تظهر الكريات البيض الكبدية الهامشية خصائص فريدة ووظائف مناعية مميزة مقارنة بمجموعات الكريات البيض الأخرى. نصف هنا طريقة للحصاد الانتقائي لهذه الخلايا الكبدية المحددة ، من خلال التروية القسرية لكبد الفئران أو الفئران. تبدو الكريات البيض الكبدية الهامشية حاسمة في تحديد القابلية للإصابة بالأمراض والنقائل المرتبطة بكبد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
< p class = 'jove_content'> الكريات البيض الهامش الكبدي (MH) (الكريات البيض الملتصقة بالجيوب الأنفية في الكبد) ، أظهرت تركيبة وخصائص فريدة مقارنة بكريات البيض في الأجزاء المناعية الأخرى. على وجه التحديد ، تشير الأدلة إلى وجود ملف تعريف مميز مؤيد ومضاد للالتهابات لمجموعة الكريات البيض MH وسمية خلوية أعلى لخلايا NK الخاصة بالكبد (أي خلايا الحفرة) مقارنة بالخلايا المناعية المنتشرة أو الطحالية في كل من الفئران والجرذان. تتيح الطريقة المعروضة هنا الحصاد الانتقائي لكريات الدم البيضاء MH عن طريق التروية القسرية للكبد في الفئران والجرذان. على عكس الطرق الأخرى المستخدمة لاستخراج كريات البيض في الكبد ، بما في ذلك طحن الأنسجة والتحلل البيولوجي ، فإن هذه الطريقة تنتج حصريا كريات البيض من الجيوب الأنفية للكبد ، غير ملوثة بخلايا من أجزاء الكبد الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، تحافظ تقنية التروية بشكل أفضل على سلامة البيئة والبيئة الفسيولوجية لخانات الكريات البيض MH ، مما يجنب الاستجابات الفسيولوجية المعروفة لمعالجة الأنسجة. نظرا لأن العديد من الخلايا الخبيثة المنتشرة والخلايا المصابة يتم احتجازها أثناء مرورها عبر الجيوب الأنفية الكبدية ، والتفاعل جسديا مع الخلايا البطانية والخلايا البيضاء المقيمة ، فإن مجموعة كريات البيض MH الفريدة تقع في موقع استراتيجي للتفاعل والتعرف عليها والتفاعل معها الخلايا المنتشرة الشاذة. وبالتالي ، فإن الحصاد الانتقائي للكريات البيض MH ودراستها في ظل ظروف مختلفة قد يعزز فهمنا للأهمية البيولوجية والسريرية لكريات البيض MH ، وتحديدا فيما يتعلق بالخلايا الشاذة المنتشرة والأمراض المرتبطة بالكبد والنقائل السرطانية.
المقدمة
الجيوب الكبد تحتوي على العديد من الأنواع الفرعية الكريات البيض لمختلف الأنشطة المناعي شديدة الأهمية للكائن الحي. على سبيل المثال، تتميز marginating الكبدي (MH) القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، التي تعرف أيضا باسم الخلايا حفرة، الخلايا الليمفاوية الحبيبية شكليا الكبيرة و(LGLs) وظيفيا كما الكريات البيض مع قدرة السامة للخلايا عفوية، مما الكبدي المقاومة ضد إنشاء بالدم الانبثاث ورم المنقولة. الهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تمكين الحصاد الانتقائي من الكريات البيض MH، من أجل دراسة هذه الفئة من السكان الخلية مهم وفريد (ومقصورة المناعة)، وإلقاء الضوء على تأثير مختلف التلاعب (على سبيل المثال تنشيط جهاز المناعة) على هذه الخلايا المحددة.
وعلى الرغم من عدم الحصانة للقضاء على الورم الرئيسي النامية، الأدلة في مرضى السرطان والنماذج الحيوانية تشير إلى أن نظام المناعة يمكن التحكم تعميم الخلايا السرطانية، micrometastases، والمرض المتبقية throuغ مناعة خلوية (CMI). ومع ذلك، هناك عدم تناسق واضح بين هذه القدرات في الجسم الحي والدراسات المختبرية في البشر والحيوانات، والتي تثبت أن معظم الخلايا السرطانية ذاتي مقاومة لسمية الخلايا من خلال تعميم أو الكريات البيضاء الطحال 1،2. قد يعزى هذا التناقض، جزئيا على الأقل، إلى وجود في الجسم الحي من جزء من السكان الكريات البيض متميزة، وهي (الجيوب) الكريات البيض-marginating الكبد وحيوانية من خلايا NK تفعيلها، وهي خلايا حفرة 3. في الواقع، تشير بيانات غير منشورة من مختبرنا أنه في الفئران F344 كانت هي lysed الخلايا السرطانية مسانج (MADB106)، التي وجدت مقاومة للتعميم والطحال الكريات البيضاء، خلايا MH-NK 4. وهكذا، الخلايا السرطانية التي هي "مقاومة NK" بزعم الكريات البيض تعميم يمكن التحكم بها عن خلايا MH-NK. الجدير بالذكر، في الفئران النشاط المعزز للMH-NK هو واضح التالية فقط في الجسم الحي المناعةالتحفيز (على سبيل المثال من خلال استخدام بولي الأول: C أو الدليل السياسي الشامل-C) 5.
تقع الخلايا القاتلة الطبيعية الكبد معين (MH-NK) داخل التجويف الجيبية، والتمسك الخلايا البطانية وخلايا كوبفر. وتتميز الخلايا MH-NK حصرا حبيبات كثيفة كروية والحويصلات محفور قضيب 6، والتي تحتوي على حمض الفوسفاتيز كما الانزيمات الليزوزومية، وبيرفورين وgranzymes كما المواد النشطة بيولوجيا 7،8. مقارنة مع تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا MH-NK يحمل عددا أكبر وحجم الحبيبات والحويصلات 9-11. في ظل ظروف التهابات، وعرضت خلايا MH-NK لعرض تعبير أعلى من LFA-1 12، بالمقارنة مع تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية. قد يشكل هذا التعبير تعزيز الآلية التي الخلايا MH-NK هي أكثر السامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية بعض من تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية 13،14. nterestingly بعد في المختبر الحضانة مع انترلوكين (ايل) -2، وخلايا MH-NK تصبح الموسع، وعدد وحجم حبيبات زيادة، والتي تنسجم مع الموالية فاي لو القاتل تنشيط مفوكين (LAK) خلايا (15).
الكريات البيض MH النشطة لا يمكن الحصول عليها إلا عن طريق أساليب حصاد الكريات البيض الكبد القياسية، والتي تقوم على طحن وتدهور البيولوجي في الأنسجة. نهج نضح لدينا الموصوفة هنا اثنين من المزايا الرئيسية مقارنة بالاساليب التقليدية. أولا، النهج نضح يحصد انتقائي الكريات البيض MH، ومنع التلوث الكريات البيض أخرى من المقصورات الكبد الأخرى. ثانيا، تقنية نضح أفضل تحافظ على سلامة والنشاط، والوسط الفسيولوجية من الكريات البيض MH، على عكس النهج معالجة الأنسجة التي تتلف الخلايا أو يغير التشكل، ويرجع ذلك إلى تلف الأنسجة، تحفز إطلاق سراح من العوامل المختلفة التي تعدل بشكل ملحوظ في مأمن نشاط.
الكبد هو العضو المستهدف الرئيسي لسرطان خبيث لالثانية لمختلف العدوى 16. كخلايا MH يحمل خصائص فريدة من المهم دراسة هذه سكانية محددة في ظل ظروف مختلفة فيما يتعلق بهذه الأمراض. على سبيل المثال، فإنه تجدر الإشارة إلى أن تنشيط جهاز المناعة النظامية من قبل مختلف BRMS (مثل بولي الأول: C أو الدليل السياسي الشامل-C) وقد ثبت أن تفعيل MH-الكريات البيض أكثر من تعميم الكريات البيض 5.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أخلاقيات الإعلان: إجراءات التي تجرى على الحيوانات تم اعتمادها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) في جامعة تل أبيب.
بروتوكول 1. الجرذان
- الاستعدادات
- إعداد heparinized حل برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) لاستخدامها في درجة حرارة الغرفة (RT) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين خالية من المواد الحافظة لكل مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 1X الحل. حساب 35 مل لكل حيوان.
- تمرير heparinized برنامج تلفزيوني من خلال خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة للقضاء على فقاعات الهواء.
- تعقيم الأدوات الجراحية - 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، 2 المرقأة، وملقط الأسنان الأنسجة (الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على) إعداد الجاف الجاذبية ().
- نضح من الكبد وجمع MH-الكريات البيض
- الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. كإجراء احترازي، ووضع أنبوب 50 مل تحتوي على الأيزوفلورينلوحة -soaked حول الرأس الفئران حتى فتح تجويف صدره.
- فتح تجاويف البريتوني والصدر لفضح الكبد والقلب والرئة مجمع فور وقف التنفس. تجنب النزيف من خلال هذه العملية.
- على وجه التحديد، بدء شق في الجزء الأسفل من نقطة خط الوسط في البطن، دون الأعضاء الداخلية المدمرة، والتقدم لكلا الجانبين بشكل مائل نحو الأضلاع، وقطع من خلالهم إلى مستويات تجويف الصدر العلوية.
- ضمن ما يقرب من دقيقة، وجمع أكبر قدر من الدم ممكن (~ 6 مل من 250 غرام الحيواني) من البطين الأيمن إلى حقنة.
- المشبك الوريد الأجوف الذيلية مع مرقئ أقرب وقت ممكن إلى القلب، لتمكين جمع سائل الإرواء.
- سحب الأمعاء ومكان خارج الحيوان إلى اليمين المجرب، ولفضح الوريد البابي.
- ادخال قسطرة 25 G الرابع، متصلة مضخة تحوي، في الوريد البابي، والذيلية وقت ممكن،لكن منقاري إلى الوريد الطحال.
- إدراج 25 G فراشة إبرة، متصلة حقنة 5 مل، إلى الوريد الأجوف السفلي، الذيلية إلى مرقئ.
- بدوره على مضخة تحوي بسرعة حوالي 3 مل / دقيقة، وجمع بلطف مل الأولى من الإرواء التي تلوثت الدم إلى المحقنة. تستمر حتى اللون سائل الإرواء هو يتحول شاحب اللون الأحمر (حوالي 3-5 مل). لاحظ أن لون الكبد يتغير نحو البني الفاتح.
- دون توقف المضخة تحوي استبدال حصاد حقنة 5 مل مع حقنة 20 مل الحصاد وجمع ما لا يقل عن 20 مل من سائل الإرواء الكبد يعمل بسرعة أعلى من نضح (تصل إلى 4 مل / دقيقة). تراقب باستمرار تدفق سائل الإرواء في حقنة جمع، وتجنب الفراغ الذي هو قوي جدا (التي قد تسد الإبرة من خلال انهيار جدران الوريد الأجوف).
- إنهاء نضح عندما يتحول لون الكبد إلى البني الفاتح.
- الكريات البيض استخراج
- أجهزة الطرد المركزي سائل الإرواء لمدة 10 دقيقة في 400 x ج، 24 ° C.
- نضح طاف
- إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف. استنادا إلى أهداف الدراسة، استخدم إعداد كما هو، أو إجراء التنقيات إضافية (على سبيل المثال، الكثافة التدرج الفصل).
- على وجه التحديد، طبقة 4 مل من سائل الإرواء أكثر من 4 مل من كتلة فصل كثافة التدرج في 50 سم أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي. تدور الأنابيب في 754 x ج، RT، لمدة 30 دقيقة مع نهاية الشوط الاول من المباراة.
- الحصول على طبقات وحيدات النوى في واجهة كثافة التدرج-فصل طاف قبل pipetting اليدوي، ويغسل في برنامج تلفزيوني، وإدراجها في أنبوب 5 مل.
2. بروتوكول ماوس
- الاستعدادات
- يعد حل heparinized برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) لاستخدامها في درجة حرارة الغرفة (RT) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين خالية من المواد الحافظة لكل مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 1X محلولن. حساب 20 مل لكل حيوان.
- تمرير heparinized برنامج تلفزيوني من خلال خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة للقضاء على فقاعات الهواء.
- تعقيم الأدوات الجراحية - 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، 2 المرقأة، وملقط الأسنان الأنسجة (الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على) إعداد الجاف الجاذبية ().
- نضح من الكبد وجمع MH-الكريات البيضاء
- الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. كإجراء احترازي، ووضع أنبوب 15 مل تحتوي على وسادة غارقة الأيزوفلورين حول الرأس الماوس حتى فتح تجويف صدره.
- إصلاح أطرافه من الماوس لسرير.
- فتح تجاويف البريتوني والصدر لفضح الكبد والقلب والرئة مجمع فور وقف التنفس، والحفاظ على الجانب السفلي من الحجاب الحاجز سليمة (لإنشاء تجمع تجويف الصدر يستنزف). تجنب النزيف من خلال هذه العملية.
- على وجه التحديد، بدء شق في أسفلنقطة البطن خط الوسط، دون الأعضاء الداخلية المدمرة، والتقدم لكلا الجانبين بشكل مائل نحو الأضلاع، وقطع من خلالهم إلى مستويات تجويف الصدر العلوية.
- انسحاب الأمعاء ومكان خارج الحيوان إلى اليمين المجرب، ولفضح الوريد البابي.
- ادخال ابرة 30 غراما، متصلة مضخة تحوي في منقاري الوريد البابي إلى الوريد الطحال.
- قطع الوريد الأجوف السفلي فوق الحجاب الحاجز للسماح الصرف الصحي وجمع سائل الإرواء من تجويف الصدر.
- بدوره على مضخة تحوي بسرعة حوالي 3 مل / دقيقة، وجمع بلطف أول 3 مل من سائل الإرواء أن تكون ملوثة بالدماء من تجمع تجويف الصدر.
- تجاهل هذا الإرواء. تكرار مثل هذا الغسيل مرة أخرى إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام المياه المالحة، وبعد ذلك فقط البدء في جمع سائل الإرواء الكبد.
- إعادة بدء نضح بسرعة تصل إلى 4 مل / دقيقة، وجمع 10 مل من سائل الإرواء من تجويف الصدر باستخدامفراشة متصلة حقنة.
- إنهاء نضح عندما يتحول لون الكبد إلى البني الفاتح.
- الكريات البيض استخراج
- أجهزة الطرد المركزي في الإرواء لمدة 10 دقيقة على 400 ز س.
- نضح طاف.
- إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف بناء على أهداف الدراسة، استخدم إعداد كما هو، أو إجراء التنقيات إضافية (على سبيل المثال، الكثافة التدرج الفصل).
- على وجه التحديد، طبقة كل 4 مل من سائل الإرواء أكثر من 4 مل من كتلة فصل كثافة التدرج في 50 سم أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي. تدور الأنابيب في 754 x ج، RT، لمدة 30 دقيقة مع نهاية الشوط الاول من المباراة.
- الحصول على طبقات وحيدات النوى في واجهة كثافة التدرج-فصل طاف قبل pipetting اليدوي، ويغسل في برنامج تلفزيوني، وإدراجها في أنبوب 5 مل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في الفئران F344 قارنا السمية الخلوية للخلايا MH-NK (التي تم جمعها من الجيوب الكبد عن طريق نضح الكبد القسري) لسمية الخلايا من السكان خلية الكبد كامل بعد طحن الميكانيكية للأنسجة الكبد، وإلى سمية الخلايا تعميم الكريات البيض. تم غسلها كافة الاستعدادات الخلية على الأقل 3 مرات، وروتين في المقايسات المناعية، وكخطوط الخلية المستهدفة استخدمنا الصنعية YAC-1 أو خطوط الخلايا MADB106 الهدف مسانج. كما هو مبين في الأرقام 1-4، في ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
طريقة نضح الكبد المقدمة هنا تمكن حصاد انتقائي وتدرس من السكان فريدة من marginating الكريات البيض الكبد. خلايا الكبد NK، وتسمى أيضا خلايا حفرة 3، تشكل المميز السكان الخلايا القاتلة الطبيعية الموجودة في الجيوب الكبدية. فهي موجودة في الفئران، الفئران 17 وفي البشر 18،19. مقارنة مع الخلايا القاتلة الطبيعية الطرفية المعزولة، أظهرت الخلايا حفرة ارتفاع السمية الخلوية ضد YAC-1 وCC531s خطوط الخلايا الهدف 20، وعرضت أن يكون لها عدد أكبر من حبيبات هي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
تم دعم المؤلفين وهذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة / NCI # R01CA172138 (إلى SBE).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| معججة أوتوكلود | |||
| إبرة فراشة | OMG | 26 جم | |
| إبرة فراشة | OMG | 21 جم * 3/4 " | |
| حقنة الموافقة المسبقة عن علم | 1 مل | ||
| حقنة الموافقة المسبقة عن علم | 2.5 مل | ||
| حقنة الموافقة المسبقة عن علم | 5 مل | ||
| حقنة | محلول الموافقة المسبقة عن علم | 10 مل | |
المراجع
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis? Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
