مقالة منهجية

التفريق بين الرجفان العضلية من الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام BMP خصم Grem2

7.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53919

⸱

مارس 10, 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 3Department of Cell & Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يسمح توليد خلايا عضلة القلب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات في المختبر بالوصول إلى كميات كبيرة من أنسجة القلب في المختبر للعلوم الأساسية والتطبيقات السريرية. يستخدم هذا البروتوكول عامل الأذين Grem2 لزيادة عدد خلايا عضلة القلب التي تم الحصول عليها ولتوليد خلايا عضلة القلب بنمط ظاهري أذيني.

الملخص

وقد وضعت بروتوكولات لتوليد سكان العضلية من الخلايا الجذعية المحفزة، ولكن هذه تسفر عادة خلايا الظواهر مختلطة. تتطلب الباحثين الراغبين في متابعة الدراسات التي شملت فرعية العضلية محددة نهج التمايز أكثر توجيهات. عن طريق التعامل مع الماوس الجذعية الجنينية (ES) الخلايا مع Grem2، وهو خصم BMP يفرز ما هو ضروري لتشكيل غرفة الأذيني في الجسم الحي، ويمكن إنشاء عدد كبير من خلايا القلب مع النمط الظاهري الأذيني. استخدام المحفزة خط الخلايا الجذعية Myh6-عن dsRed-مجلس التوحيد الوطنى هندسيا يسمح لتحديد واختيار، وتنقية الخلايا العضلية. في هذا البروتوكول يتم إنشاؤها الهيئات مضغي من خلايا Myh6-عن dsRed-مجلس التوحيد الوطنى باستخدام طريقة قطرة شنقا وأبقى في تعليق حتى يوم التمايز 4 (D4). في الخلايا D4 تعامل مع Grem2 ومطلية على لوحات الجيلاتين المغلفة. بين لوحظ D8-D10 المناطق المقاولات الكبيرة في الثقافات والاستمرار في توسيع ومature من خلال D14. الجزيئية، والتحليلات النسيجية وelectrophysiogical تشير الخلايا في الخلايا المعالجة Grem2-يكتسب خصائص تشبه الأذيني تقديم نموذج في المختبر لدراسة البيولوجيا العضلية الأذينية واستجابتها لمختلف وكلاء الدوائية.

المقدمة

الخلايا الجذعية المحفزة هي أداة قوية لتوليد ودراسة الخلايا من مجموعة من الصعب الأنسجة الوصول للبحوث والدراسات ما قبل السريرية الأساسية، لا سيما في البشر 1-5. تعديل السليم لمسارات الإشارات التنموية يمكن توجيه تمايز الخلايا الجذعية المحفزة لمصير المظهرية المطلوب. وقد وضعت العديد من البروتوكولات لتوليد العضلية (CMS) من الخلايا الجذعية المحفزة 6-14. تتضمن هذه البروتوكولات عموما تعديل من TFGβ الفصيلة (Activin، BMP، وTGFβ) والممرات من خلال إضافة موقوتة من عوامل النمو الخارجية و / أو جزيئات صغيرة 10،12-15 WNT. هذه البروتوكولات غالبا ما تكون فعالة في زيادة نسبة الخلايا التي تصبح مضادة، ولكن تفتقر إلى التحديد، وتوليد يقطنها خليط سكاني من الخلايا التي تمثل الأنساب الأذيني، البطين، والنظام العقدي / التوصيل. من أجل دراسة القلب محدد فرعية لAPPRO التمايز أكثر موجهةمطلوب منظمة العمل ضد الجوع.

Gremlin2 (Grem2، وتسمى أيضا البروتين المتصلة دان وسيربيروس أو PRDC قصيرة) هو خصم BMP يفرز ما هو ضروري للتمايز القلب السليم وتشكيل غرفة الأذيني خلال تطوير القلب في الزرد 16. علاج تمييز الخلايا الجذعية الجنينية مع Grem2 في التمايز يوم 4، بعد ذروة التعبير عن علامات أرومية متوسطة T-براتشيوري وسيربيروس مثل 1، ويزيد من غلة مضادة ويولد مجموعة من الخلايا في الغالب من سلالة الأذيني 14.

يستخدم المؤتلف Grem2 لعلاج الخلايا التفريق ويمكن أن يتم باستخدام تقنيات إنتاج البروتين القياسي 17 أو يمكن شراؤها تجاريا. وهو قابل للذوبان عالية في المحاليل المائية ويمكن أن يضاف خارجيا على الثقافات في نقطة الوقت المطلوب.

يمكن تتبع التمايز باستخدام RT-QPCR لقياس التعبير عن ممثل علاماتمن الأسلاف القلب والأوعية الدموية، الأسلاف القلب، وملتزمة مضادة. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعي لتحديد وتصور التوزيع المكاني لأنواع الخلايا في القلب.

يتم تنفيذ التطبيقات التي تتطلب مجموعات نقية بسهولة أكبر من عند استخدام نظام مراسل لتحديد وعزل مضادة. لهذا الغرض، أدخلنا αMHC-DsRedNuc بناء في خط خلية الماوس CGR8 ES 14. خلايا CGR8 تنمو وتبقى المحفزة دون الخلايا المغذية، وتسهيل التوسع والتمايز فحوصات 18. يحتوي على خط خلية ES لعن dsRed البروتين الفلوري تسلسل الترميز مع إشارة توطين النووية تحت القلب محددة ألفا سلسلة الميوسين الثقيلة (ألفا MHC أو Myh6) مروج الجين. باستخدام هذه الخلايا، مضادة يمكن التعرف عليها بسهولة ومعزولة لتقدير، فرز الخلايا، الكهربية، شاشات المخدرات، ودراسة آليات التمايز الأذيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد خلية ثقافة وسائل الإعلام، حلول، والكواشف.

  1. إعداد 500 مل من الفأر الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) وسائل الاعلام عن طريق خلط وتصفية العقيمة (0.2 ميكرون حجم المسام) 445 مل غلاسكو الدنيا الأساسية المتوسطة (GMEM)، 50 مل الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 5 مل 100X تتركز L- استبدال الجلوتامين، 5 ميكرولتر الماوس المؤتلف اللوكيميا المثبط عامل (ليف) في 1 × 10 7 وحدات لكل مل، و 1.43 ميكرولتر ß المركابتويثانول (تركيز النهائي هو 50 ميكرومتر). تخزين عند 4 مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  2. إعداد 500 مل من مضغي الجسم (EB) وسائل الاعلام التمايز عن طريق خلط ومعقمة تصفية 391 مل Iscove في التعديل Dulbecco المتوسطة (IMDM)، 100 مل الحرارة المعطل FBS، تتركز 5 مل 100X استبدال الجلوتامين، تتركز 5 مل 100X الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، و2.86 ميكرولتر ß المركابتويثانول (تركيز النهائي هو 100 ميكرومتر). متجر في 4˚ مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  3. تحضير 0.2٪ ث/ حل v من الجيلاتين عن طريق خلط 1 غرام الخنازير مسحوق الجيلاتين الجلد مع 500 مل من تصفيتها، H المقطر 2 O. تعقيم بواسطة التعقيم. لاحظ أن الجيلاتين قد لا تكون قابلة للذوبان في الماء تماما في RT. بعد التعقيم الجيلاتين يجب حلها تماما. تخزين في RT حتى جاهزة للاستخدام.
  4. إعداد Grem2 قسامات البروتين المؤتلف بحل بيليه 50 ميكروغرام من مجفف بالتجميد Grem2 في 100 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع 0.1٪ BSA لتقديم 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر حل الأسهم. قسامة 20 ميكرولتر من هذا المحلول إلى خمسة العقيمة 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي وتخزينها في -80˚ مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  5. إعداد برنامج تلفزيوني وفقا لبروتوكولات نشرت أو شراء مثل الأسهم 10X وتمييع 01:10 مع تصفيتها، H المقطر 2 O لجعل 1X التخفيف 19 العمل. تعقيم برنامج تلفزيوني عن طريق التعقيم قبل استخدامها. تخزين في RT حتى جاهزة للاستخدام. في بعض الخطوات، DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ يستخدم. هذا هو بوrchased كحل 1X. يتم تضمين معلومات الطلب في الجدول من الكواشف.

2. إعداد الجيلاتين المغلفة 10 سم الأنسجة أطباق الثقافة

  1. في نسيج الثقافة هود تعقيمها إضافة 5 مل من 0.2٪ محلول الجيلاتين إلى كل طبق نسيج الثقافة 10 سم للطلاء. أطباق مكان في حاضنة في 37 مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل أو ما يصل إلى 4 أيام.

3. إعداد الجيلاتين المغلفة 6-حسنا الأنسجة لوحات الثقافة

  1. في نسيج الثقافة هود تعقيمها إضافة 1 مل من 0.2٪ الجيلاتين إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا. لوحات مكان في الحاضنة عند 37 مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل أو ما يصل إلى 4 أيام.

4. الجنينية الثقافة الخلايا الجذعية

  1. mESCs الذوبان
    1. إعداد وسائل الاعلام مسك من قبل ارتفاع درجات الحرارة إلى RT في نسيج الثقافة هود تعقيمها. إضافة 10 مل سائل الإعلام RT إلى صحن 10 سم المغلفة الجيلاتين.
    2. إزالة 1 قنينة من mESCs تحتوي على ما يقرب من 1 × 10 6 خلايا منcryostorage. عقد cryovial مع ملقط، ومكان في حمام مائي 37 مئوية. دوامة بلطف حتى إذابة تعليق الخلية ويبقى فقط على الجليد الكريستال الصغيرة في وسط القارورة. تجف من قارورة مع التخلص منها خالية من الوبر مسح وتعقيم مع 70٪ ETOH.
    3. في نسيج الثقافة هود العقيمة إزالة الخلايا إذابة باستخدام طرف P1000 من cryovial ونقل إلى صحن 10 سم أعد 4.1.1).
    4. ضع صحن 10 سم إلى 37 مئوية حاضنة الثقافة خلية ترطيب مع 5٪ CO 2 وتوزيعها بالتساوي الخلايا عن طريق تحريك بلطف أمام لوحة إلى الخلف، ثم جنبا إلى جنب. السماح الخلايا لنعلق على لوحة O / N أو على الأقل 6 ساعة.
    5. أول شيء الخلايا الاختيار صباح اليوم التالي لمرفق باستخدام المجهر مشرق الميدان. سيلاحظ بعض الحطام الخلية والخلايا الميتة في وسائل الإعلام. هذا امر طبيعي. وسائل الإعلام نضح من الأطباق واستبدالها مع 10 مل سائل الإعلام مسك جديدة.
    6. الاستمرار في تغيير وسائل الاعلام على الخلايا كل يوم لمنع التمييز.
  2. mESCs الركض
    1. خلايا مرور عند 60-70٪ متموجة. إعداد الخلايا لمدة الركض بواسطة الشفط وسائل الإعلام والشطف مع 5 مل العقيمة 1X DPBS دون MgCl 2 و CaCl 2. إضافة 2 مل 0.05٪ التربسين-EDTA حل. وضع في الحاضنة عند 37 مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. في حين أن الخلايا تحتضن، وإعداد جديد طبق 10 سم بواسطة الشفط حل الجيلاتين وإضافة 10 مل من وسائل الاعلام RT مسك. بعد 5 دقائق فحص الخلايا للانفصال. إذا ظلت الخلايا المرفقة، والاستمرار في احتضان عند 37 مئوية لمدة 2 دقيقة في وقت واحد حتى منفصلة تماما.
    3. إخماد التربسين-EDTA بإضافة 3 مل من وسائل الاعلام مسك. نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وتدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق لبيليه. وسائل الإعلام نضح من بيليه وإعادة تعليق في 10 مل سائل الإعلام مسك.
    4. اعتمادا على نسبة الانقسام المطلوب، إضافة 0،5-1،0 مل من خلية إلى تعليق كل صحن أعدت في الخطوة 4.2.2). وضع الطبق في الحاضنة وتوزيعها بالتساوي الخلايا عن طريق تحريك بلطف الخلف إلى الأمام ثم جانب إلى آخر. جميعخلايا آه إرفاق O / N أو لا يقل عن 12 ساعة.
      ملاحظة: نسبة تقسيم 1:10 حتي 1:20 هو شائع لمعظم خطوط مسك. قد تختلف هذه النسبة حسب خط المستخدمة، وعدد مرور، والتقاء المطلوب على طبق جديد. ل01:10 انقسام نقل نسبة 1 مل من تعليق خلية في 9 مل وسائل الاعلام مسك ولوحة في صحن 10 سم المغلفة الجيلاتين الطازجة.

5. إعداد الهيئات مضغي

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستثناء الطرد المركزي في نسيج الثقافة هود العقيمة.

  1. إعداد تعليق خلية في وسائل الإعلام EB
    1. على 70٪ confluency (عادة 24-48 ساعة بعد مرور)، استخدام الخلايا لتشكيل EB. إعداد الخلايا لتشكيل EB بواسطة فصل والتكوير وفقا لأقسام 4.2.1) - 4.2.3).
      ملاحظة: (على سبيل المثال، القليل جدا من موت الخلايا، لا تلوث، مورفولوجيا السليم) فمن الأفضل أن الخلايا مرور مرة واحدة على الأقل بعد ذوبان الجليد والتحقق من صحة والنمو القوي (ه.ز.، الأضعاف السكان التي تحدث كل 24-48 ساعة) قبل استخدامها لصنع EBS.
    2. اعادة تعليق بيليه في 5 مل EB وسائل الإعلام. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلايا.
    3. تمييع تعليق خلية في حجم المطلوب من وسائل الإعلام EB لجعل تركيز النهائي من 25 خلية / ميكرولتر (أو 2.5 × 10 3 خلية / مل). لاحظ أن كل غطاء طبق بتري يحمل حوالي 60 EBS ويتطلب حوالي 1.3 مل من التعليق الخلية. في هذه الخطوة، وإعداد كمية كافية من تعليق خلية لتوليد العدد المرغوب فيه من EBS. على سبيل المثال، إذا طلب 240 EBS للتجربة، وإعداد 5.2 مل في 2.5 × 10 3 خلية / مل.
      ملاحظة: mESCs التي لا يتم استخدامها لتشكيل EB يمكن أن تستخدم في التجارب المستقبلية من خلال الدوران أسفل، وإعادة تعليق في وسائل الإعلام مسك والطلاء كما هو موضح في القسم 4.2.
  2. إنشاء الهيئات مضغي
    1. إعداد العقيمة 10 سم البكتيرية بتري أطباق معلقة تشكيل قطرة بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى أسفل همنظمة العمل ضد الجوع.
    2. نقل EB تعليق من الخطوة 5.1) إلى حوض محلول معقم.
    3. إزالة الغطاء من طبق بتري استعداد وإيداع بعناية وستين، 20 قطرات ميكرولتر من تعليق EB على السطح الداخلي. إنجاز هذا بكفاءة باستخدام الماصة متعدد القنوات مزودة 6 نصائح. كل قطرة 20 ميكرولتر لديها الآن 500 خلية.
    4. استبدال بلطف غطاء على النصف السفلي من البكتيريا بتري طبق، والحرص على عدم طرد شنقا قطرات. ضع الأطباق في خلية حاضنة الثقافة في 37˚ C. بعد 2 أيام، وخلايا جاهزة لغسل أسفل كما هو موضح في 5.3).
  3. غسل أسفل الهيئات مضغي
    ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات يغسل إلى أسفل في نسيج الثقافة هود العقيمة.
    1. بعد 2 أيام في EB مستعدون لغسل أسفل ونقل إلى 6 سم أطباق بتري البكتيرية. قبل الحارة 3 مل من وسائل الاعلام EB في طبق بتري لRT. كل طبق بتري 6 سم البكتيريا يمكن أن تعقد بشكل فعال 2 أغطية بقيمة شنقا قطرات.
      ملاحظة: تأكد من استخدام غير المغلفة طبق بتري وأو هذه الخطوة (انظر الجدول المواد). لا تستخدم صحن زراعة الأنسجة أو أي سطح آخر أن تشجع التصاق الخلية. يجب أن تظل EBS علقت في وسائل الإعلام حتى على استعداد ليكون مطلي كما هو موضح في المادة 6.
    2. إزالة 10 سم أطباق بتري من الحاضنة ومكان في معقم غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة. إزالة بعناية غطاء مع EBS والميل بزاوية 45 درجة.
    3. باستخدام الماصة 5 مل المصلية التي تحتوي على 3 مل من وسائل الاعلام RT EB، وغسل بلطف EBS في بركة في الجزء السفلي من غطاء. فحص دقيق لغطاء للEBS تلصق على السطح وإعادة شطف-إذا لزم الأمر.
    4. بعد غسل جميع عمليات نقل EBS إلى طبق بتري 6 سم.
    5. كرر الخطوات من 5.3.2) -5.3.4) لجميع EBS. يجب أن يحتوي كل طبق بتري 6 سم EBS من كل منهما 10 سم الأغطية. وضع جميع الأطباق مرة أخرى في حاضنة في 37 مئوية لمدة يومين آخرين.
      ملاحظة: EBS التي هي قريبة جدا معا في تعليق قد تلتصق ببعضها البعض وتشكيل المجاميع الكبيرة. وهذا يمكن أن يؤثر سلبا على كفاءة التمايز القلبفضلا عن خفض كبير في أعداد متاح EBS. لمنع التجميع، يجب أن يتم التحقق EBS كل يوم، وفصلها عن طريق تحريك بلطف ذهابا وإيابا، ثم جنبا إلى جنب. استخدام أطباق البكتيرية في الخطوات التمايز في وقت مبكر أمر ضروري لمنع EB المرفق إلى الطبق والسماح EBS أن تنمو في تعليق.

6. والطلاء ومعالجة EBS مع Grem2

  1. إعداد Grem2 العلاج المتوسطة عن طريق إضافة كمية كافية من الأوراق المالية (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) Grem2 إلى RT EB المتوسطة لتخفيف النهائي من 1-5 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: التركيز الفعال لعلاج EBS يختلف باختلاف خط الخلية ونشاط محدد من الكثير الحالي Grem2. فمن المستحسن أن قبل استخدام جرعة معاير للعثور على فعالية القصوى. للخط CGR8 مسك نحن نستخدم بشكل روتيني 3-5 ميكروغرام / مل من Grem2. تركيزات فعالة من Grem2 لتوليد العضلية الأذيني سوف تنتج خلايا التعاقد بسرعة بينأيام 7-8 التي هي على نطاق واسع في جميع أنحاء كل بئر. إن لم يكن لوحظ النمط الظاهري التعاقد في الثقافات تعامل فمن المستحسن أن Grem2 جرعة يكون معاير داخل النطاق المحدد.
  2. إعداد لوحات زراعة الأنسجة 6-جيدا بواسطة الشفط حل الجيلاتين طلاء من كل بئر وإضافة 2 مل من وسائل الاعلام العلاج RT Grem2. إزالة EBS من الحاضنة ومكان في معقم غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
  3. باستخدام P1000 المقرر أن 100 ميكرولتر نقل 30 EBS من 6 سم أطباق بتري إلى كل بئر. مكان EBS في الحاضنة وبالتساوي تفريق بواسطة بلطف تتحرك لوحة الخلف إلى الأمام ثم جانب إلى آخر.
    1. بعد EBS لم تعلق على الجيلاتين المغلفة الآبار واستبدال وسائل الإعلام Grem2 كل يومين حتى يوم 10. بعد 10 يوما، وقف العلاج Grem2 وإضافة وسائط EB جديدة كل يومين للحفاظ على الخلايا السليمة.
      ملاحظة: بعد ربط، وسوف EBS تتسطح على طول سطح اللوحة المغلفة.

7. التفكك الخليوي لRT-QPCR Analyالهيئة العامة للاستعلامات

  1. تفكك خلية مع التربسين-EDTA
    1. وسائل الإعلام نضح من كل بئر وشطف مرتين مع 1 مل لكل بئر من DPBS العقيمة ناقص الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+.
    2. إضافة 0.5 مل 0.25٪ محلول معقم التربسين-EDTA إلى كل بئر من الذي سيتم جمع الخلايا.
    3. وضع لوحة في حاضنة في 37 مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. بعد 5 خلايا الاختيار دقيقة عن التفكك. إذا كانت الخلايا لا تزال تعلق على الجزء السفلي من جانب الصنبور برفق لإزالة. إذا لم التنصت تخفيف الخلايا، المكان مرة أخرى في الحاضنة ورصد كل دقيقة 2 حتى يتم فصل الخلايا تماما.
    5. تحييد حل التربسين-EDTA بإضافة 0.5 مل سائل الإعلام EB إلى كل بئر.
    6. نقل كامل 1 مل من تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل الصغيرة.
    7. خلايا بيليه عن طريق الدوران في أعلى الجدول الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
    8. وسائل الإعلام نضح من بيليه والانتقال إلى تحلل فورا أو مخزن بيليه في -70 مئوية لتصبح جاهزة للتحلل. منذ فترة طويلة ثالثالا ينصح م تخزين الكريات وهذا يمكن أن يؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي.
  2. تحلل الخلايا ودراسة جزيئية
    1. عند هذه النقطة الخلايا جاهزة لعزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج العمود التجارية أو استخدام استخراج الحمض النووي الريبي كاشف وفقا للبروتوكولات التي قدمتها الشركات المصنعة (انظر الجدول المواد). مرة واحدة معزولة، عكس RNA كتب واستخدام كدنا] لتحليل RT-QPCR باستخدام التقنيات القياسية 20 و 21.
      ملاحظة: يتم سرد الاشعال المستخدمة من قبل هذا المختبر لRT-QPCR في الجدول رقم 1. هوية الرجفان تأكيد باستخدام مزيج من RT-QPCR للنظر في التعبير عن الجينات الأذيني والبطيني والكهربية لعمل سجل مدة المحتملة (انظر القسم 8). يتم تضمين مجموعة مختارة من الجينات في هذا البروتوكول كمثال موثوقة الأذيني والبطيني علامات. تم العثور على مزيد من المعلومات حول الأذيني والبطيني التعبير الجيني في سياق المحفزة تمايز الخلايا الجذعية في اشارة 14.

8. تحليل الكهربية

  1. تفكك خلية مع كولاجيناز
    1. وسائل الإعلام نضح من كل بئر وشطف مرتين مع 1 مل لكل بئر من برنامج تلفزيوني العقيمة.
    2. إضافة 0.5 مل من 1 ملغ / مل كولاجيناز حل كل بئر.
    3. وضع لوحة في حاضنة في 37 مئوية لمدة 10 دقيقة.
    4. بعد 5 خلايا الاختيار دقيقة عن التفكك. إذا كانت الخلايا لا تزال تعلق على بعضها البعض أو الجزء السفلي من جانب الصنبور برفق لإزالة. وعلاوة على ذلك فصل الخلايا عن طريق سحن لطيف مع P1000.
      ملاحظة: لتسهيل التصحيح التسجيلات المشبك خلايا يجب المسحوقة حتى يتم التوصل إلى تعليق وحيد الخلية.
    5. إضافة 0.5 مل سائل الإعلام EB إلى كل بئر وتخلط قبل pipetting.
    6. نقل كامل 1 مل من تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل الصغيرة.
    7. خلايا بيليه عن طريق الدوران في أعلى الجدول الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
    8. وسائل الإعلام نضح من الكريات الخلية.
    9. إعادة تعليق الخلايا في 500ميكرولتر برنامج تلفزيوني مع FBS 10٪، ويجري التأكد من يسحن في تعليق خلية واحدة.
  2. توصيف الكهربية.
    وقد نشرت العديد من البروتوكولات ممتازة في هذه المجلة على استخدام واحد المشبك خلية التصحيح لقياس إمكانات غشاء الخلية: ملاحظة. للحصول على معلومات مفصلة حول كيفية إجراء التصحيح خلية واحدة المشبك القارئ المبتدئ ويشار إلى هذه البروتوكولات 21-24. وفيما يلي يحتوي على معلومات محددة لهذا البروتوكول من شأنها أن تساعد الكهربية خبرة الاستعداد والتعامل مع مسك المستمدة مضادة لتوصيف نوع فرعي.
    1. إعداد الحل تسجيل الخلايا تتكون من ما يلي: 10 ملي HEPES العازلة، 5 ملي MgATP، 2 ملي EGTA، 110 ملم الغلوتامات البوتاسيوم، و 10 ملي بوكل، و 10 ملي كلوريد الصوديوم. ضبط حل لدرجة الحموضة 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
    2. إعداد تسجيل خارج الخلية (حمام) حل تتكون مما يلي: 2 مم HEPES، 10 ملي الجلوكوز، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5.4 ملي بوكل، و 137ملي كلوريد الصوديوم. ضبط حل لدرجة الحموضة 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
    3. إعداد الماصة الزجاج الذي يقيس 2-5 المقاومة MΩ عندما ردم بمحلول تسجيل استخدام الزجاج البورسليكات القياسية مع خيوط.
    4. نقل 100 ميكرولتر من خلايا معلقة في غرفة تسجيل تحتوي على حل تسجيل خارج الخلية باستخدام P200.
      ملاحظة: قد يتم ترقيع الخلايا في تعليق، أو لتسهيل التداول والاستخدام للعلاج من المخدرات و / أو فحوصات نضح، قد يكون المصنف على ساترة الجيلاتين المغلفة على النحو المبين في 8.2.5).
    5. تحضير الجيلاتين المغلفة coverslips الزجاج عن طريق وضع 10 مم ساترة الزجاج في كل بئر من لوحة 6 جيدا وتغطي مع حل الجيلاتين كما هو موضح في القسم 3.1) من هذا البروتوكول.
      1. بعد 30 دقيقة على الأقل حل نضح الجيلاتين وإضافة 100 ميكرولتر من الخلايا مع وقف التنفيذ مباشرة إلى ساترة ووضع كامل لوحة 6 جيدا في الحاضنة لمدة لا تقل عن 2 ساعة أو حتى تعلق الخلايا. بعد أن تعلق الخلايا، صemove انزلاق الغطاء ووضعه في غرفة تسجيل مع الحل تسجيل خارج الخلية.
        ملاحظة: إذا كنت تستخدم αMHC-عن dsRed الفلورسنت خط مسك مراسل القلب، مضادة يمكن تحديدها من قبل نواة الفلورسنت الحمراء لديهم. إذا لم تكن تستخدم خط مراسل القلب، وخلايا التعاقد بشكل عفوي ويمكن ملاحظة ومعزولة عن القياسات. المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة مضادة عادة ما تكون أصغر حجما وأكثر تنوعا، تفتقر إلى التشكل مستطيلة من سمات الكبار تشكيلها بالكامل myocytes القلب.
    6. جعل جميع التسجيلات في 37 ج. التصحيح الخلايا واحدة باستخدام المشبك خلية كاملة في وضع المشبك الحالي مع الماصة البورسليكات الزجاج من 2-5 المقاومة MΩ. استخدام الضغط السلبي لطيف لتحقيق gigaohm ختم قبل الوصول خلية كاملة. تطبيق الضغط السلبي السريع إلى تمزق الغشاء والوصول خلية كاملة قبل تسجيل إمكانات الغشاء.
    7. استحضار إمكانات العمل باستخدام 4 مللي ثانية depolarizing الحقن الحالية.
      ملاحظة:لمضادة المستمدة PSC-كمية التيار المطلوب لتحريك بتكاثر قد تختلف إمكانات العمل. من أجل العثور على أفضل الحد الأدنى الحالي، تبدأ عند مستوى منخفض نسبيا السعة الحالية الحالية وزيادة اثار بطريقة تدريجية حتى يتم الحصول على إمكانات العمل استنساخه.
      ملاحظة: العمل المدد المحتملة للmyocytes الأذيني يسببها Grem2-وعادة ما تكون في حدود 20-40 مللي وتفتقر إلى مرحلة الهضبة (الشكل 6B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قبل التمايز، وينبغي أن تكون الخلايا الجذعية المحفزة المدمجة وخالية من التمايز عفوية. الخلايا هو مبين في الشكل 1A جاهزة للsingularized وتستخدم لتعليق قطرات كما هو موضح في 5.1 من قسم البروتوكول. الخلايا هو مبين في الشكل 1B يتم التفريق بشكل عفوي، وينبغي ألا تستخدم لإعداد شنقا قطرات.

لوحات المدرجة في الشكل 2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا البروتوكول تنتج بشكل روتيني الثقافات التي تحتوي على نسبة عالية من مضادة التي هي سمة من سلالة الأذيني. كما هو الحال مع أي بروتوكول التمايز، ينبغي إيلاء جودة mESCs قبل التمايز اهتماما خاصا. mESCs ينبغي رصد روتيني لالتشكل الصحيح (الشكل 1A). فإن أي التمايز عفوية أن يحدث قبل تشكيل EBS تحد بشدة من كفاءة تخلق القلب ويجب إزالتها قبل الركض (الشكل 1B). يؤثر EB حجم أيضا تخلق القلب. وقد تم اختبار بدءا أعداد الخلايا ما بين 200 و 1000 في EB و 500 خلية لكل E...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

مؤلفو هذه المخطوطة ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL083958 وHL100398 (AKH) و2T32HL007411-33 "برنامج في القلب والأوعية الدموية الآليات: التدريب في التحقيق" (JB).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جي إم إي إملايفتكنولوجيز 11710
FBSلايفتكنولوجيز 10082
جلوتاماكسلايف تكنولوجيز35050
LIFEMD ميليبورESG1107
- ميركابتو إيثانولسيجماM3148
IMDMسيجماI3390
الأحماض الأمينية غير الأساسيةSigmaM7145
10 سم ألواح زراعة الأنسجةSarstedt83.3902
10 سم أطباق بتري بكتيريةVWR25384-342
6 سم أطباق بتري بكتيريةVWR25384-092
ألواح زراعة الأنسجة ذات 6 آبارSarstedt83.3920
Gremlin 2 بروتين مؤتلفR & امبير; D Systems2069-PR-050
وحدات تصفية معقمةThermo Fisher09-741-02
الجيلاتين (من جلد الخنازير)SigmaG1890
10X PBS ، معقمSigmaP5493
BSA & nbsp ؛Sigma5470
0.05٪ حل التربسين-EDTALife Technologies25300054
DPBS ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيومتقنيات الحياة14200

المراجع

  1. Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
  2. Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
  3. Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  4. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  5. Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
  6. Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  8. Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
  9. Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).
  10. Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
  11. Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  12. Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  13. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  14. Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
  15. Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  16. Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
  17. Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
  18. Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).
  19. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
  22. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  23. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  24. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  25. Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
  26. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
  27. Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
  28. Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  29. Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
  30. Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Grem2 Myh6 DSRed Nuc

مقالات ذات صلة