المكروية 4. على سبيل المثال، الخلايا البطانية المقيمين في نفس الجهاز أو في أجهزة مختلفة (على سبيل المثال، الشريان الأورطي أو الكلى) يحمل تجانس كبير على الرغم من اشتراكهم morp المشتركميزات hological وظيفية 5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الخلايا السرطانية ملء الورم نفسه أيضا متفاوتة التشكيلات الجزيئية أو الطفرات على مستوى خلية واحدة 6.

في النظم نموذج، transcriptomics في الخلايا واحد وقد حددت بنجاح السكان الخلية الجديدة، تتميز الدول الوسيطة التي تحدث أثناء تمايز الخلايا، وكشفت الاستجابات الخلوية التفاضلية للمنبهات 7،8،9. قد تم ملثمين مثل هذه الأفكار في الدراسات السكانية التقليدية. الأجنة الزرد هي مصدر كبير غير المستغلة الجذعية، السلف، والتفريق خلايا لاستكشاف الأسئلة من عدم التجانس وحيد الخلية والتنظيم الجزيئي الهويات الخلوية خلال التنمية. على نمطية للغاية، خارج الحي التنمية وسهولة التلاعب الجيني جعلها نظام نموذجا ممتازا لهذا النهج 10،11. على وجه التحديد، يشكل قيدا رئيسيا على تفسير خلية واحدة جنرالبيانات البريد التعبير هو أن تحديد موثوق للدول خلية متوسطة جديدة خلال التنمية يتطلب توقيت دقيق للغاية لجمع الأنسجة 9. وهذا أمر ضروري لضمان عدم التجانس بين الخلايا والقبض يمثل عدم التجانس داخل الأنسجة عند نقطة زمنية واحدة بدلا من عدم التجانس في التعبير الجيني التي قدمها تعتمد على سن تمايز الخلايا. بالمقارنة مع الفئران، تطور الجنين الزرد قد تكون متزامنة بدقة عبر عدد كبير من الأجنة 12. بالإضافة إلى ذلك، مع أحجام مخلب كبير والأجنة الزرد يمكن استخدامها كمصدر وفرة من الخلايا الجذعية والسلف.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل الخلايا من الأجنة الزرد والتقاط الخلايا واحدة باستخدام الدوائر المتكاملة على microfluidics (IFC) رقاقة وautoprep النظام المتوفرة تجاريا لQRT-PCR تحليل التعبير الجيني. هذا البروتوكول يمكن أن يكون للتحويل السريع إلى أي فحوصات عالية الإنتاجية المتنوعة بما في ذلك كلهالتسلسل Transcriptome على أن يسمح تحليل أكثر شمولا من عدم التجانس الخلوية 13. كما أنها توفر العديد من المزايا لفحوصات الجينات التقليدية. بروتوكول العزلة خلية واحدة تعطي قابلية عالية بعد FACS، مما يقلل من نسبة الخلايا الشبهة التي تم تضمينها في التطبيقات المصب. باستخدام مؤسسة التمويل الدولية، الخلايا والقبض ويمكن ملاحظة مباشرة لتقييم معدلات القبض وتقييم صحة الخلية شكليا. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا البروتوكول هو الواجب التطبيق على نطاق واسع في الأوساط البحثية الزرد، لا تتطلب سوى خط الأسماك المعدلة وراثيا وصفت والحصول على التكنولوجيات القبض على خلية ميكروفلويديك.

وكدليل على المبدأ، تم عزل الخلايا واحد مستمد من الأسلاف القلب واستولت على رقاقة مؤسسة التمويل الدولية، ومن ثم تم قياس الوفرة النسبية للعلامات التمايز في القلب من قبل QRT-PCR. تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية واحد يدل على أن الأسلاف القلب تتعايش مع اح بهمذرية ntiating. البصيرة المكتسبة من التنميط وحيدة الخلية من الأسلاف القلب قد تسلط الضوء على الاختلاف في أنماط التعبير الجيني بين الخلايا الاصلية القلب خلال تطوير الفقاريات، التي ربما تكون قد ملثمين في التحليلات التقليدية القائمة على السكان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتطلب هذا البروتوكول استخدام العيش، الزرد الكبار لإنتاج الأجنة. ويتم حصاد الأجنة لجمع الأنسجة. لا بد من الحصول على موافقة من مجالس المراجعة الأخلاقية المناسبة لإجراء هذه التجربة.

1. الحصول على أجنة نظموا

  1. قبل يوم من التجربة، وإعداد صحي، الزرد الكبار للتربية. وضع رجل واحد وامرأة واحدة على طرفي نقيض من المفرق واضحا في أحواض التفريخ.
  2. كرر 1.1 لأكبر عدد ممكن من الدبابات تربية كما اللازمة لإنتاج الجنين كافيا لتطبيق المصب. الحصول على أجنة من كل نوع الأسماك البرية والأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في نوع من الخلايا في المصالح.
    ملاحظة: عدد الأجنة اللازمة للتطبيقات المصب في خطوات 2-8 يعتمد على الوفرة النسبية للخلايا الفائدة عند نقطة زمنية من الفائدة. على الرغم من أن هذا قد تختلف من نوع من الخلايا، 200 الأجنة تنتج 2،000-5،000 خلايا فرزها عندما جملتعلمي اللغة اإلنكليزية من الفائدة تمثل <1.0٪ من مجموع الخلايا في 24 HPF (ساعة بعد الإخصاب).
  3. في صباح اليوم التالي، وتغيير المياه في الخزان فتات الخبز عن طريق نقل الأسماك إلى خزان تربية جديدة وإزالة المفرق. إمالة دبابات على زاوية لتشجيع تربية.
  4. جمع الأجنة مراحل.
    1. كل 15 دقيقة، وجمع الأجنة عن طريق نقل البالغين إلى خزان تربية الطازجة وتمرير البيض التي تركت وراءها من خلال مصفاة الشاي.
      ملاحظة: الأجنة الزرد تتطور بشكل متزامن عندما حافظت على كثافة ودرجات حرارة مماثلة.
    2. شطف البيض مع البيض المياه (0.21 جم / لتر أملاح المحيط الفوري في 1 لتر من الماء المقطر مزدوج) ونقل إلى طبق بتري. نقل طبق بتري إلى حاضنة الرطبة في 28.5 درجة مئوية مع دوران الهواء.
  5. بعد ساعتين من جمع الماضي، المخصبة نوع والأجنة المتعددة الخلايا إلى 10 سم أطباق بتري وتقليل الكثافة إلى 50 الأجنة في الطبق. حدد الأجنة من واحد، 15نافذة زمنية دقيقة لجمع لتطبيق المصب. احتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية.
    ملاحظة: على سبيل المثال، جمع الأجنة في الساعة 8:30، 8:45، 9:00، 9:15، 9:30، 9:45، 10:00 و 10:15. مقارنة عبر نقاط الوقت، إذا كان أكبر عدد من الأجنة المخصبة هم من براثن التي تم جمعها في الساعة 9:00، ثم استخدم فقط هذه الأجنة لتطبيقات المصب.

2. إعداد لتفكك خلية واحدة

  1. ما يقرب من 30 دقيقة قبل نقطة زمنية من الفائدة (18 HPF) إزالة الأجنة من المشيمه الخاصة بهم يدويا مع ملقط غرامة.
  2. جمع وتسمية التالية لكل حالة: اثنان 2 مل أنابيب microcentrifuge، واحدة من 40 ميكرومتر مصفاة الخلية، واحد 35 مم طبق ثقافة الخلية، واثنين من أنابيب FACS تصدرت مع مصفاة الخلية 35 ميكرون.
  3. هدئ الكواشف التالية على الجليد: البيض المياه التي تحتوي على 0.21g / L أملاح المحيط الفوري في 1L الماء المقطر مزدوجة؛ دي yolking العازلة التي تحتوي على 55 ملي كلوريد الصوديوم، 1.8 ملي بوكل، و 1.25 ملم NaHCO 3. وFACS العازلة التي تحتوي على يبوفيتش L-15 وسائل الإعلام تستكمل مع المعطل للحرارة 5٪ مصل بقري جنيني.
  4. جلب 1 مل لكل عينة من خلية التفكك الكاشف 1 إلى RT. ذوبان الجليد 1 مل خلية التفكك الكاشف 2 لكل عينة على الجليد. جلب لRT مباشرة قبل الاستعمال.

3. التفكك وحيد الخلية

  1. باستخدام ماصة تتحمل الزجاج واسعة، ونقل 100-300 الأجنة إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل الصغير في حجم الحد الأدنى من البيض المياه.
  2. الموت ببطء الأجنة عن طريق استبدال الماء مع الماء البيض 1 مل الجليد الباردة وغمر أنبوب في الثلج لمدة 20 دقيقة.
    تنبيه! فمن الأهمية بمكان الحصول على موافقة من لجنة الرقابة رعاية الحيوانات المؤسسية المناسبة لهذا الأسلوب القتل الرحيم (تقشعر لها الأبدان على الجليد تليها التفكك خلية أنه قتل رحيم الثانوي). يتطلب القتل الرحيم القياسية عادة أن الأجنة <3 أيام بعد الإخصاب وابيض بعد تبريد الأسماك والتي ليس مناسبا للحصول على خلايا قابلة للحياة.
  3. غسل الأجنة مرتين مع 1 مل الجليد الباردة البيض المياه. أن يغسل، واستخدام ماصة تتحمل الزجاج واسعة لإزالة المياه البيض وP1000 لإضافة البيض المياه.
  4. إزالة صفار البيض عن طريق استبدال الماء الجنين مع 1 مل Deyolking العازلة والطحن 8-12 مرات مع طرف P1000، أو حتى يذوب صفار البيض وفقط على جثث الأجنة مرئية.
  5. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة. استخدام ماصة لإزالة بلطف طاف دون الإخلال بيليه الأنسجة. إعادة تعليق في 1 مل ماء البيض.
  6. كرر الخطوة 3.5 ليصبح المجموع ثلاثة يغسل، ولكن على غسل النهائي، وإعادة تعليق في 1 مل RT خلية التفكك الكاشف 1.
  7. احتضان في الخلية تفارق الكاشف 1 لمدة 10 دقيقة في RT مع أنابيب وضعت أفقيا. كل 2-3 دقيقة، يسحن بلطف مع ماصة P1000 لمنع تراكمها.
    ملاحظة: التعامل مع عينات بلطف خلال خطوات سحن. في وقت واحد، وأجمة كبيرة ستشكل في أنبوب من مجموعة متشابكة من الهيئات الجنين. هذه الإرادةتفريق مع الهضم إضافية بمساعدة سحن لطيف. لا الدوامة.
  8. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف و resuspend في 1 مل خلية التفكك الكاشف 2.
  9. احتضان لمدة 5-15 دقائق على RT. وضع أنابيب أفقيا. كل 2-3 دقيقة، يسحن بلطف لمنع تراكمها. كل 5 دقائق، تقييم التقدم المحرز الهضم.
    1. لتقييم التقدم المحرز الهضم، ويخفف 2 ميكرولتر طاف في 18 ميكرولتر FACS العازلة وماصة كما قطرات على طبق ثقافة الخلية.
    2. وضع ساترة على عينة ومراقبة تحت المجهر زراعة الأنسجة في 10X 20X وتكبير.
      ملاحظة: يجب أن تظهر إعداد بأنها مزيج من الخلايا وحيدة، مجموعات صغيرة، مجموعات كبيرة، وأحيانا الجسم الجنين معظمها سليمة.
    3. تقييم بصريا نسبة الاعداد التي هي خلايا مفردة ومجموعات صغيرة.
      ملاحظة: والإفراط في الهضم تقلل من جدوى. تحت الهضم وتقليل العائد خلية واحدة.
  10. جمع وإعداد الخلية عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وإعادة تعليق في 1 مل الباردة FACS العازلة.
  11. بلل مصفاة الخلية 40 ميكرومتر مع FACS العازلة. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر على طبق خلية ثقافة 35 ملم. غسل الخلية مصفاة مرة واحدة مع 1 مل FACS فرز العازلة.
  12. نقل التدفق من خلال لأنبوب microcentrifuge 2 مل. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق واعادة تعليق في 100 ميكرولتر FACS العازلة.
  13. عدد العائد الخلية باستخدام عدادة الكريات. وعلاوة على ذلك تمييع عينات إلى 5X10 6 خلايا لكل مل، أو تركيز الأمثل الموصى بها لآلة نظام مراقبة الأصول الميدانية في الاختيار. اختياري، عندما عد العائد خلية على عدادة الكريات، مباين الخلايا الميتة مع الأزرق التريبان لتأكيد جدوى إعداد الخلية قبل FACS الفرز.
    ملاحظة: الاستعدادات التي يتم تمييع جدا وسوف تأخذ كمية كبيرة من الوقت لفرز. الاستعدادات التي هي أيضا جoncentrated تميل إلى تتجمع في multimers وهي الأمثل لفرز السكان نقية.
  14. احتياطي 10-20٪ من كل عينة لاستخدام الضوابط كما غير ملوثين. للعينات المتبقية، وصمة عار الخلايا الميتة عن طريق إضافة / ميت (L / D) التمييز يعيش صبغة الفلورسنت في كل عينة. لا تغسل.
    ملاحظة: أي صبغة الفلورسنت التي تخترق الخلايا مع أغشية الخلايا للخطر والبقع ويمكن استخدام الأحماض النووية كما الصبغة L / D، شريطة أن أطياف مضان متوافق مع الجهاز FACS الاختيار ووضع العلامات fluorophore خلايا الفائدة.
    1. لا يغسل إعداد بعد إضافة الصبغة حيث أن بعض الخلايا سيموت في طريقها إلى تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية، وينبغي أن تستبعد من السكان فرزها.
  15. بلل مصفاة 35 ميكرومتر الخلية توج FACS أنبوب مع العازلة FACS 20 ميكرولتر. إضافة الخلايا إلى مصفاة وجمع عن طريق الجاذبية. تخزين على الجليد.

4. نظام مراقبة الأصول الميدانية التخصيب

  1. استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لإثراء لاحدوالخلايا الحية معربا عن علامة فلوري.
    1. تعيين بوابة لتمييز الخلايا من الحطام على مساحة مبعثر مبعثر إلى الأمام (FSC-A) السعة مقابل السعة الجانب مبعثر (SSC-A)، وكلاهما مع التحجيم الخطي.
      الحذر! خلايا الزرد وعادة ما تكون أصغر من الماوس أو الخلايا البشرية. وينعكس هذا في فصل القاعدية أقل بين الخلايا والحطام.
    2. من البوابة المحددة في 4.1.1، تعيين بوابة لإثراء للخلايا واحدة واستبعاد multimers باستخدام مؤامرة مبعثر من ارتفاع الأمام مبعثر (FSC-H)، وانخفاض ارتفاع الجانب مبعثر (SSC-H)، وكلاهما مع التحجيم الخطي.
      ملاحظة: خلايا مع ارتفاع غير متناسب FSC-H وانخفاض SSC-H هي multimers المرجح ويتم استبعادها من الفرز.
    3. من مجموعة بوابة في 4.1.2، وذلك باستخدام ضوابط لون واحد، وضع بوابة لتشمل الخلايا الحية فقط باستخدام مؤامرة مبعثر من هيئة الرقابة المالية-A مع التحجيم الخطي وسعة القناة تستخدم لكشف L / D وصمة عار مع التحجيم السجل. تشمل L / D خلايا السلبية.
    4. من عندتعيين البوابة في 4.1.3، وذلك باستخدام ضوابط لون واحد، وضعت بوابة لتشمل الخلايا الحية الوحيدة مع مضان الإيجابي باستخدام مؤامرة مبعثر من هيئة الرقابة المالية-A مع التحجيم الخطي وسعة القناة تستخدم لكشف الفلورسنت علامة الخلية البروتين مع توسيع نطاق سجل . تتضمن خلايا إيجابية.
    5. تعيين أي ضوابط التعويض، إذا لزم الأمر، لحساب تدخل بين L / وصمة عار D والفلورسنت أطياف البروتين.
  2. مجموعة منطق نوع الخلايا التي تقع في جميع البوابات بتعيينه في الخطوة 4.1.
    1. استخدام الخلايا المسمى مزدوج، تحقق النابضة لفرز الخلايا.
      ملاحظة: خلايا لفرز سيكون الخلايا بدلا من الحطام، وخلايا واحدة بدلا من multimers، L / D خلايا إيجابية سلبية ومضان.
  3. نوع 2،000-4،000 الخلايا من سكان الفائدة إلى 5 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة في أنبوب microcentrifuge على الجليد. للحد من القص والضغط على الخلايا أثناء الفرز، واستخدام أقل الضغوط ممكن للخليةفارز.
    ملاحظة: قطرة 5 ميكرولتر من FACS العازلة بمثابة وسادة للخلايا الخروج من آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية. جمع 2،000-4،000 الخلايا مباشرة إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة يلغي الحاجة إلى الطرد المركزي قبل تحميل على رقائق مؤسسة التمويل الدولية. وينصح باستخدام هذه الاستراتيجية بسبب الطرد المركزي يمكن أن يؤدي إلى تشكيل multimers إذا تلتصق الخلايا لبعضها البعض في بيليه.
  4. تقييم تحليل الجدوى بعد الفرز.
    1. نقل 1 ميكرولتر فرز الخلايا إلى أنبوب FACS جديدة مع 100 ميكرولتر FACS فرز عازلة و 1: 1000 تخفيف من L / D وصمة عار. تمر الخلايا من خلال فارز FACS مع استراتيجية المحاصرة في الخطوة 4.1. استخدام نسبة L / D سلبي إلى إيجابي لتقدير جدوى من الخلايا التي تم فرزها.

5. خلايا الحمل على رقاقة على microfluidics

  1. باستخدام عدادة الكريات، وقياس كل من التركيز وحجم الخلايا فرزها.
    1. تمييع الخلايا التي تم فرزها لا يقل عن 10 ميكرولتر. تمييع قسامة من 5 μ؛ خلايا لتر مع 5 ميكرولتر التريبان الأزرق. تحميل على عدادة الكريات وتطبيق ساترة.
    2. جمع الصور الحقل مشرق لجميع الخلايا في 4 × 4 شبكات من عدادة الكريات. حساب عدد الخلايا الحية وحساب الحية خلية / مل. الخلايا الحية لا يستغرق التريبان الأزرق.
      ملاحظة: استخدام أي برنامج تحليل الصور القياسية لقياس قطرها من جميع الخلايا الحية. حساب الانحراف المتوسط ​​والمعياري للحجم الخلية، واختر لوحة مؤسسة التمويل الدولية مناسبة لمجموعة وحجم الخلية من الفائدة. إذا مدى حجم الخلية تمتد مؤسسة التمويل الدولية وحة مدى حجم الخلية، واستخدام لوحات متعددة لالتقاط مجموعة كاملة من خلايا الفائدة.
  2. خلايا الحمل على لوحة مؤسسة التمويل الدولية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر المواد).
    1. تمييع الخلايا إلى الخلايا 1x10 6 / مل وأداء الأمثل الطفو وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: الطفو الأمثل يضمن أن الخلايا لا تنزل الى القاع ولا تطفو الى أعلى أهلا وسهلا تحميلل لتحميل الأمثل على رقاقة مؤسسة التمويل الدولية. نسبة عازلة للخلايا قد تختلف من نوع من الخلايا، ولكن عادة ما يتراوح 6: 4-7: 3 من الخلايا: العازلة.
    2. إضافة إلى خلايا معدة ومؤسسة التمويل الدولية لوحة. لوحة الحمل إلى آلة FLUIDICS المتوافقة، وتشغيل برنامج نصي خلية تحميل لدفع الخلايا من خلال الدائرة على microfluidics وفي الممرات القبض عليه.
  3. تأكد من أن الخلايا استقرت في المواقع القبض على لوحة مؤسسة التمويل الدولية.
    1. إزالة لوحة مؤسسة التمويل الدولية من آلة FLUIDICS. تركيب لوحة مؤسسة التمويل الدولية على المجهر مجهزة محول لوحة.
    2. جمع لقطات من مشرق الميدان ومضان لكل موقع القبض على التكبير 10x.
      قد تتراوح Brightfield مرات القبض 10-50 مللي ثانية، اعتمادا على شدة مصباح: ملاحظة. قد تتراوح مرات القبض مضان 250-750 مللي ثانية، اعتمادا على سطوع fluorophore. تجنب تعريض الخلايا لمنع photodamage.

6. كدنا] التجميعي

  1. أداء تحلل الخلايا في الموقع وفقا للالأولتعليمات FC لوحة المصنعة.
    1. إضافة مخازن تحلل من الآبار على لوحة مؤسسة التمويل الدولية. لوحة الحمل على الجهاز FLUIDICS متوافقة وخلية المدى النصي تحلل حسب تعليمات الشركة الصانعة.
  2. أداء النسخ العكسي وفقا لتعليمات مؤسسة التمويل الدولية وحة المصنعة.
    1. إضافة الكواشف النسخ العكسي لوحة مؤسسة التمويل الدولية. لوحة الحمل على الجهاز FLUIDICS متوافقة. تشغيل البرنامج النصي النسخ العكسي. عينة شروط ركوب الدراجات: 1 دورة في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 1 دورة في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم 1 دورة في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. أداء ما قبل تضخيم مع تحقيقات الجينات المحددة وفقا لتعليمات مؤسسة التمويل الدولية وحة المصنعة.
    ملاحظة: نظرا لأكبر خصوصيتها مع أرقام منخفضة نسخة، استخدم تحقيقات الفلورة المسمى بدلا من تحقيقات الأمثل للاستخدام مع الأصباغ intercalator.
    1. الاشعال تجمع وتمييع لنهائي 180 نيوتن متر لكل منهما. إضافة الاشعال المجمعة لوحة مؤسسة التمويل الدولية. لوحة الحمل على fluidi متوافقآلة خدمات العملاء. تشغيل البرنامج النصي preamplification.
  4. أداء ما قبل تضخيم مع الظروف دورة التالية: 1 دورة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم 18 دورات مع تغيير طبيعة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ثم الصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. مخزن قبل تضخيم [كدنا في 4 درجات مئوية حتى الحصاد. حصاد كدنا] من لوحة ميكروفلويديك وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتخزينها في 20C-حتى الاستخدام.

7. حدد كدنا] من خلايا واحدة لشخص واحد الهدف QRT-PCR

  1. تمييع [كدنا في 25 كاشف تخفيف ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: التقريبي العائد النهائي هو 28 ميكرولتر من [كدنا] تضخيم ما قبل لكل خلية. حجز قسامة من مخفف لاستخدامها كوسيلة لمراقبة عدم القالب في QRT-PCR.
    1. في اشارة الى حقل مشرق والصور فلوري سجلتها في الخطوة 5.3.2، يسجل كل موقع الالتقاط. يدويا عد وتسجيل عدد من الخلايا. تقييم وتسجيل ما إذا كان كل خلية هي انفلونزاorescent.
      ملاحظة: قد يحتوي كل موقع على حدة 0، 1، أو> 1 الخلية، حيث تتضمن> 1 خلية المواقع القبض التي تحتوي على خلايا متعددة و / أو الحطام هويته. إذا كانت الصور هي نوعية كافية، ويمكن أيضا أن يتم تعيين قيمة بكسل لقياس شدة إشارة مضان.
  2. اختر عينات للتحليل QRT-PCR.
    1. اختيار عينات كدنا] من مواقع التقاط تحديدها في الخطوة 7.2 التي تحتوي على الدقيق 1 خلية مع مضان إيجابي. تجمع 1 مكل من كدنا] من كل عينة.
      ملاحظة: هذا هو "بركة" مراقبة إيجابية تستخدم لتحديد ما إذا كان يتم التعبير عن جينات الفائدة في أي من الخلايا المحددة.
    2. اختر كدنا] من موقع التقاط واحد على الأقل يحتوي بالضبط 0 خلايا كعنصر تحكم السلبية. استخدام مخفف من الخطوة 7.1.2 كوسيلة لمراقبة أي قالب.
  3. تشغيل QRT-فحص PCR.
    1. استخدام تحقيقات الوحيدة المستخدمة لمرحلة ما قبل التضخيم في الخطوة 6.4.1. تحميل جميع العينات في triplicatه. شروط ركوب الدراجات لرد فعل 10 ميكرولتر على 384 لوحة جيدا: 1 دورة 50 ° C 2 دقيقة (1)، دورة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 40 دورة مع تغيير طبيعة في 95 درجة مئوية 15 ثانية ثم الصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.

تحليل 8. البيانات

  1. التحقق من صحة المنتجات QRT-PCR بواسطة الكهربائي للهلام القياسية. تأكيد المنتج هو فرقة واحدة في الوزن الجزيئي المتوقع (تختلف عن كل مسبار).
    ملاحظة: إذا كان التحقيق تنتج عصابات متعددة أو فرقة واحدة في حجم مناسب، ثم خصوصية أمر مشكوك فيه، وهذا لا يشمل هذا الجين من التحليل.
  2. دراسة جميع منحنيات التضخيم وحساب لأي تشوهات 14. حساب متوسط ​​قيمة CT لكل تركيبة نموذج / جين 15.
    ملاحظة: القيم المقطعية لعناصر إيجابية تتراوح عادة 10-30. القيم المقطعية لضوابط السلبية عادة ما تتراوح 35-40 (أي التضخيم). القيم CT تعتبر 30-35 التعبير منخفض جداوينبغي أن تفسر بحذر 14.
  3. تقرير البيانات
    1. اذا انخفضت العينات في CT = 10-30، قد أبلغت بيانات أيضا تغيير أضعاف في نسخة الوفرة النسبية على عينة السيطرة.
      ملاحظة: طية تغير يساوي 2 ^ (- ΔΔCT) حيث ΔCT نسبة إلى الجينات التدبير المنزلي بطرح متوسط ​​المقطعية للعينة من الجينات التدبير المنزلي وΔΔCT هي الاختلافات في ΔCT بين العينة وتحكم إيجابية 15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وكدليل على المبدأ، وجرى تقييم التعبير الجيني لاستكشاف ديناميكيات التمايز خلال تطوير القلب. في الزرد، تنشأ الأسلاف القلب من السكان أرومية متوسطة من الخلايا التي تهاجر إلى لوحة جانبية الأمامي الأديم المتوسط ​​حيث تلتحم لتشكل أنبوب القلب الخطي. قبل الانصهار، تبدأ الأسلاف القلب للتعبير عن عامل النسخ nkx2.5 (NK2 علبة مثلية 5)، والتي يعتقد أن تكون أقرب علامة معينة من الأسلاف القلب 16،17. هنا، والتي سبق وصفها BAC الأسماك المعدلة وراثيا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الطريقة الموصوفة هنا يستخدم تعبير عن بروتين فلوري تحت سيطرة أحد المروجين محددة الخلية من نوع لإثراء مجموعة من الخلايا الاصلية في القلب من الأجنة الزرد لاستخدامها في نظام بمساعدة القبض على خلية واحدة ميكروفلويديك لتقييم تعبير عن مجموعة فرعية من الجينات القلب في واحد الخلايا. شريطة أن الإثارة ليزر نظام مراقبة الأصول الميدانية والانبعاثات قدرات متوافقة مع fluorophore (ق) في الاختيار، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في أي خط مراسل الفلورسنت. العديد من خطوط مراسل الزرد هي بالفعل في الوجود،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور سي جيفري بيرنز على مخزون السمك. يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمرفق UNC Flow Cytometry Core ، و UNC-CGIBD AAC CORE للموارد التي تمكن هذا المشروع ، ومرفق ZAC لرعاية. LS مدعومة بمنحة المعاهد الوطنية للصحة T32 HL069768-13 (PI ، Nobuyo Maeda). N.F. مدعوم من قبل زمالة أبحاث الدراسات العليا NSF NSF-DGE-1144081. تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة P30DK034987 (إلى UNC Advanced Analytics Core) ، ومنحة تطوير علماء جمعية القلب الأمريكية 13SDG17060010 ومنحة الباحث الجديد لمؤسسة إليسون الطبية AG-NS-1064-13 (للدكتور تشيان) ، ومنحة HL109079 من المعاهد الوطنية للصحة R00 (للدكتور ليو).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Supplies< / strong>
Dumont # 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11254-20لإزالة المشيمة من الأجنة أنبوب
الطرد المركزي الدقيق 2 ملGeneMateC-3261-1
مصفاة خلية 40 ميكرومتربيوبيسكيسSP104151
طبق ثقافة 35 ممفالكون351008
أنابيب FACS مغطاة بمصفاة خلية 35 umFalcon352235
P1000 ونصائحRainin17005089
P20 ونصائحRainin17005091
بروتوكول الشركة المصنعة لرقائق IFCFluidigm100-6117الإصدار 100-6117 تم استخدام E1 في تجربة تمثيلية
ماصة زجاجية واسعة التجويفVWR14673-010ل نقل الأجنة
البالغين من النوع البري الزردN / Aاستخدمنا خط AB
أسماك الزرد المعدلة وراثيا للبالغينN / Aاستخدمنا Tg (nkx2.5: ZsYellow)
NameCompanyCatalog NumberComments
Recomposition لتفكك الخلايا< / قوي >
الماء المقطر المزدوجN / A
ملح البحر الفوري للمحيطSS15-10
NaClFisherScientificS271-3يصنع مخزونا في الماء ويستخدم لإزالة الصفار العازلة
KClSigma AldrichP5405اصنع مخزونا في الماء ويستخدم لإزالة صفار البيض
NaHCO3Sigma AldrichS6014تصنع مخزونا في الماء وتستخدم لإزالة صفار البيض العازلة
Leibovitz's L-15Gibco21083-027
FBSFisherScientific03-600-511تعطيل الحرارة ؛ يجب أن تكون أي علامة تجارية من FBS جيدة
كاشف تفكك الخلية 1 -TrypLELife Technologies12605-010يخزن في درجة حرارة الغرفة.
كاشف تفكك الخلية 2 - مخزن T200100 FACSmaxGenlantis-20 ؛ ذوبان الجليد ؛ إحضاره إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدام
بروناز (اختياري)صبغة SigmaP5147
L / D - Sytox BlueLife TechnologiesS34857أي بقعة حية / ميتة مناسبة لقياس التدفق الخلوي ستعمل
Trypan BlueGibco15250-061
name< / strong> CompanyCatalog NumberComments
Recodes لاستخدام لوحة IFC ومجسات qRT-PCR
Gene-Gene-Engineستختلف المجسات حسب التجربة
TaqMan Probe ef1aLife TechnologiesDr03432748_m1
TaqMan Probe gata4Life TechnologiesDr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5Life TechnologiesDr03074126_m1
TaqMan Probe myl7Life TechnologiesDr03105700_m1
TaqMan Probe vmhcLife TechnologiesDr03431136_m1
TaqMan Probe isl1LifeTechnologies Dr03425734_m1
4369016
المدرجة في بروتوكول
C1 Reagent KitFluidigm100-5319الكواشف لتحميل الخلايا على لوحة IFC
Ambion Single Cell-to-CTTMLife Technologies4458237الكواشف للنسخ العكسي وخطوات التضخيم المسبق
جودة البيولوجيا الجزيئية للمياه46-000 سم
C1 IFC ل PreAmp (5-10 أم)لوحة Fluidigm100-5757IFC للخلايا الصغيرة
<قوي>الاسم< / قوي><قوي>الشركة< / قوي><قوي>رقم الكتالوج< / strong>تعليقات
Equipment< / strong>
C1 AutoPrep آلةFluidigm100-5477للوحة IFC تستخدم
مقياس الدم  Z359629 سيجما ألدريتشلعد الخلايا وتقييم حجم الخلية
مجهرلإزالة الأجنة من المشيمة
مجهرلتقييم هضم الخلية المفردة
آلةلعزل الخلايا ذات الأهمية
الفوري الكواشف الكواشف الشركة المصنعة لمؤسسة التمويل الدولية تشريح زراعة الأنسجة FACS

المراجع

  1. Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
  2. Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
  3. Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
  4. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
  5. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
  6. Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
  7. Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
  8. Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
  9. Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
  10. Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
  11. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  13. Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644(2014).
  14. McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
  15. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
  16. Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
  17. Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
  18. Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
  19. Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
  20. McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102(2008).
  21. Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
  22. Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
  23. de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
  24. Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
  25. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
  26. Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FACS QRT PCR
عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.