تحديد الظروف الحرجة لالمناعية في البازلاء المن الأجنة: زيادة نفاذية الأنسجة وتقليل خلفية تلطيخ

ملخص

يتم تقديم بروتوكول للتلوين المناعي الكامل على أجنة المن ، حيث يتم معالجة الظروف الحرجة لتقليل تلطيخ الخلفية وزيادة نفاذية الأنسجة. تم تطوير هذه الشروط خصيصا للكشف الفعال عن التعبير البروتيني في الأنسجة الجنينية لحشرات المن.

الملخص

وAcyrthosiphon pisum البازلاء أولا بأول، مع تسلسل الجينوم واللدونة المظهرية وفيرة، وأصبحت نموذجا الناشئة للدراسات الجينية والتنموية. مثل المن أخرى، A. pisum نشر بسرعة عن طريق الاستنساخ لود عذري، حيث تطور الأجنة داخل غرف البيض بطريقة خط التجميع في ovariole. سابقا أنشأنا منصة قوية من جبل لالجامع في الموقع التهجين السماح الكشف عن التعبير مرنا في الأجنة أولا بأول. لتحليل التعبير من البروتين، على الرغم من إنشاء بروتوكولات لالمناعية للovarioles من المن لود اللاجنسي لم تسفر عن نتائج مرضية. نحن هنا تقرير الظروف الأمثل لزيادة نفاذية الأنسجة وتقليل تلوين الخلفية، سواء التي كانت مشاكل عند تطبيق النهج المعمول بها. وتشمل التحسينات: (1) حضانة بروتين K (1 ميكروغرام / مل، 10 دقيقة)، الذي عثر عليه و الأساسيةأو اختراق الأجسام المضادة في الأجنة المتوسطة والمرحلة المتأخرة أولا بأول. (2) استبدال العادي مصل الماعز / البقري ألبومين المصل مع كاشف الحجب توفيره من قبل Digoxigenin (DIG) المستندة العازلة مجموعة و(3) تطبيق الميثانول بدلا بيروكسيد الهيدروجين (H _{2 O 2)} لتبيض البيروكسيداز الذاتية. مما ادى الى تراجع كبير في تلوين الخلفية في الأنسجة أولا بأول. وهذه الظروف الحرجة الأمثل لالمناعية السماح الكشف الفعال للمنتجات الجينات في الأجنة من A. pisum والمن أخرى.

المقدمة

المن والحشرات hemipteran مع (1-10 ملم) هيئات صغيرة ناعمة. تتغذى على النباتات التي تمتص عصارة اللحاء مع فمها خارقة. بالإضافة إلى ذلك، فهي تعتمد على البكتيريا endosymbiotic تلزم، Buchnera aphidicola، لتجميع الأحماض الأمينية الأساسية التي تعاني من نقص في الغذاء عصارة اللحاء. المن لها تاريخ حياة معقد يتضمن الاستنساخ لود عذري خلال فصلي الربيع والصيف الضوئية يوم طويل والاستنساخ بياض الجنسي سببها الضوئية قصيرة اليوم تم خلاله وضع عدد محدود من البيات الشتوي البيض ^1،2. في ربيع هذه يفقس البيض لإنتاج الجيل الأول من كل الإناث المن (fundatrices)، وبعد عدة جولات من الاستنساخ عذري حتى الخريف. والتوالد العذ....

البروتوكول

1. ثقافة المن

جمعت سلالة مختبر عذري لود البازلاء المن A pisum أصلا في وسط تايوان، وقد تربى على النباتات المضيفة (وبيسوم حديقة البازلاء Pisum أو الفول الفول الفول) تحت الضوئية يوم طويل لأكثر من 300 أجيال: ملاحظة. (جيل واحد: ~ 10 يوما).

1. إنبات بذور
   1. نقع بذور النباتات العائلة فى ماء الصنبور لمدة 3-5 أيام في RT. إعادة ملء مع المياه العذبة مرة واحدة يوميا.
      ملا....

النتائج

في هذه الدراسة، أجرينا كله جبل المناعية على الأجنة من المن البازلاء اللاجنسي (الشكل 1A). هذه الإناث تنتج ذرية parthenogenetically وviviparously. هذه الأجنة الإناث تتطور داخل غرف البيض من الأنابيب المبيض (ovarioles) (1B الشكل والشكل 2A). قبل المجهري، وovarioles تشريح هي الأهداف تلطيخ. ومع ذلك، لا بد من الفصل بين البيض غرف للمراقبة الأجنة تحت المجهر (الشكل 2B - D). <.......

المناقشة

حددنا الظروف المثلى حاسمة لنجاح المناعية في البازلاء المن A. pisum، وهو الناشئة كائن نموذج للدراسات الجينية والتنموية ^3،15. الظروف الأمثل لزيادة نفاذية الأنسجة وتقليل تلوين الخلفية عززت كثافة ونوعية الإشارات. وهي تختلف عن البروتوكولات القياسية لالمناعية في النماذج الحيوانية الأخرى في خطوات إنشاء المسام في أغشية الخلايا ومنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة.

لالمناعية والتهجين .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
30٪ بيركسيديز الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub>)	Sigma-Aldrich	18304	لتبييض البيروكسيديز الداخلي للأجنة.
4 ' 6-دياميدينو-2-فينيل-إندول ثنائي هيدروكلوريد (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	لوضع العلامات على الحمض النووي مزدوج الخيط. سام. ارتد القفازات ، وقم بالتوزيع على حصص صغيرة وقم بتقليل التعرض
4D9 للجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المضاد / المحتجز	التنموية بنك الورم الهجين	AB_528224	لوضع العلامات على الأجزاء النامية من الجنين.
ApVas1 أجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانب	مختبرنا	N / A	لوضع العلامات على بروتين Vas1 الخاص بالسلالة الجرثومية في الأجنة. تم صنع هذا الجسم المضاد من قبل مختبرنا.
دبابيس الحشرات Austerlitz	ENTOMORAVIA	N / A	لفصل كل غرف بيضة عن المبيض. الحجم 000 ، مطلي بالمينا الأسود.
ألبومين مصل الأبقار (BSA)	سيجما ألدريتش	9048-46-8	لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة.
الكاميرا مرتبطة بالمجهر المركب	Canon	EOS 5D	لتصوير أجنة المن.
صينية Colorimetric 8 خلايا	Kartell Labware	357	لتطوير إشارة تلطيخ أجنة المن. القطر 95 × 57 مم ، عمق الخلية 2 مم.
مجهر مركب مع بصريات DIC	Leica Microsystems	DMR	لتصوير جنين المن المثبت على الشرائح.
مجموعة DIG Wash and Block Buffer	Set Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة. قمنا بتخفيف محلول الحجب 10x إلى 1x ككاشف حظر.
ملقط	Ideal-tek	N / A	لتشريح المبايض من حشرات المن. الجزء الصانع رقم 5: 5 SA.
قطارة زجاجية	N / A	N / A	لنقل مبيض حشرات المن من لوحة الشقيق إلى الأنابيب. 150 مم من الطول الإجمالي و 5 3/4 بوصة من طول الطرف.
الجلسرين	سيجما ألدريتش	G5516	لإزالة أجنة المن وتركيبها.
Glycine	Bioshop	N / A	لمنع نشاط إنزيم البروتيناز K (PK).
الماعز المضاد للفأر IgG مترافق Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	للكشف عن الأجسام المضادة الأولية من الفأر.
الماعز المضاد للأرانب IgG مترافق Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	للكشف عن الأجسام المضادة الأولية من الأرانب.
خلاط Intelli	ELMI معدات المختبر	RM-2M	لتحسين التفاعل الشامل للكواشف مع المبايض.
الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر	Leica Microsystems	SP5	لتصوير جنين المن المثبت على الشرائح بعلامة florecent
الميثانول	بورديك وجاكسون	AH2304	لتبييض البيروكسيديز الداخلي للأجنة.
شرائح المجهر	علمية حرارية		لتركيب الأجنة. حواف أرضية SUPERFROST ، ca. / env. 76 × 26 ملم.
غطاء المجهر نظارات	Marienfeld	0101030	لتركيب الأجنة على الشرائح. الحجم 18 × 18 مم السماكة رقم 1 (0.13 إلى 0.16 مم)
غطاء المجهر نظارات	Marienfeld	0101050	لتركيب الأجنة على الشرائح. الحجم 22 × 22 مم. السماكة رقم 1 (0.13 إلى 0.16 مم)
الفأر أحادي النسيلة المضاد لألفا توبولين (DM1A)	سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية	sc-32293	لوضع العلامات على توزيع ألفا توبولين للخلايا.
طلاء الأظافر	N / A	N / A	لإغلاق الأغطية على الشرائح.
مصل الماعز العادي (NGS)	سيجما ألدريتش	G9023	لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة.
بارافورمالدهيد (PFA)	VWR	MK262159	لتثبيت مبيض المن.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	لوضع العلامات على توزيع F-actin على الأجنة.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	N / A	N / A	كمحلول متساوي التوتر لمبايض المن.
قطارة بلاستيكية	N / A	N / A	لنقل مبيض حشرات المن من أنبوب إلى صينية خلية. مقاس 3 مل.
Proteinase K	Merck	124678	لإنشاء مسام (تثقيب) على غشاء الخلية وتسهيل وصول الأجسام المضادة.
لوحة بقعة بيركس	N / A	N / A	لتشريح وتفاعلات اللون لمبايض المن تحت الفحص المجهري. كل تجويف بقطر 22 مم و   ؛ العمق 7 مم.
أقراص SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D4168	لتطوير الإشارات المركيزة. وتسمى أيضا مجموعة أقراص الركيزة DAB بيروكسيداز.
مجهر ستيريو	Leica Microsystems	EZ4	لتشريح ومراقبة مبيض المن.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	لإنشاء المسام (التثقيب) على غشاء الخلية.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector	PK-6101	لتحسين الإشارة. بما في ذلك الأجسام المضادة الثانوية IgG للماعز المضادة للأرانب البيوتوتينيل والكواشف A و B.
VECTASHIELD تركيب متوسط	مختبرات Vector	H1000	لإزالة أجنة المن وتركيبها.

دراسات 10143560 مختبرات