مقالة منهجية

تحويل جينية كطريقة آمنة وبسيطة للحصول على خلايا إفراز الأنسولين من الخلايا الليفية الجلد الكبار

DOI:

10.3791/53880

⸱

مارس 18, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم تقديم طريقة جديدة تسمح بتحويل الخلايا الليفية الجلدية البالغة إلى خلايا تفرز الأنسولين. تعتمد هذه التقنية على التحويل اللاجيني ، ولا تنطوي على استخدام نواقل الفيروسات القهقرية ولا اكتساب حالة مستقرة متعددة القدرات. لذلك فهو واعد للغاية لتطبيقات الطب الانتقالي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب الطب التجديدي خلايا جديدة تعمل بكامل طاقتها يتم تسليمها للمرضى من أجل إصلاح الأنسجة المتدهورة أو التالفة. عندما لا تكون هذه الخلايا متاحة بسهولة ، يمكن الحصول عليها باستخدام مناهج مختلفة تشمل ، من بين العديد ، إعادة البرمجة والتمايز الانتقالي ، مع مزايا وقيود خاصة بالتقنيات المختلفة. هنا يتم وصف استراتيجية جديدة لتحويل الخلايا الليفية الناضجة البالغة إلى خلية تفرز الأنسولين ، والتي تم تصنيفها بشكل تعسفي على أنها خلايا محولة جينية (EpiCC). تم تطوير الطريقة ، بناء على الفهم المتزايد للآليات التي تتحكم في التنظيم اللاجيني لمصير الخلية وتمايزها. على وجه الخصوص ، تستخدم الخطوة الأولى معدلا لاجينية ، وهو 5-aza-cytidine ، لدفع الخلايا البالغة إلى حالة "متساهلة للغاية". ثم يستفيد من هذه النافذة القصيرة والقابلة للانعكاس من اللدونة اللاجينية ، لإعادة معالجة الخلايا نحو سلالة مختلفة. يسمى هذا النهج "تحويل الخلايا اللاجينية ". إنها طريقة بسيطة وقوية للحصول على مفتاح خلوي فعال وخاضع للرقابة ومستقر. نظرا لأن البروتوكول لا يتضمن استخدام أي تعداء جيني ، فهو خال من النواقل الفيروسية ولا ينطوي على حالة مستقرة متعددة القدرات ، فهو واعد للغاية لتطبيقات الطب الانتقالي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف الأساسي من الطب التجديدي هو توليد خلايا جديدة والفنية التي يمكن أن تستخدم لإصلاح أو استبدال التالفة، تحولت الأنسجة. اعادة تشكيل خلايا بالغة متاحة بسهولة في جديدة، وتحويلها من نوع خلية واحدة إلى أخرى، هو نهج جذابة بشكل خاص، خصوصا عندما يكون السكان الخلية المطلوبة ليست وفيرة أو صعوبة الوصول إليها. ومع ذلك، خلايا بالغة مستقرة بشكل ملحوظ. يكتسبون دولتهم متباينة من خلال تقييد تدريجي في خياراتها، وبمجرد وصولها إلى التخصص محطة ناضجة، فإنها مستقر الاحتفاظ بها 1.

في السنوات الأخيرة تم وضع عدد من البروتوكولات، التي تمكن من إعادة برمجة لتعدد القدرات من خلية جسدية (آي بي إس) تحققت من خلال التعبير القسري لمجموعة من النسخ عوامل 2،3. بدلا من ذلك، تحويل الخلايا يمكن الحصول عليها عن طريق transdifferentiation النسب المباشر، وإدخال واحد 4 ص> أو مزيج من النسخ عوامل 5-7. لا تنطوي هذه الاستراتيجية الانتقال من خلال دولة متباينة دي ولكن يتطلب التعبير عالية من النسخ محددة عوامل 8.

لقد وضعت مؤخرا على بروتوكول التحويل على أساس التعرض قصيرة من الخلايا البالغة إلى خصائص demethylating من سيتيدين التناظرية 5 آزاسيتيدين (5-عزة-CR)، وتتميز بشكل جيد المانع الحمض النووي ناقلة الميثيل. ويتبع الخطوة نزع الميثيل على الفور من قبل بروتوكول التمايز محددة 11/9 التي تسمح للحصول على النمط الظاهري المحطة المطلوبة. هذا الأسلوب هو قادرة على تحويل ناضجة، وخلايا متباينة في الخلايا من سلالة مختلفة ولديه ميزة كبيرة لتجنب كل من استخدام ناقلات فيروسية وترنسفكأيشن من أي عوامل النسخ الخارجية. وتجنب أيضا الاستحواذ على الدولة المحفزة مستقرة، والمتعلقة زيادة القابلية للخلية عدم الاستقرار.

"jove_content"> بروتوكول مفصل يسمح للتحويل الخلايا الليفية الجلد البشري الكبار في الخلايا المفرزة للأنسولين تعمل بكامل طاقتها ويرد هنا. ومع ذلك، فمن الجدير بالذكر أن هذه التقنية تم تطبيقها على أنواع مختلفة من الخلايا، ولدت نتائج إيجابية، عند معالجة الخلايا تجاه مختلف مسارات التمايز. وعلاوة على ذلك، تم استخدام تحويل جينية بنجاح في الجنس البشري والخنازير 13/09 وكذلك في الكلب (مخطوطة المقدمة) مما يدل على فعالية واسعة ومتانة هذا النهج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات الموضحة أدناه تحت غطاء تدفق الصفحي في ظروف معقمة. تأكد من أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات ثقافة الخروج على مراحل يسيطر حراريا ويتم الاحتفاظ الخلايا عند 37 درجة مئوية طوال تعاملها.

1. الجلد الخلايا الليفية عزل

  1. إعداد الثقافة صحن طلاء الحل
    1. حل 0.1 غرام من الجيلاتين الخنزيري في 100 مل من الماء (تركيز النهائي 0.1٪). تعقيم حل مع الأوتوكلاف.
    2. إضافة 1.5 مل من العقيمة الجيلاتين الخنزيري 0.1٪ إلى 35 ملم أطباق بتري. الانتظار 2 ساعة إلى معطف، والحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يتم جمع خزعات الجلد الإنسان عن طريق الاستئصال تحت التخدير الموضعي من منطقة اوعائية من الجانب الأمامي من الساعد وتخزينها في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع 2٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية في +4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. غسل الخزعات مع برنامج تلفزيوني جديد تستكمل مع 2٪ عنتيبيحل مضاد فطري أذني.
  3. مكان الخزعات في طبق 100 ملم بيتري ومقطعة إلى حوالي 2 مم 3 أجزاء مع المشارط معقمة.
  4. إزالة طلاء حل الزائدة مباشرة قبل الطلاء شظايا.
  5. ضع 5-6 أجزاء الجلد في طبق بيتري قبل المغلفة 35 مم.
  6. إعداد مستنبت الخلايا الليفية: 77٪ Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) ارتفاع نسبة الجلوكوز 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪، الجلوتامين حل و 2٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية.
  7. إضافة قطرة من متوسطة الليفية على كل جزء (عادة 100 ميكرولتر لكل جزء) والثقافة لهم عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
  8. بعد 24 ساعة، إضافة 500 ميكرولتر من مستنبت الخلايا الليفية على شظايا لإبقائها رطبة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
  9. تغيير المتوسطة مع ماصة مرة واحدة على الأقل كل 48 ساعة.
  10. بعد 6 أيام من الحضانة، وإزالة شظايا الأنسجة بعناية والتخلص منها.
    ملاحظة: بعد 6 أيام، الليفيةالصورة تبدأ في النمو من شظايا الأنسجة والبدء في تشكيل أحادي الطبقة الخلية.
  11. تحديث المتوسطة، إضافة 2 مل من مستنبت الخلايا الليفية ومواصلة زراعة الخلايا أحادي الطبقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.

2. الخلايا الليفية الثقافة

  1. الليفية الثقافة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حتى 80٪ التقاء
  2. لالركض، ونضح مستنبت الخلايا الليفية من أطباق زراعة الأنسجة. غسل خلايا ثلاث مرات مع 4 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية.
  3. إضافة طبقة رقيقة (10٪ من حجم مستنبت) من حل التربسين-EDTA (0.5 جم / لتر الخنازير التربسين و 0.2 جم / لتر EDTA) واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ أحادي الطبقة الخلية إلى فصل من الجزء السفلي من الأنسجة طبق ثقافة والخلايا تنأى.
  4. تمييع تعليق خلية مع 9 أجزاء من مستنبت الخلايا الليفية إلى تحييد عمل التربسين. الطرد المركزي ليست ضرورية.
  5. لوحة الخلايا في أطباق ثقافة جديدة (معمن الجيلاتين) والثقافة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. إبقاء نسبة مرور بين 1: 2 و 1: 4، وهذا يتوقف على معدل النمو.
  6. عندما تصل خلايا حوالي 80٪ التقاء، والمرور منها (عادة مرتين في الأسبوع).

3. الخلايا الليفية تصفيح لجينية التحويل

  1. إضافة 0.26 مل / سم 2 من 0.1٪ الجيلاتين الخنزيري (إعداد كما هو موضح في 1.1) لأطباق زراعة الخلايا. الانتظار 2 ساعة إلى معطف.
  2. إزالة حل طلاء تتجاوز 10-30 دقيقة قبل طلاء الخلايا الليفية.
  3. إزالة مستنبت الخلايا الليفية من أطباق الثقافة. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية.
  4. إضافة طبقة رقيقة (10٪ من حجم مستنبت) من حل التربسين-EDTA (0.5 جم / لتر الخنازير التربسين و 0.2 جم / لتر EDTA) واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ أحادي الطبقة الخلية إلى فصل من الجزء السفلي من الأنسجة طبق ثقافة والخلايا تنأى.
  5. تمييع تعليق خلية مع 9 أجزاء من fibroblأست مستنبت لتحييد عمل التربسين.
  6. عد الخلايا باستخدام غرفة الفرز تحت المجهر في درجة حرارة الغرفة. حساب الكمية المطلوبة من مستنبت الخلايا الليفية ل resuspend الخلايا، للحصول على تركيز خلية من 7.8 × 10 4 الخلايا الليفية / سم 2. وهذا يعتمد على نوع معين من الغرفة المستخدمة.
    خلية / ميكرولتر = متوسط ​​عدد الخلايا في صغير شبكة × 90 (الضرب عامل) س التخفيف
  7. تعليق خلية الطرد المركزي في 150 غ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة الخلايا طاف و resuspend مع حجم المحسوبة سابقا من مستنبت الخلايا الليفية.
  8. لوحة الخلايا على 0.1٪ الجيلاتين أطباق والثقافة لهم لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة قبل المغلفة.

4. زيادة اللدونة الخلية باستخدام دي مزج بالميثيل وكيل 5-عزة-CR

  1. اليوم 0
    1. إعداد 5-عزة CR-حل الأسهم عن طريق إذابة 2.44 ملغ من 5 عزة-CR في 10 مل من DMEM عالية الجلوكوز ميديأم. تعقيم عن طريق الترشيح. إعداد الأوراق المالية 5-عزة-CR فورا قبل الاستخدام.
    2. تمييع 1 ميكرولتر من 5 عزة CR-حل الأسهم في 1 مل من مستنبت الخلايا الليفية (نهائي تركيز 1 ميكرومتر).
    3. لزيادة ليونة الخلية، 24 ساعة بعد خلية الطلاء (العنوان الفرعي 3.8)، وإزالة مستنبت من الخلايا الليفية المزروعة، إضافة 1 ميكرومتر 5-عزة CR-حل الأوراق المالية والثقافة لمدة 18 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
  2. اليوم 1
    1. إعداد الطازجة المتوسطة متعددة القدرات البشرية (HP) كما هو موضح في الجدول رقم 1.
    2. بعد الحضانة مع 1 ميكرومتر 5-عزة-CR، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لضمان 5-عزة-CR يتم شطف بعيدا.
    3. احتضان 5-عزة-CR الليفية تعامل مع HP متوسطة لمدة 3 ساعة (فترة نقاهة) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
    4. بعد فترة النقاهة، وإزالة المتوسطة، ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    5. لمراقبة كفاءة 5-عزة-CR العلاج، وتحقق في هذه الخطوة fأو وجود تغيرات شكلية (المفصل في قسم النتائج). تفقد خلايا مورفولوجيا ممدود نموذجية من الخلايا الليفية وتكتسب مستديرة أو بيضاوية الشكل، ليصبح أصغر في الحجم، مع نوى الموسع.
    6. المضي قدما في التمايز البنكرياس.

5. بروتوكول التمايز البنكرياس

  1. أيام 1-6
    1. إعداد البنكرياس بصل متوسطة كما هو موضح في الجدول رقم (2).
    2. إعداد activin حل الأسهم: حل 5 ميكروغرام من activin البروتين البشري المؤتلف في 166.6 ميكرولتر من الماء المعقم.
    3. ثقافة 5-عزة-CR علاج الخلايا الليفية في 0.26 مل / سم 2 من البنكرياس بصل متوسطة، على أن تستكمل مع 1 ميكرولتر / مل activin حل الأوراق المالية (انظر 5.1.2) لمدة 6 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. تغيير يوميا المتوسطة.
  2. أيام 7-8
    1. إعداد الريتينويك حل الأسهم حمض بإضافة 16.6 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 50 ملغ من المجلس الدولي للمطارات الريتينويكد.
    2. خلايا الثقافة في 0.26 مل / سم 2 من البنكرياس بصل متوسطة تستكمل مع 1 ميكرولتر / مل activin حل الأوراق المالية (انظر 5.1.2) و 1 ميكرولتر / مل حل الأسهم حمض الريتينويك (انظر 5.2.1) لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. تغيير يوميا المتوسطة.
  3. أيام 9-36
    1. خلايا الثقافة في 0.26 مل / سم 2 من البنكرياس بصل متوسطة تستكمل مع 1٪ (ت / ت) الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم (ITS)، 2٪ (V / V) B27 و 0.1٪ (ت / ت) المؤتلف جمعية جيل المستقبل الإنسان الأساسية (bFGF) حل سهم (انظر الجدول 1) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. تغيير المتوسطة يوميا لمدة 15 يوما الأولى.
    2. من يوم 16 فصاعدا، وتجديد المتوسط ​​كل يوم، تحت المجهر، منذ تشكيل خلايا الكلية قد فصل من الجزء السفلي من صحن الثقافة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنشاء ثقافة الأولية من خزعات الجلد
قطعت خزعات الجلد في أجزاء صغيرة ووضعها في أطباق الجيلاتين قبل المغلفة. بعد 6 أيام، بدأت الخلايا الليفية للتخلص من شظايا الأنسجة وشكلت أحادي الطبقة الخلية (الشكل 1A). أظهرت خلايا مستطيلة نموذجية، وكما هو متوقع، اظهرت موحدة المناعة الإيجابية لالليفية محدد فيمنتين علامة (فيم، الشكل 1B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف المخطوطة الحالية الأسلوب الذي يسمح للتحويل الخلايا الليفية الجلد البشري إلى خلايا منتجة للأنسولين، من خلال التعرض عابرة وموجزة ل5-عزة-CR، تليها بروتوكول تحريض محددة الأنسجة. هذا النهج يتيح التحول من الأديم المتوسط ​​إلى خلايا ذات الصلة الأديم، من دون التعبير القسري لعوامل النسخ أو الرنا الميكروية ولا الاستحواذ على الدولة المحفزة مستقرة، والتي تجعل الخلايا أكثر غير مستقرة وعرضة للأخطاء 14.

في الخطوة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلف أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة Carraresi والمؤسسة الأوروبية لدراسة مرض السكري (EFSD). ويدعم GP من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من جامعة ميلانو. المؤلفون هم أعضاء في عمل التكلفة FA1201 Epiconcept: علم التخلق وPericonception البيئة والعمل تكلفة BM1308 مشاركة السلف على نماذج حيوانية كبيرة (SALAAM). TALB عضو في العمل تكلفة الأحياء CM1406 جينية الكيميائية (EPICHEM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dulbecco's Fossil Buffered SalineSigmaD5652PBS ؛ لغسل الخلايا وإعداد المحلول
المضاد للمضادات الحيوية محلول المضادات الحيويةSigmaA5955مكون من الخلايا الليفية والصحة ووسائط البنكرياس
100 مم طبق بتريSarstedt83.3902لعزل الخلايا الليفية
جيلاتين الخنازيرSigmaG1890لطلاء الأطباق
WaterSigmaW3500لتحضير المحلول
أطباق بتري 35 ممSarstedt83.39لعزل الخلايا الليفية
DMEM ، الجلوكوز العالي ، تقنيات الحياة البيروفاتية41966052لزراعة الخلايا الليفية
المتوسطة تقنيات مصل الأبقار الجنيني10500064FBS ؛ مكون من الخلايا الليفية ووسائط HP
محلول L-GlutamineSigmaG7513مكون من الخلايا الليفية والصحة ووسائط البنكرياس
محلول التربسين-EDTASigmaT3924لتفكك الخلايا الليفية
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 مع شبكاتHycor Biomedical87144عد الخلايا
5-AzacytidineSigmaA23855-aza-CR ، لخلية الزيادة اللدونة في الخلايا الليفية تقنيات
F-10 Nutrient MixLifeمن Ham 31550031ل HP medium
DMEM ، والجلوكوز المنخفض ، وتقنيات الحياة البيروفاتية31885023لتقنيات
HP متوسطة الضربة القاضيةلاستبدال المصل10828028
لحل الأحماض الأمينية غير الأساسيةHP المتوسطة MEM 11140035مكون من الوسائط القاعدية HP والبنكرياس
2-MercaptoethanolSigmaM7522مكون من HP والوسائط القاعدية البنكرياس
GuanosineSigmaG6264مكون مخزون مزيج النيوكليوزيد من HP متوسط
AdenosineSigmaA4036مكون مخزون مزيج النوكليوزيد من HP المتوسطة
CytidineSigmaC4654مكون مخزون مزيج النوكليوزيد من HP المتوسطة
UridineSigmaU3003مكون مخزون مزيج النيوكليوزيد من HP المتوسطة
ThymidineSigmaT1895مكون مخزون مزيج النوكليوزيد من HP المتوسطة
Millex-GS 0،22 & micro ؛ مميليبورSLGS033SBلتعقيم محلول
FGF-Basic (AA 1-155) تقنيات حياة البروتين البشري المؤتلفPHG0261bFGF ؛ مكون من HP والبنكرياس القاعدية
الألبومين الأبقار مصلسيجماA3311BSA ؛ مكون من البنكرياس المتوسط القاعدي
DMEM / F-12Life Technologies11320074لمكمل البنكرياس القاعدي المتوسط
B-27 مطروحا منه تقنيات فيتامين أ12587010 مكونات
الملحق N-2تقنيات الحياة17502048مكون من البنكرياس الوسط
القاعدي Activin A تقنيات حياة البروتين البشري المؤتلفPHG9014المتوسط البنكرياس
SigmaR2625لوسط البنكرياس
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSigmaD2650DMSO ؛ لتحضير مخزون حمض الريتينويك
تقنياتالأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم41400045ITS ؛ للوسط النهائي للبنكرياس
الأجسام المضادة للفيمنتين   ؛Abcamab8069للتحليل الكيميائي المناعي. تخفيف العمل 1: 100
4 & prime;,6-Diamidino-2-فينيليندول ثنائي هيدروكلوريدسيجما32670DAPI. للتحليلات الكيميائية المناعية. تخفيف العمل  1 وميكرو ؛ جم / مل
5-ميثيل سيتيدينيوروجينتيكMMS-900P-Bللتحليلات الكيميائية المناعية. تخفيف العمل 1: 500
الجسم المضاد للببتيد المضاد C   ؛Abcamab14181للتحليل الكيميائي المناعي. تخفيف العمل 1: 100
الجسم المضاد المضاد PDX1  Abcamab47267للتحليل الكيميائي المناعي. تخفيف العمل 1: 500
ميركوديا الأنسولين ELISAMercodia10-1113-10للكشف عن إفراز الأنسولين
مكون من تقنيات الحياة من المتوسطة بنكرياس التكميلية لحمض الريتينويك

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

5 aza cytidine Activin A ITS B27 BFGS PDX1 CPEP

مقالات ذات صلة