مقالة منهجية

تحديد الظروف الحرجة لالمناعية في البازلاء المن الأجنة: زيادة نفاذية الأنسجة وتقليل خلفية تلطيخ

DOI:

10.3791/53883

⸱

فبراير 2, 2016

 , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 3Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 4Genome and Systems Biology Degree Program, National Taiwan University and Academia Sinica

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول للتلوين المناعي الكامل على أجنة المن ، حيث يتم معالجة الظروف الحرجة لتقليل تلطيخ الخلفية وزيادة نفاذية الأنسجة. تم تطوير هذه الشروط خصيصا للكشف الفعال عن التعبير البروتيني في الأنسجة الجنينية لحشرات المن.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وAcyrthosiphon pisum البازلاء أولا بأول، مع تسلسل الجينوم واللدونة المظهرية وفيرة، وأصبحت نموذجا الناشئة للدراسات الجينية والتنموية. مثل المن أخرى، A. pisum نشر بسرعة عن طريق الاستنساخ لود عذري، حيث تطور الأجنة داخل غرف البيض بطريقة خط التجميع في ovariole. سابقا أنشأنا منصة قوية من جبل لالجامع في الموقع التهجين السماح الكشف عن التعبير مرنا في الأجنة أولا بأول. لتحليل التعبير من البروتين، على الرغم من إنشاء بروتوكولات لالمناعية للovarioles من المن لود اللاجنسي لم تسفر عن نتائج مرضية. نحن هنا تقرير الظروف الأمثل لزيادة نفاذية الأنسجة وتقليل تلوين الخلفية، سواء التي كانت مشاكل عند تطبيق النهج المعمول بها. وتشمل التحسينات: (1) حضانة بروتين K (1 ميكروغرام / مل، 10 دقيقة)، الذي عثر عليه و الأساسيةأو اختراق الأجسام المضادة في الأجنة المتوسطة والمرحلة المتأخرة أولا بأول. (2) استبدال العادي مصل الماعز / البقري ألبومين المصل مع كاشف الحجب توفيره من قبل Digoxigenin (DIG) المستندة العازلة مجموعة و(3) تطبيق الميثانول بدلا بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) لتبيض البيروكسيداز الذاتية. مما ادى الى تراجع كبير في تلوين الخلفية في الأنسجة أولا بأول. وهذه الظروف الحرجة الأمثل لالمناعية السماح الكشف الفعال للمنتجات الجينات في الأجنة من A. pisum والمن أخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المن والحشرات hemipteran مع (1-10 ملم) هيئات صغيرة ناعمة. تتغذى على النباتات التي تمتص عصارة اللحاء مع فمها خارقة. بالإضافة إلى ذلك، فهي تعتمد على البكتيريا endosymbiotic تلزم، Buchnera aphidicola، لتجميع الأحماض الأمينية الأساسية التي تعاني من نقص في الغذاء عصارة اللحاء. المن لها تاريخ حياة معقد يتضمن الاستنساخ لود عذري خلال فصلي الربيع والصيف الضوئية يوم طويل والاستنساخ بياض الجنسي سببها الضوئية قصيرة اليوم تم خلاله وضع عدد محدود من البيات الشتوي البيض 1،2. في ربيع هذه يفقس البيض لإنتاج الجيل الأول من كل الإناث المن (fundatrices)، وبعد عدة جولات من الاستنساخ عذري حتى الخريف. والتوالد العذري الدوري في المن، حيث مراحل اللاجنسي والجنسي البديل في دورة الحياة السنوية، وقد تم اعتباره 1،2 الجدة التطوري. في المن لود عذري، مرحلة التطور الجنيني يحدث داخل غرف البيض من الأنابيب المبيض (ovarioles). على النقيض من ذلك، الأجنة بيوض الجنسية تتطور في البيض المخصب. وبصرف النظر عن ليونة الإنجابية، ويمكن المن عرض transgenerational polyphenism الجناح: استجابة لإشارات الاكتظاظ والتهديدات المفترس، يمكن للإناث اللاجنسي unwinged إنتاج viviparously ذرية المجنح للهجرة لمسافات طويلة. نشر تسلسل الجينوم من المن البازلاء Acyrthosiphon pisum -THE أول تسلسل الجينوم لالقاعدية الحشرات يسمح hemimetabolous مواصلة استكشاف اللدونة الإنجابية، polyphenism الجناح، وغيرها من الميزات بما في ذلك التفاعلات الحشرات والنبات، vectoring الفيروسي والتعايش في المن على الجزيئي أساس 3.

بالإضافة إلى تسلسل الجينوم، الأدوات المطلوبة لتحديد خصائص التعبير الجيني وظيفة لتعزيز المن البازلاء كنموذج كائن ناضج 4. وصفناها بروتوكولات قوية من كامل جبل التهجين الموضعي للكشف عن التعبير مرنا في الأجنة أولا بأول 5-7 في. وقد استخدم تدخل الحمض النووي الريبي (رني) عن طريق الحقن المزدوج تقطعت بهم السبل RNA والتغذية لإسكات الجينات في حوريات المن والكبار، ولكن لم يتم الابلاغ عن ظروف مستقرة لجين ضربة قاضية في الأجنة 10/08. المناعية، وهو النهج القائم على الأجسام المضادة التي يمكن الكشف عن البروتين التعبير في عينات قبل وبعد رني ضربة قاضية، وقد أجريت على الأجنة البازلاء أولا بأول 11-13. ومع ذلك، زيادة نفاذية الأنسجة والقضاء على تلوين الخلفية غير مرضية حتى الآن باستخدام البروتوكولات القياسية لالمناعية في الأجنة لود اللاجنسي من المن البازلاء. على سبيل المثال، وجدنا أن انخفض اختراق الأجسام المضادة إلى الأنسجة في الأجنة gastrulating (مراحل 10/08) وأن الأجنة مع براعم الأطراف يمكن تحديدها شكليا (مراحل 13-14) كانت بالكاد يسهل اختراقها للأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، تم تصور تلوين الخلفية في viviparo اللاجنسيلنا البازلاء الأجنة أولا بأول الملون باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة سلالة الجرثومية فاسا وكذلك ضد البروتين Engrailed / Invected أعرب في قطاعات الجنينية 12،13. في الواقع كان لا يزال تلوين الخلفية واضحة للعيان في الأجنة ملطخة الأجسام المضادة الثانوية وحدها.

من أجل زيادة نفاذية دون الإضرار سلامة الأنسجة أولا بأول، ونحن معاير بعناية وتركيز بروتين K وتحديد الظروف المثلى لعملية الهضم الأنسجة على الأجنة أولا بأول. من أجل تجنب تلطيخ غير محددة في المن البازلاء، ونحن بحثت عن المركبات التي يمكن أن تمنع بالفعل الأجنة والنشاط البيروكسيداز الذاتية (POD)، وهو إنزيم يعمل على تضخيم الإشارات خلال المناعية قمع. A كاشف الحجب التي يقدمها Digoxigenin (DIG) المستندة إلى مجموعة العازلة، بدلا من مصل الماعز العادي يستخدم تقليديا (خ ع) / الأبقار مصل الزلال (BSA)، انخفاضا كبيرا تلوين الخلفية. وعلاوة على ذلك، تم العثور على الميثانول ليتنهىبت النشاط POD الذاتية أكثر فعالية من بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2). وسيتم وصف تفاصيل بشأن هذه الشروط أولا بأول محددة لالمناعية على الأجنة في الأقسام التالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة المن

جمعت سلالة مختبر عذري لود البازلاء المن A pisum أصلا في وسط تايوان، وقد تربى على النباتات المضيفة (وبيسوم حديقة البازلاء Pisum أو الفول الفول الفول) تحت الضوئية يوم طويل لأكثر من 300 أجيال: ملاحظة. (جيل واحد: ~ 10 يوما).

  1. إنبات بذور
    1. نقع بذور النباتات العائلة فى ماء الصنبور لمدة 3-5 أيام في RT. إعادة ملء مع المياه العذبة مرة واحدة يوميا.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وضع بذور النباتات المضيفة مباشرة الى التربة الرطبة يمكن أن تحفز إنبات كذلك.
    2. تنمو 10 البذور في الإنبات في وعاء صغير (9 سم قطر × 7 سم) مع التربة في غرفة النمو تحت الضوئية 16 ساعة ضوء / 8 ساعات الظلام في 20 ° C.
    3. بعد حوالي 10 أيام ويبدأ نمو، ونقل المن على النباتات التي هي ارتفاع أكثر من 8 سم.
  2. نقل المن
  3. الحفاظ على كل وعاء للنباتات داخل كوب 1 كوب L، ونقل 8 المن الكبار على النباتات باستخدام فرشاة الرسام، ثم ختم الكأس مع غطاء جوي للاختراق مثل شبكة الشاش لمنع المن من الهرب.
  4. احتضان المن في غرفة النمو تحت الضوئية 16 ساعة ضوء / 8 ساعات الظلام في 20 ° C. الماء كل وعاء النبات من النباتات مرة واحدة كل يوم.
  5. للحصول على الجيل القادم من المن، نكرر الخطوات 1.1.3-1.2.2 بعد عشرة أيام من نقل المن الأساسي.

2. تشريح والتثبيت من المبايض

  1. طازجة إعداد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باعتبارها منطقة عازلة التثبيت.
  2. ملء بئر واحدة من لوحة البقعة مع PFA (حوالي 500 ميكرولتر)، وضع لوحة تحت المجهر ستيريو في التكبير المنخفض، ويغرق في المن الكبار داخل PFA للتشريح.
  3. تشريح المبيض عن طريق الضغط على الرأس والبطن مع مجموعة واحدة من الملقط، وقطع مفتوحة ظهريبشرة البطن، وسحب المبايض بعيدا عن تجويف البطن.
  4. إصلاح ثلاثة أزواج من المبيض في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 1 مل من PFA في RT لمدة 20 دقيقة.
  5. صب عازلة التثبيت مع ماصة نقل (إما من الزجاج أو التخلص منها) ثم يغسل المبايض مع 0.2٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني 1X (PBST) 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما. خفيفة تهتز على خلاط / المدورة (زاوية الدوران: 60 ° (F60) / سرعة دوران: 8 RPM) يوصى لكل من تثبيت والغسيل.

3. العلاج مع بروتين K (PK) لزيادة نفاذية الأنسجة الجنينية

يتم تطبيق العلاج PK إلى الأجنة من الفرقة الجرثومية تمديد فصاعدا (المرحلة 11 من التنمية): ملاحظة. لأجنة الأصغر سنا، هذه الخطوة اختيارية.

  1. تمييع متسلسل محلول المخزون من PK (10 ملغ / مل) مع برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز العمل 1 ميكروغرام / مل.
  2. احتضان المبايض مع 1 ميكروغرام / مل من PK (حوالي 500 ميكرولتر) لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز خفيف.
  3. صب PK solutiعلى وثم يغسل المبايض مع 700 ميكرولتر من جليكاين (2 ملغ / مل) 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  4. غسل المبايض مع 0.2٪ PBST مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
  5. إصلاح المبيض مرة أخرى مع العازلة التثبيت لمدة 15 دقيقة في RT مع اهتزاز خفيف.
  6. تجاهل طاف ويغسل المبايض مع 0.2٪ PBST مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما.

4. الميثانول الحضانة للقمع في البيروكسيداز الذاتية (POD) النشاط

لا يتم تطبيق الميثانول الحضانة إلى الأجنة يتعرضون لتلطيخ Phalloidin أو الأجسام المضادة الحواتم التي هي الميثانول حساسة: ملاحظة.

  1. متسلسل يذوى المبايض بنسبة مختلفة من الميثانول في 0.2٪ PBST (ت / ت: 1: 3، 1: 1، 3: 1) التي يحتضنها المبيضين في كل تركيز محلول الميثانول لمدة 10 دقيقة مع الإثارة معتدل.
  2. يذوى المبايض مع الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 ساعة على RT مع اهتزاز خفيف.
    ملاحظة: لا يزال من الممكن الحصول على نتائج مرضية من تلطيخ من الأنسجة المن التي تم تخزينها في الميثانول بنسبة 100٪ في -20 &# 176؛ C لمدة شهر واحد.
  3. متسلسل ترطيب المبايض بنسبة مختلفة من الميثانول في 0.2٪ PBST (ت / ت: 3: 1، 1: 1، 1: 3) التي يحتضنها المبيضين في كل تركيز محلول الميثانول لمدة 10 دقيقة مع الإثارة معتدل.

5. تلوين الأجسام المضادة

  1. تمييع الحل 10X حجب من مجموعة العازلة على أساس DIG (DIG-B) ل1x أخرى.
    ملاحظة: الحل حجب 1X DIG-B هو أكثر فعالية للحد من الخلفية تلطيخ من عرقلة كاشف القياسية تتكون من 5٪ (V / V) مصل الماعز العادي (خ ع) و 0.5٪ (ت / ت) ألبومين المصل البقري (BSA ) في 0.2٪ PBST.
  2. احتضان المبايض مع 1X DIG-B عرقلة الحل ل2،5-4 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.
    ملاحظة: للحصول على ثلاثة أزواج من المبيض في أنبوب 1.5 مل، 200 ميكرولتر هو الحد الأدنى للحجم لحجب عينة وتلوين الأجسام المضادة.
  3. صب طاف واستبدالها مع حل 1X DIG-B حجب الطازجة التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية في diluti مناسباعلى النسبة. وصمة عار على المبايض لمدة 4 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.
    ملاحظة: للتجربة وصفها هنا، استخدام التخفيفات الأمثل التالية من الأجسام المضادة الأولية: (1) ApVas1 الأجسام المضادة: 1: 500 لتلطيخ مولد اللون، 01:50 لتلوين المناعي. (2) الأجسام المضادة لمكافحة α تويولين: 1: 500؛ (3) 4D9 وحيدة النسيلة الأجسام المضادة: 01:25.
  4. غسل المبايض مع 0.2٪ PBST 4 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  5. احتضان المبايض مع 1X DIG-B عرقلة الحل لمدة 1 ساعة على RT مع اهتزاز خفيف.
  6. صب طاف واستبدالها مع الطازجة 1X حل DIG-B حجب تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في نسبة التخفيف المناسبة. وصمة عار على المبايض لمدة 4 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.
    1. استخدام نسب التخفيف التالية من الأجسام المضادة الثانوية: (1) لتلوين المناعي: 1: 500 للاليكسا فلور 633 الماعز مفتش المضادة للأرنب أو فلور اليكسا 488 الماعز المضادة للمفتش الماوس. (2) لتلطيخ مولد اللون: 1: 200 للأغنام البيروكسيديز المضادة للأرنب مفتش.
      ملاحظة: يتم تطبيق الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز للتفاعل مع أفيدين-البيوتين المعقدة (ABC) في (مولد اللون) كشف القائم على الركيزة، التي يتم من خلالها تضخيم كبير إشارات تلطيخ.
    2. لتلوين المناعي، تنفيذ تلطيخ في الظلام لأن الأجسام المضادة الثانوية خفيفة حساسة.
  7. يغسل الأجسام المضادة الثانوية مع 0.2٪ PBST 4 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.

6. النووية وF-أكتين تلطيخ

ملاحظة: يطبق هذا فقط للتلوين المناعي.

  1. وصمة عار المبايض مع 0.2٪ PBST تحتوي على دابي (2 نانوغرام / ميكرولتر) وPhalloidin-TRITC (100 نيوتن متر) لمدة 2 ساعة على RT في الظلام.
  2. غسل المبايض مع 0.2٪ PBST 4 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
  3. احتضان المبايض مع تصاعد المتوسطة O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.

7. تنمية الإشارة

ملاحظة: يطبق هذا فقط لتلطيخ مولد اللون.

  1. إعداد 100 ميكرولتر منكاشف أفيدين-البيوتين مجمع (ABC) لتعزيز الإشارات بإضافة 1 ميكرولتر من كاشف A (أفيدين) في 98 ميكرولتر من 0.2٪ PBST، خلط دقيق عبر pipetting لطيف، وإضافة 1 ميكرولتر من الكاشف B (البيوتين مترافق مع الفجل البيروكسيداز )، تليها خلط فوري. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في RT مع اهتزاز خفيف.
  2. احتضان المبايض (بما في ذلك غرف البيض نأت) في خليط من الكواشف A و B لمدة 30 دقيقة في RT مع اهتزاز خفيف.
  3. يغسل مزيج من الكواشف A و B مع 0.2٪ PBST 4 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
  4. نقل المبايض غارقة في PBST إلى بئر على لوحة البقعة مع قطارة بلاستيكية.
  5. يعد حل ركيزة من 3،3'-Diaminobenzidine (DAB): حل قرص DAB واحد زائد واليوريا فوق أكسيد الهيدروجين آخر واحدة تحتوي في 1 مل من ده 2 O عبر vortexing لقوي لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: DAB، ركيزة عجل من الغلوثانيون، هو مولد اللون الشعبي لالمناعية. وتنتج رراسب الخاصة وغير قابلة للذوبان بعد التعرض للأكسدة التي الغلوثانيون. ويمكن تعزيز الإشارات الضعيفة عن طريق إضافة كلوريد النيكل في حل الركيزة (تركيز النهائي 0،05-0،08٪).
  6. إزالة حل PBST المتبقية في البئر وإعادة ملء مع 100 ميكرولتر من محلول DAB الركيزة للتنمية الإشارة.
  7. مراقبة كثافة الإشارات تحت المجهر ستيريو في التكبير المنخفض.
  8. وقف ردود الفعل عن طريق إزالة الحل DAB، تليها إعادة تعبئة مع 1X PBS على الفور. تكرار غسل مرتين.
  9. نقل المبيضين إلى أنبوب 1.5 مل ثم يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X PBST أو مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  10. احتضان المبايض في وسط القائمة على الجلسرين تركيب (70٪ الجلسرين) O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.

8. تركيب والمن الأجنة

ملاحظة: سمك الأجنة أولا بأول يتراوح بين مراحل التنمية. وبالتالي تعديل استراتيجيات التركيب لتناسب في وقت مبكر (germaria ومراحل 0-10)، منتصف (مراحل11-18)، وأواخر الأجنة (مراحل 19-20)، والتي أثبتت في الشكل 2B - D. وجاء انطلاق الجنينية ميورا وآخرون 12

  1. نقل المبيضين معا مع تصاعد المتوسطة إلى علبة الخلية مع قطارة بلاستيكية ومراقبة العينات تحت المجهر ستيريو في التكبير المنخفض.
  2. قطع الكؤوس المرتبطة قناة البيض الجانبية باستخدام دبابيس الحشرات ومن ثم نقل إلى ovariole معزولة إلى زجاج فارغة بشكل جيد مع قطارة. تشكل الحجم النهائي إلى 50-100 ميكرولتر باستخدام تصاعد المتوسط.
  3. نقل وovariole على الشريحة مع قطارة الزجاج ثم تشريح الدوائر البيض باستخدام دبابيس الحشرات.
    ملاحظة: للحصول على الأجنة أقدم من مرحلة 6 من التنمية، ويقترح فصل الدوائر البيض. لgermaria وأول مجلسين البيض الذين تقل أعمارهم عن المرحلة 6، والفصل هو اختياري.
  4. انتقال غرفة البيض تشريح لشريحة نظيفة باستخدام قطارة الزجاج.
  5. وضع ساترة (الحجم: 22 × 22مم) خلال germaria تشريح أو دوائر البيض (التي تحتوي على أجنة في مراحل 10/01 التنمية) ببطء لتجنب الفقاعات.
    1. غرف جبل البيض (التي تحتوي على أجنة في مراحل 18/11 للتنمية) على شريحة مع جانب واحد جسر ساترة ومكان آخر ساترة (الحجم: 18 × 18 ملم) على أعلى من العينة.
    2. غرف جبل البيض (التي تحتوي على أجنة مضى عليها أكثر من 19 مرحلة التنمية) على شريحة مع وجهين لجسر ساترة ومكان آخر ساترة (الحجم: 18 × 18 ملم) على أعلى من العينة.
  6. ملء الفراغ تحت ساترة أعلى مع وسائل الإعلام متزايدة لتجنب تجفيف العينة.
  7. لفة أقل ما يقال الجنين عن طريق تحريك ساترة للحصول على التوجه الصحيح للمراقبة.
  8. ختم حول حافة coverslips (بما في ذلك لل coverslips الجسر) بطلاء الأظافر.

تحليل 9. التصوير

  1. صورة النقيض تدخل الفرق (DIC) صور من جبل لالجامع الأجنة مع compouالثانية المجهر مجهزة البصريات DIC وعدسة موضوعية الجافة (10X، 20X، 40X) متصلة الكاميرا. تثبيت برنامج لنقل الصور بين الكاميرا والكمبيوتر باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.
  2. الحصول على التوقعات من الأجنة fluorescently المسمى مع ليزر مسح متحد البؤر المجهر 14. اتبع تعليمات الشركة الصانعة للتصوير، ض التراص، و3D إسقاط مع برامج التصوير.
    1. تحويل الشريحة رأسا على عقب، والعثور على عينة مزودة 10X الهدف، ودائرة منطقة العينة مع غرامة القلم استنادا يتأهل.
      ملاحظة: وهذا يجعل تحديد العينة أسهل عند البحث عنه من خلال أهداف المجهر متحد البؤر.
    2. إضافة قطرة من الزيت على الجزء العلوي من منطقة ساترة الذي هو المسمى كما هو موضح في 9.2.1 الجانب المعاكس.
  3. العثور على طائرة الوصل في 40X الهدف النفط الغمر ثم تتغير إلى هدف النفط الغمر 63X. نقل يدويا تركيز الرقابة الدقيقة والقيامسفل لالتقاط أفضل البؤري.
    ملاحظة: للحصول على ملاحظة التفاصيل الهيكلية للgermaria والأجنة في وقت مبكر، نقترح استخدام 40X الأهداف أو الذين لديهم أعلى التكبير.
  4. مسح الجنين في قنوات الإثارة المختلفة والحصول على صورة ض المكدس.
    ملاحظة: للحصول على أنسجة أولا بأول البازلاء، والحد من سماكة كل قسم البصرية وصولا الى 1.5 ميكرون أو أقل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، أجرينا كله جبل المناعية على الأجنة من المن البازلاء اللاجنسي (الشكل 1A). هذه الإناث تنتج ذرية parthenogenetically وviviparously. هذه الأجنة الإناث تتطور داخل غرف البيض من الأنابيب المبيض (ovarioles) (1B الشكل والشكل 2A). قبل المجهري، وovarioles تشريح هي الأهداف تلطيخ. ومع ذلك، لا بد من الفصل بين البيض غرف للمراقبة الأجنة تحت المجهر (الشكل 2B - D). <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حددنا الظروف المثلى حاسمة لنجاح المناعية في البازلاء المن A. pisum، وهو الناشئة كائن نموذج للدراسات الجينية والتنموية 3،15. الظروف الأمثل لزيادة نفاذية الأنسجة وتقليل تلوين الخلفية عززت كثافة ونوعية الإشارات. وهي تختلف عن البروتوكولات القياسية لالمناعية في النماذج الحيوانية الأخرى في خطوات إنشاء المسام في أغشية الخلايا ومنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة.

لالمناعية والتهجين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون ل Chau-Ti Ting (Fly Core في تايوان) لتوفير الجسم المضاد أحادي النسيلة 4D9 ، و Technology Commons (TechComm) من كلية علوم الحياة NTU للفحص المجهري متحد البؤر ، و Hsiao-Ling Lu لتدقيق المخطوطة ، و Chen-yo Chung للمساعدة في التصوير. تشكر CC بشكل خاص Charles E. Cook على تقديم اقتراحات استراتيجية والتحرير النقدي للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا (101-2313-B-002-059-MY3 و 104-2313-B-002-022-MY3 ل GWL و CC) ، وجامعة تايوان الوطنية (NTU-CESRP 101R4602D3 ل CC ؛ 103R4000 ل GWL).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
30٪ بيركسيديز الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub>)Sigma-Aldrich18304لتبييض البيروكسيديز الداخلي للأجنة.
4 ' 6-دياميدينو-2-فينيل-إندول ثنائي هيدروكلوريد (DAPI)Sigma-AldrichD9542لوضع العلامات على الحمض النووي مزدوج الخيط. سام. ارتد القفازات ، وقم بالتوزيع على حصص صغيرة وقم بتقليل التعرض
4D9 للجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المضاد / المحتجزالتنموية بنك الورم الهجينAB_528224لوضع العلامات على الأجزاء النامية من الجنين.
ApVas1 أجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانبمختبرناN / Aلوضع العلامات على بروتين Vas1 الخاص بالسلالة الجرثومية في الأجنة. تم صنع هذا الجسم المضاد من قبل مختبرنا.
دبابيس الحشرات AusterlitzENTOMORAVIAN / Aلفصل كل غرف بيضة عن المبيض. الحجم 000 ، مطلي بالمينا الأسود. 
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتش9048-46-8لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة.
الكاميرا مرتبطة بالمجهر المركبCanonEOS 5Dلتصوير أجنة المن.
صينية Colorimetric 8 خلاياKartell Labware357لتطوير إشارة تلطيخ أجنة المن. القطر 95 × 57 مم ، عمق الخلية 2 مم.
مجهر مركب مع بصريات DICLeica MicrosystemsDMRلتصوير جنين المن المثبت على الشرائح.
مجموعة DIG Wash and Block BufferSet Sigma-Aldrich (Roche)11585762001لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة. قمنا بتخفيف محلول الحجب 10x إلى 1x ككاشف حظر.
ملقطIdeal-tekN / Aلتشريح المبايض من حشرات المن. الجزء الصانع رقم 5: 5 SA. 
قطارة زجاجيةN / AN / Aلنقل مبيض حشرات المن من لوحة الشقيق إلى الأنابيب. 150 مم من الطول الإجمالي و 5 3/4 بوصة من طول الطرف.
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516لإزالة أجنة المن وتركيبها.
GlycineBioshopN / Aلمنع نشاط إنزيم البروتيناز K (PK).
الماعز المضاد للفأر IgG مترافق Alexa Fluor 488InvitrogenA11017للكشف عن الأجسام المضادة الأولية من الفأر.
الماعز المضاد للأرانب IgG مترافق Alexa Fluor 633InvitrogenA21072للكشف عن الأجسام المضادة الأولية من الأرانب.
خلاط IntelliELMI معدات المختبرRM-2Mلتحسين التفاعل الشامل للكواشف مع المبايض.
الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزرLeica MicrosystemsSP5لتصوير جنين المن المثبت على الشرائح بعلامة florecent
الميثانول بورديك وجاكسونAH2304لتبييض البيروكسيديز الداخلي للأجنة.
شرائح المجهر علمية حراريةلتركيب الأجنة. حواف أرضية SUPERFROST ، ca. / env. 76 × 26 ملم.
غطاء المجهر نظاراتMarienfeld0101030لتركيب الأجنة على الشرائح. الحجم 18 × 18 مم السماكة رقم 1 (0.13 إلى 0.16 مم)
غطاء المجهر نظاراتMarienfeld0101050لتركيب الأجنة على الشرائح. الحجم 22 × 22 مم. السماكة رقم 1 (0.13 إلى 0.16 مم)
الفأر أحادي النسيلة المضاد لألفا توبولين (DM1A)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-32293لوضع العلامات على توزيع ألفا توبولين للخلايا.
طلاء الأظافرN / AN / Aلإغلاق الأغطية على الشرائح.
مصل الماعز العادي (NGS)سيجما ألدريتشG9023لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة.
بارافورمالدهيد (PFA)VWRMK262159لتثبيت مبيض المن.
Phalloidin-TRITCSigma-AldrichP1951لوضع العلامات على توزيع F-actin على الأجنة.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)N / AN / Aكمحلول متساوي التوتر لمبايض المن.
قطارة بلاستيكيةN / AN / Aلنقل مبيض حشرات المن من أنبوب إلى صينية خلية. مقاس 3 مل. 
Proteinase KMerck124678لإنشاء مسام (تثقيب) على غشاء الخلية وتسهيل وصول الأجسام المضادة.
لوحة بقعة بيركسN / AN / Aلتشريح وتفاعلات اللون لمبايض المن تحت الفحص المجهري. كل تجويف بقطر 22 مم و   ؛ العمق 7 مم.
أقراص SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidine (DAB)  Sigma-AldrichD4168لتطوير الإشارات المركيزة. وتسمى أيضا مجموعة أقراص الركيزة DAB بيروكسيداز.
مجهر ستيريوLeica MicrosystemsEZ4لتشريح ومراقبة مبيض المن.
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787لإنشاء المسام (التثقيب) على غشاء الخلية.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)VectorPK-6101لتحسين الإشارة. بما في ذلك الأجسام المضادة الثانوية IgG للماعز المضادة للأرانب البيوتوتينيل والكواشف A و B.
VECTASHIELD تركيب متوسطمختبرات VectorH1000لإزالة أجنة المن وتركيبها.
دراسات 10143560 مختبرات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blackman, R. L. Reproduction, cytogenetics and development. Aphids: their biology, natural enemies. Minks, A. K., Harrewijn, P. , Elsevier Press. Amsterdam. 163-195 (1987).
  2. Davis, G. K. Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties. J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).
  3. The International Aphid Genomics Consortium. Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biol. 8 (2), e1000313(2010).
  4. Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).
  5. Chang, C., et al. Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)). Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).
  6. Chang, C., et al. Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility. Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).
  7. Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis. Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).
  8. Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Sci. 6, 38(2006).
  9. Jaubert-Possamai, S., et al. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC Biotechnol. 7, 63(2007).
  10. Sapountzis, P., et al. New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments. Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).
  11. Braendle, C., et al. Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis. PLoS Biol. 1 (1), e21(2003).
  12. Miura, T., et al. A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea). J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).
  13. Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers. Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).
  14. Koshy, A. A., Cabral, C. M. 3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237(2014).
  15. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).
  16. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  17. Harland, R. M. In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  18. Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).
  19. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23 (4), 345-358 (2001).
  20. Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum. Evodevo. 5, 18(2014).
  21. Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures. J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

K DIG

مقالات ذات صلة