مقالة منهجية

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

DOI:

10.3791/53909

⸱

مارس 27, 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفكيك نوى فيروس الأنفلونزا A أثناء دخول الفيروس إلى الخلايا المضيفة هي عملية متعددة الخطوات. نصف طريقة في المختبر لتحليل المراحل المبكرة من الطلاء الفيروسي. في هذا النهج ، يتم استخدام الطرد المركزي لتدرج السرعة لتشريح الخطوات التي تبدأ في فك الطلاء كيميائيا حيويا في ظل ظروف محددة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تتحكم العمليات الجزيئية التي يسببها الحمض عن كثب في دخول الخلايا للعديد من الفيروسات التي تدخل عبر نظام الخليات الداخلية. في حالة فيروس الأنفلونزا A (IAV) ، فإن اندماج الفيروس مع الغشاء الداخلي وكذلك التفكيك اللاحق للقفيصة الفيروسية ، المسمى فك الطلاء ، يحكمه الظروف الأيونية داخل الحويصلات الداخلية. يصعب دراسة الخطوات المبكرة في دورة حياة الفيروس لأنه لا يمكن الوصول إلى الجسيمات الداخلية مباشرة تجريبيا ، مما يخلق الحاجة إلى نهج في المختبر. هنا ، نصف طريقة تعتمد على الطرد المركزي لتدرج السرعة للفيريونات المنقاة من خلال تدرج الجلسرين من طبقتين ، والذي يتيح تحليل قلب IAV واستقراره. يحتوي التدرج على منظف غير أيوني (NP-40) في طبقته السفلية لإزالة الغشاء الفيروسي عن طريق الذوبان حيث يترسب الفيروس نحو القاع. عند درجة الحموضة المحايدة ، يتم تكوير النوى الفيروسية كهياكل مستقرة. يمكن تحديد المكونات الأساسية الرئيسية ، بروتين المصفوفة (M1) والبروتينات النووية الريفية الفيروسية (vRNPs) ، بوضوح في جزء الحبيبات بواسطة SDS-PAGE. يؤدي خفض الرقم الهيدروجيني إلى 6.0 أو أقل في الطبقة السفلية إلى إزالة M1 بشكل انتقائي من الحبيبات متبوعا بإطلاق vRNPs في ظروف أكثر حمضية. يمكن أن تخضع نطاقات البروتين الفيروسي على المواد الهلامية الملطخة ب Coomasie لقياس الكثافة لمراقبة الحالات الوسيطة لتفكيك IAV. إلى جانب الأس الهيدروجيني ، يمكن تقييم العوامل الأخرى التي تؤثر على استقرار اللب الفيروسي ، مثل تركيز الملح وعوامل فك الطلاء الفيروسية المفترضة ، ببساطة عن طريق تعديل طبقة الجلسرين المحتوية على المنظفات وفقا لذلك. مجتمعة ، تسمح التقنية المقدمة بتحليل كمي وقابل للتكرار بدرجة كبيرة لإزالة الطلاء الفيروسي في المختبر. يمكن تطبيقه على الفيروسات المغلفة الأخرى التي تخضع لعمليات فك المغلفة المعقدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس الانفلونزا (IAV) هو فيروس يلفها وينتمي إلى عائلة فيروسات مخاطية قويمة. يتم ترميز جيناته على مجزأة، السلبي، بمعنى واحد الذين تقطعت بهم السبل جينوم الحمض النووي الريبي. في البشر، IAV يسبب التهابات الجهاز التنفسي، والتي تحدث في تفشي وباء الموسمية ويحمل احتمالات الأوبئة العالمية 1. على الربط إلى بقايا حمض اللعابي على سطح الخلية المضيفة 2، والمنضوية IAV بواسطة الإلتقام تعتمد على بالكلاذرين ومسارات مستقلة بالكلاذرين 3-8. الوسط الحمضي (درجة الحموضة <5.5) في فجوات التقامي يتسبب في تغيير متعلق بتكوين رئيسيا في IAV ارتفاع بروتين سكري هيماغلوتينين (HA)، مما يؤدي إلى انصهار الفيروسية والراحل endosomal غشاء 9. مرة واحدة قفيصة IAV (كما يشار إليها هنا ب "الأساسية" الفيروسي) قد فر من الإندوسومات أواخر (ليه)، وغير المصقول في العصارة الخلوية تليها النقل من ribonucleoproteins الفيروسية (vRNPs) في نواة - موقع ستكاثر الفيروس و والنسخ 10-13. قبل تفعيل حمض HA الفيروس يواجه انخفاض تدريجي في درجة الحموضة في النظام التقامي، الذي يعبي الأساسية للتفكك اللاحق 14-16. في هذا "فتيلة" خطوة القنوات الأيونية M2 في الغشاء الفيروسي توسط في تدفق البروتونات وK +10،14،16. التغير في تركيز الأيونية في الداخل فيروس يزعج التفاعلات تراكم من البروتين مصفوفة الفيروسي M1 وحزمة vRNP ثمانية، ويسهل IAV uncoating في السيتوبلازم التالية الغشاء الانصهار 10،14-17.

وقد أعاق تحليل مباشر والكمي للخطوة فتيلة من حقيقة أن الإندوسومات يصعب الوصول تجريبيا. كانت عملية الإدخال، وعلاوة على ذلك، إلى حد كبير غير متزامن. وبالإضافة إلى ذلك، المقايسات نقطة النهاية، مثل QRT-PCR RNA من القياسات أو العدوى الفيروسية المفرج عنهم، لا تقدم صورة تفصيلية عن الحالة البيوكيميائية للcapsi الفيروسيةد في أي خطوة معينة من الدخول. في حين اضطراب الإندوسومات من سيرنا أو العلاج من تعاطي المخدرات ساهم بشكل كبير في فهم دخول IAV 18-20، صقل صعب وعرضة لآثار جانبية غير محددة في برنامج الاندوسوم النضج لرقابة مشددة.

لتجنب هذه المشاكل، ونحن تكيفت لفي المختبر بروتوكول سبق وضعها على أساس استخدام سرعة التدرج الطرد المركزي 17. وعلى النقيض من المحاولات الأخرى 21،22، 23،24، التي استندت في معظمها على مزيج من انشقاق بروتين والعلاج المنظفات تليها تحليل EM، مكن هذا النهج نتيجة قابلة للقياس بسهولة. الطرد المركزي من خلال طبقات متدرجة مختلفة يسمح الجسيمات المترسبة إلى أن تتعرض لوتتفاعل مع الظروف المتغيرة في الطريقة التي تسيطر عليها. في بروتوكول المعروضة، IAV المستمدة من السوائل السقاء توضيح أو الجسيمات الفيروسية النقاء والرسوبية إلى الجلسرين من طبقتينالتدرج التي تحتوي الطبقة السفلى المنظفات غير الأيونية NP-40 (الشكل 1). كما يدخل الفيروس الثانية، طبقة التي تحتوي على مواد التنظيف، وبالفاعلات والفيروسية المغلف الدهون والبروتينات السكرية المغلف بلطف وتركت وراءها. جوهر، ويتألف من vRNP حزمة ثمانية ومحاطة بطبقة مصفوفة والرواسب بمثابة هيكل مستقر في جزء بيليه. البروتينات الأساسية الفيروسية، مثل M1 والبروتين النووي المرتبطة vRNP (NP)، يمكن تحديدها في بيليه بواسطة SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ. على وجه الخصوص، والاستفادة من المواد الهلامية التدرج المتاحة تجاريا وتلطيخ مع الغروية حساسة للغاية Coomassie 25، وتمكن عالية الدقة وكشف حتى كميات صغيرة من البروتينات المرتبطة الأساسية الفيروسية.

هذا يضع أساسا لاختبار ما إذا كانت الظروف مختلفة مثل درجة الحموضة، تركيز الملح، والعوامل uncoating المفترضة لها آثار على سلوك الترسيب من المكونات الأساسية وSTABIL الأساسية إيتي. لتحقيق هذا الهدف، يتم تعديل فقط، الطبقة السفلى التي تحتوي على مواد التنظيف في التدرج الجلسرين عن طريق إدخال عامل أو شرط من الفائدة. وكانت هذه التقنية قيمة خاصة في التحقيق في تأثير القيم الرقم الهيدروجيني وتركيز الملح مختلفة على سلامة جوهر IAV 16. يمكن رصد الخطوات الوسيطة من IAV uncoating بما في ذلك تفكك طبقة المصفوفة في درجة الحموضة الحمضية أقل ما يقال (<6.5)، يليه vRNP التفكك في الرقم الهيدروجيني 5.5 وانخفاض 16،17 (الشكل 1). وتعززت الخطوة الأخيرة أبعد من ذلك وجود ارتفاع K + التركيز في طبقة الجلسرين، والتي تعكس بيئة التقامي أواخر 16. وبالتالي، بأنه الفيروس وجوهر الرسوبية من خلال التدرج أنها شهدت بيئة المتغيرة التي يحاكي الظروف في الإندوسومات. وكانت النتيجة التفكيك التدريجي للالأساسية الفيروسي في المختبر، واستكمال النتائج المستمدة من المقايسات بيولوجيا الخلية.

ر "> وقد مكن الطريقة المعروضة هنا سريع وتحليل تكرار للغاية من IAV (X31) و (A / WSN / 33) وIBV (B / لي / 40) uncoating الناجمة عن الحامضية وزيادة K +16،17 فضلا عن التفكيك من النوى الفيروسة المخاطانية على قلوية درجة الحموضة تعرض 17. فمن المتصور أن النهج يمكن أن تتكيف مع الفيروسات يلفها أخرى لاكتساب نظرة ثاقبة الخصائص الكيميائية الحيوية للهيكل قفيصة الفيروسية والتفكيك القفيصة أثناء دخول الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول المالية

  1. إعداد العازلة MNT (20 ملي زارة التربية والعلم، 30 ملي تريس و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم) عن طريق إذابة 470 ملغ تريس هيدروكلوريد، 390 ملغ MES هيدرات و 580 ملغ كلوريد الصوديوم في 80 مل ده 2 O. ضبط المخزن المؤقت إلى 7.4 درجة الحموضة وإحضاره إلى الحجم النهائي من 100 مل مع DDH 2 O.
  2. إعداد ثلاثة حلول متطابقة من 500 عازلة ملي زارة التربية والعلم عن طريق إذابة 9.76 ز MES هيدرات في 80 مل O 2 درهم لكل منهما. ضبط مخازن لدرجة الحموضة 5.8، 5.4، و 5.0، على التوالي، من خلال المعايرة مع تركيز هيدروكسيد الصوديوم. جلب كل المخزن المؤقت إلى الحجم النهائي من 100 مل مع DH 2 O.
  3. إعداد حلين متطابقة من 500 عازلة ملي تريس عن طريق إذابة 7.88 ز تريس هيدروكلوريد في 80 مل O 2 درهم لكل وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 و 6.4، على التوالي، من خلال المعايرة مع المركز HCI. جلب المخزن المؤقت إلى الحجم النهائي من 100 مل مع DH 2 O.
  4. تجهيز 50٪ من محلول الجلسرين في DH 2 O ويقلب جيدا حتى glycإيرول هو مختلط متجانس. تصفية حل من خلال وحدة تصفية Steritop (0.22 حجم ميكرون المسام) في زجاجة.
  5. إعداد 10٪ NP-40 حل و 1 M كلوريد الصوديوم في DH 2 O.
  6. إعداد 25X تتركز مثبط البروتياز عن طريق إذابة قرصين في 4 مل ده 2 O.

2. إعداد الجلسرين التدرجات

  1. إعداد 5 مل المنظفات مزيج عازلة الرئيسي (300 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2٪ NP-40، وتتركز 2X مثبط البروتياز) الحل لكل حالة الحموضة إلى اختبار (الرقم الهيدروجيني 7.4، 6.4، 5.8، 5.4، و 5.0). لهذا الغرض، خلط 9 مل من 1 M كلوريد الصوديوم، 6 مل من 10٪ NP-40، و 2.4 مل من الأسهم المانع 25X الأنزيم البروتيني، و 9 مل ده 2 0.
  2. لكل حالة الماصة درجة الحموضة 4.4 مل من مزيج الرئيسي إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  3. للحصول على قيم درجة الحموضة فوق 5.8 إضافة 0.6 مل للتعديل درجة الحموضة حل 500 سهم ملي تريس منها إلى الأنبوب. الرقم الهيدروجيني 5.8 وأقل إضافة 0.6 مل من 500 ملي زارة التربية والعلم محلول المخزون منها، تعديل درجة الحموضة.
  4. جعل 5مل من محلول العازلة التي تحتوي على 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2X مثبط البروتياز، 60 ملي تريس تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 و ده 2 O. وهذا سيكون بمثابة المخزن المؤقت وحة التحكم في التدرج خالية من المنظفات.
  5. إذا لزم الأمر، ودفع غرامة ضبط درجة الحموضة من الحلول لدرجة الحموضة 7.4، 6.4، 5.8، 5.4، و 5.0 عن طريق إضافة تتركز HCI أو هيدروكسيد الصوديوم الحلول، على التوالي.
  6. إضافة 5 مل من الأسهم الجلسرين 50٪ إلى 5 مل من خليط العازلة التي تحتوي على مواد التنظيف وخالية من المنظفات مما أسفر عن ستة مختلفة حلول الجلسرين 25٪. تحقق من قيم الرقم الهيدروجيني باستخدام شرائط مؤشر الرقم الهيدروجيني.
    ملاحظة: في حالة تختلف درجة الحموضة قياسها بشكل كبير من القيمة المطلوبة، ينبغي إعداد الحلول منها مرة أخرى.
  7. إعداد 15٪ من محلول الجلسرين عن طريق خلط 50٪ الأسهم الجلسرين مع DH 2 O في نسبة 3: 7.

3. تنبيذ فائق من IAV

  1. إضافة 3 مل 15٪ الحل الجلسرين في أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوح (13.2 مل، 14 ملم × 89 ملم) باستخدام حقنة 5 مل ونيDLE (21 G، 9 سم). لا تترك قطرات في الجدار الداخلي للأنبوب لأن ذلك قد يزعج سلامة التدرج. كرر هذا ليصبح المجموع ستة أنابيب الطرد المركزي، واحدة لكل من ظروف الأس الهيدروجيني خمسة لاختبار واحد للعينة السيطرة.
  2. وضع بعناية 3.4 مل 25٪ الحل الجلسرين تحت طبقة الجلسرين 15٪ باستخدام حقنة مل 5 و إبرة طويلة. الحرص على عدم خلط طبقتين. كرر هذا لجميع الشروط الستة لاختبار مع الحلول الجلسرين كل المعدلة درجة الحموضة.
    ملاحظة: العمل في الدرجة الثانية الوزراء للسلامة الأحيائية للخطوات التالية.
  3. تراكب بلطف التدرجات الجلسرين مع 30 ميكرولتر أوضح السوائل السقاء تحتوي على IAV (X31، H3N2) المخفف في 1 مل العازلة MNT (يناظر حوالي 20-30 ميكروغرام من البروتين الكلي الفيروسي) لكل التدرج.
  4. التوازن معارضة الأنابيب ووضعها في تنبيذ فائق الدوار SW41. الطرد المركزي لمدة 150 دقيقة، في 55000 x ج، و 12 درجة مئوية.
  5. بعد الطرد المركزي، بعنايةإزالة طاف، أي كل من طبقات الجلسرين باستخدام ماصة باستور نظيفة والشافطة. Resuspend وبيليه في 40 ميكرولتر (1X) غير الحد عينة العازلة LDS. ومن المهم أن الماصة صعودا وهبوطا عدة مرات بحل بيليه تماما. نقل العينة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.

4. SDS-PAGE من بيليه الكسور وCoomassie تلطيخ

  1. حرارة جميع العينات في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. عند هذه النقطة يمكن أن يتم تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى يتم تحليلها بواسطة SDS-PAGE.
  2. تحميل 20 ميكرولتر من الكريات المنحل على التدرج مسبقة الصب (4-12٪) مكرر تريس هلام صغيرة وتشغيل لمدة 1 ساعة على 200 V في 1X اجتماعات الأطراف SDS العازلة على التوالي.
  3. جعل حل التثبيت مع 40٪ الميثانول وحمض الخليك 10٪ الجليدية في ده 2 O.
  4. احتضان الجل في حل التثبيت لمدة 1 ساعة وصمة عار بين عشية وضحاها في 15 سم طبق ثقافة الخلية مع حجم كاف من الغروية حل Coomassie بينما بلطفاهتزاز في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: من المهم لإغلاق طبق من أجل تجنب التبخر من الحل تلطيخ.
  5. يزيل اللون هلام في ده 2 O. استبدال ده 2 O كل 15-20 دقيقة حتى يصبح خلفية جل واضحة. تخزين هلام في ده 2 O في 4 درجات مئوية حتى يتم مسحها لتقدير الفرقة.
  6. مسح هلام بدقة عالية واستخدام البرامج المتاحة أو حسب الطلب تجاريا لتقدير من شدة الفرقة البروتين. طرح إشارة الخلفية من منطقة قريبة من العصابات منها وتطبيع هذه القيم لعينات سيطرة خالية من المنظفات (في درجة الحموضة 7.4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما سبق ذكره، مطلوب فتيلة في الإندوسومات لتقديم الأساسية IAV uncoating المختصة. بروتوناتيون من جوهر يضعف تفاعل M1 وvRNPs (تتكون من الحمض النووي الريبي الفيروسي، NP، والبلمرة PB1 معقد / PB2 / PA). يبدأ هذه العملية عندما يتعرض فيروس الواردة إلى الرقم الهيدروجيني من 6.5 (أو أقل) في الإندوسومات في وقت مبكر (إي إي إس) وتستمر حتى الصمامات الفيروس في جميع أنحاء درجة الحموضة 5.0 في ليه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

capsids الفيروسية المجمعات الجزيئات متبدل الاستقرار. في حين تجميع virions يتطلب encapsidation والتكثيف من الجينوم فيروس، بدء الجولة القادمة من عدوى يعتمد على تفكيك هذه البنية القفيصة المضغوط. وقد تطورت الفيروسات لاستغلال الآليات الخلوية المختلفة للسيطرة على دورة طلاء uncoating، بما في ذلك المستقبلات الخلوية، مرافقين، والإنزيمات المحللة للبروتين، القوى الفيزيائية التي تقدمها البروتينات الحركية أو helicases وكذلك درجة الحموضة ومفاتيح الأيونية 26،27. هنا، نحن تصف نهجا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر يوهي ياموتشي وروبرتا مانشيني لتزويدنا الكواشف. وأيد المختبر ه من قبل ماري كوري شبكة التكوين الأولي (آي تي)، والمجلس الأوروبي للبحوث (ERC)، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (SINERGIA).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
cOmplete™, أقراص مثبطات البروتياز الخالية من EDTASigma-Aldrich11873580001يمكن تخزين محلول المخزون عند 2 إلى 8 درجات; C لمدة 1 إلى 2 أسابيع
حمض الخليك الجليديMerck Millipore100063
الجلسرين اللامائي BioChemicaAppliChemA1123
حمض الهيدروكلوريكMerck Millipore100317 إبرة
حقن طويلة (21   G ، 9 سم ، شطبة أو غير حادة)
MES هيدراتSigma-AldrichM8250
ميثانولMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896متوفر الآن تجاريا باسم IGEPAL & reg ؛ CA-630
NuPAGE 4-12٪ مكرر تريس جل صغير, 10  الآبار ، 1.0 ممLife TechnologiesNP0321
NuPAGE LDS عينة عازلة (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS قيد التشغيل (20x)Life TechnologiesNP0001
، درجة الحموضة 4.0-7.0Merck Millipore109542
QC Colloidal Coomassie StainBIO RAD1610803
الصوديوم كلوريدميرك ميليبور106406
الصوديومهيدروكسيدميرك ميليبور106498
وحدة تصفية SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti ، مجموعة دوار الطرد المركزي الفائقBeckman Coulter331336
Thinwall ، أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوح ، 13.2 & nbsp ؛ مل ، 14 مم × 89 ممبيكمان كولتر344059
تريس هيدروكلوريد   ؛AppliChemA1087
X31 فيروس الأنفلونزا A (H3N2) ، سائل آلانتوي مزروع بالبيض، مصفى Virapurمذاب طازجا على 4 درجات ؛ ج
شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NP 40 SDS PAGE M1

مقالات ذات صلة