Method Article

باستخدام تقنية الترقق لتنفيذ متحد البؤر المجهري للالصلبة الإنسان

DOI:

10.3791/53920

⸱

May 6th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Cologne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنسجة الصلبة البشرية هي الكولاجين بشكل أساسي ؛ لذلك ، لا يمكن استخدامها بسهولة في الكيمياء المناعية. لتحقيق هدف إجراء الكيمياء المناعية للفحص المجهري متحد البؤر للأنسجة الصلبة ، تم استخدام تقنية التصفيح.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصلبة هي النسيج الضام الكثيفة التي تغطي وتحمي العين. وتتكون أساسا من حزم الكولاجين كثيفة (أنواع الأول والثالث والرابع، والخامس، والسادس، والسابع). نظرا لتألق ذاتي، الغموض، وسمك، لم يتم العثور يجعلها مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر. نهج بديل لتلك المعروضة هنا، والذي يستخدم الصلبة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين لالمناعية، يواجه تحديات التقنية، وخصوصا عندما التسخين الأنسجة لاسترجاع مستضد. منذ الصلبة هي فقيرة نسبيا في كل من الخلايا والأوعية، واستكشاف واستخدام عينات الأنسجة أكبر للمساعدة على منع الخلايا تطل وفهم توطين بهم فيما يتعلق بالسفن ومواقع تشريحية أخرى. للسماح لتحليل عينات الأنسجة أكبر تحت المجهر متحد البؤر، تم تنفيذ أسلوب الترقق لخلق طبقات رقيقة من الصلبة. وبعد تحليل نتائج الأوعية الدموية CD31 والأوعية اللمفاوية البطانية hyaluرونان مستقبلات 1 (LYVE1) خلايا الإيجابية، التي تم الحصول على الموافقة للفحص العلمي، وتناقش مزايا وقيود من هذا الأسلوب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصلبة هي الطبقة الخارجية الصلبة التي تغطي العين، وهو مصنوع من النسيج الضام الكثيفة. فهو يساعد على حماية الهياكل داخل العين والمحافظة على ضغط العين. وهكذا، فإن الصلبة أمر ضروري لرؤية واضحة. وهي خالية من الأوعية اللمفاوية 1،2 وبالتالي يشكل الحدود الخارجي خالية من اللمفاوية بينه وبين خالية من اللمفاوية العين الداخلية 3-7. كما يوفر مواقع المرفقات للعضلات العين، وبالتالي تقاسم التشابه التشريحية مع الأوتار. لأن الصلبة يتكون أساسا من حزم كثيفة من النوع الأول الكولاجين ولديه عدد أقل من أنواع الكولاجين الثالث، والرابع، والخامس، والسادس، والثامن 8،9 والإيلاستين 10،11، هذا النسيج ليست سهلة الاستخدام لالمناعية.

تشريحيا، الصلبة يمكن تقسيمها إلى ثلاث طبقات رئيسية: (1) ظاهر الصلبة أوعية دموية سطحية، وجدت تحت الملتحمة وكبسولة لسان ونحو الجانبين والعشرينالبريد مؤخرة العين التي تواجه المدار؛ (2) سدى الصلبة، والجزء الرئيسي من الصلبة. و (3) الغبساء الصفيحة، وهي طبقة رقيقة المصطبغة تقع مباشرة فوق العنبية. معرفتنا التشريحية حول الصلبة تنبع أساسا من النصف الأول من القرن التاسع 20. في ذلك الوقت، ودرس الباحثون تشريح الأوعية الدموية بشكل رئيسي باستخدام الهند حقن الحبر 12 والأوعية الدموية الصب 13-15. وفي وقت لاحق، وقد بحثت في دراسات التصوير الوعائي 16-19.

منذ ذلك الوقت، وقد تحسنت تقنيات قديمة، وقد تم تطوير تلك الجديدة التي سمحت لنا لتكملة المعرفة التشريحية السابقة. على سبيل المثال، فقد كان فقط حوالي عقد من الزمان منذ أن كان لهذه علامات اللمفاوية موثوق بها اللمفاوية بطانة الأوعية الدموية محدد حمض الهيالورونيك مستقبلات 1 (LYVE1) 20 أو podoplanin 21. يقدم المجهر متحد البؤر إمكانيات جديدة لدراسة الخصائص التشريحية لمنظمة الشفافية الدولية المختلفةssues من العين. انها تسمح للبقع متعددة لاستخدامها للتمييز علامات من الخلايا أو لتوطين الخلايا في ما يتعلق الأوعية الدموية والهياكل التشريحية الأخرى. ويقدم لمحة عامة عندما تكون العينة ذات حجم أكبر وتتيح لنا من خلال مسح عينة عندما بحثا عن نوع خلية معينة. مع تكنولوجيا Z-ستاك، الفحص المجهري متحد البؤر يمكن استخدامها لعينات تصل إلى 100-200 ميكرون. تختلف الصلبة في سمك بين 0.3 ملم وراء الإدراج العضلات و 1 مم في القطب الخلفي 11. على حد سواء بسبب سماكة، والغموض، والصلبة ليست مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر باستخدام الطرق التقليدية.

لتصحيح هذا، كانت مغلفة الأنسجة الصلبة للسماح للتحليل مع المجهر متحد البؤر. هذه التقنية مفيدة لاكتساب فهم أفضل الحالات الفسيولوجية والمرضية في كل من الصلبة الإنسان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب إعادة النظر في استخدام الأنسجة البشرية والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية أو ما يعادلها. وتمت الموافقة على العمل الموصوف هنا من قبل لجنة الأخلاق المحلية وحصل على موافقة للفحص العلمي. تم تنفيذ هذا العمل وفقا لإعلان هلسنكي. تم الحصول على عينات الصلبة الإنسان عن أعين الجهات المانحة العالم (الحد الأقصى بعد الوفاة الوقت 24 ساعة) في بنك العيون من قسم طب العيون في جامعة كولونيا، ألمانيا.

1. إعداد التجريبية

  1. إعداد 96٪ من الإيثانول والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنابيب مختلفة. إعداد الأجسام المضادة الأولية في التخفيف الموصى بها من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) والحفاظ على كل الحلول على الجليد. إعداد 100 ميكرولتر لكل عينة.
  2. تنظيف جميع الأدوات واستخدام المشارط الحادة. بعد تكرار قطع مع نفس مشرط، تغيير مشرط.
  3. الحصول على 1-2 ملقط COLIBRI، على التوالي مقص تشريح الصغيرة، و# 10 مشرطأو مشرط العيون ريشة صغيرة، وأربعة 26 الإبر G.
  4. لف رقائق الألومنيوم حول لوحة البوليسترين أو استخدام لوحة الفلين لتركيب الأنسجة. العمل تحت المجهر ستيريو مجهر. العمل العقيمة تحت تدفق الهواء الصفحي إذا لزم الأمر.

2. إعداد الصلبة

  1. عقد بلطف لمبة وإجراء نقب تثقيب من جانب القرنية والصلبة، ثم تدوير ينقب. تدوير ينقب بعناية وبشكل متساو على سطح لإجراء قطع مستديرة على حد سواء. استخدام ينقب الحجم 15.5 ملم. قطع إرفاق ملفات المتبقية مع مقص منحني. إزالة نقب القرنية والصلبة. وسيؤدي هذا لمبة فتح الأمامية.
    1. وضع الصلبة على مسحة مع الجزء المفتوح صعودا. إزالة شبكية العين والعنبية، وذلك باستخدام ملقط COLIBRI لسحب قبالة كل من طبقات (شبكية العين والعنبية) من الصلبة. لا تترك العنبية المصطبغة على الصلبة الداخلية. استخدام مقص منحنية لإزالة شبكية العين والعنبية من حليمة. إزالة عينيaining الملتحمة، عضلات العين، وكبسولة لسان من الصلبة سطحية.
  2. إزالة العينة الصلبة في الحجم المطلوب باستخدام نوع مستقيم مقص وملقط COLIBRI. يستغرق حوالي 2 سم 2 العينات الصلبة الحجم من مواقع مختلفة. ونظرا لصغر حجمها، وعقد الصلبة بلطف وقطع الحجم المطلوب كما الساحات باستخدام مقص من النوع الثابت. يحدد نقب القرنية والصلبة على الحافة الأمامية من العينات الصلبة.
    1. تجنب تكرار الاستيلاء مع ملقط كمنطقة حيث النسيج وانتزع ليست مناسبة لتحليل الفحص المجهري متحد البؤر. إعداد العدد المطلوب من العينات تبعا لنوع التجربة (على سبيل المثال الأمامية مقابل الخلف، مقارنة الشكل 1) وكمية من الأجسام المضادة المستخدمة.
  3. وضع العينات في أنابيب 1.5 مل لاستخدامها لاحقا. إصلاح عينات في 1.5 مل 96٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل لهم ثلاث مرات كل لمدة 5 دقائقفي 1.5 مل برنامج تلفزيوني على شاكر. إذا كان يعمل مع الأنسجة المجمدة، تنفيذ هذه الخطوة قبل المفاجئة التجميد.
  4. استخدام أنسجة جديدة. ومع ذلك، إذا لم يكن ذلك ممكنا، والمفاجئة تجميد الصلبة في النيتروجين السائل والاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. إذا كان يعمل مع الأنسجة المجمدة، ذوبان الجليد قبل الاستخدام. تجنب الذوبان المتكررة ودورات التجمد.
  5. الحفاظ على كل عينة في برنامج تلفزيوني تحتوي على 1.5 مل 5٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. هذه الخطوة يؤدي الى تورم في العينة التي هي مفيدة للالترقق، ويمنع أيضا ملزم غير محددة.
  6. بعد عينات تضخمت، وإعداد الساحات الصلبة لالتصفيح. العمل تحت المجهر، على سبيل المثال المجهر ستيريو مجهر. يلصق العينات الصلبة الخلفي لغشاء البوليسترين ملفوفة في رقائق الألومنيوم أو لوحة الفلين باستخدام 26 الإبر G.
  7. ثني الحواف من الإبر حتى لا تتداخل مع المجال البصري تحت المجهر.
  8. صفح عصيدة الصلبة كامل سماكةليه.
    1. أولا، عقد حافة الصلبة الأمامية باستخدام ملقط COLIBRI. ثم قطع بعناية طبقة رقيقة من الصلبة السطحية باستخدام مشرط رقم 10، ريشة صغيرة مشرط العيون، أو شفرة الملعقة. عقد مشرط أفقيا وقطع الطبقة السطحية كما رقيقة ممكن من الطبقة الأساسية.
    2. تشريح طبقة الصلبة رقيقة من الساحة الصلبة. هذه الطريقة هي مماثلة لتقنيات جراحية القياسية لإعداد رفرف خلال trabeculectomy ويجب أن تؤدي إلى طبقات سميكة 30-80 ميكرومتر (قارن الشكل 2).
  9. منع جفاف الصلبة عن طريق إضافة كميات صغيرة من برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة، وعلى سبيل المثال 50 ميكرولتر PBS باستخدام ماصة.
  10. وضع طبقات مقطعة إلى 100 ​​ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 96 لوحة جيدا وتسمية كل من التوجه (نحو خارجي والمتدرب) وطبقة (سطحية وعميقة) على سبيل المثال مع لون ماء.
  11. كرر الخطوات من 2،7-2،9 حتى يتم مغلفة النسيج بالكامل.

3. تنفيذ المناعية

  1. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المطلوبة في التخفيف الموصى بها. هنا، على سبيل المثال استخدام CD 31 (الماوس وحيدة النسيلة المضادة البشرية) وLYVE1 الأجسام المضادة (أرنب المضادة البشرية)، وكلاهما في التخفيف من 1: 100 في برنامج تلفزيوني (التي تحتوي على 2٪ BSA) واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل. لتغيير المتوسطة في 96 لوحة جيدا، عقد ماصة لجدار البئر وإزالة السوائل.
  2. في اليوم التالي، وغسل العينات ثلاث مرات كل لمدة 5 دقائق مع 200-300 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني على شاكر. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المقابلة؛ هنا استخدام الماعز المضادة الماوس فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) والماعز المضادة أرنب cyanine الأصباغ 3 (و Cy3)، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. تمييع الأجسام المضادة الثانوية 1: 300 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ مصل الماعز.
  3. شطف العينات مرة أخرى ثلاث مرات كل لمدة 5 دقائق في 200-300 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني على شاكر.
  4. أداء تلطيخ نواة، على سبيل المثال . 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) (تخفيف 1: 2000، 100 ميكرولتر في كل بئر واحتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة)، ثم يغسل مرة أخرى 2 مرات في 200-300 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني على شاكر.
  5. نقل العينات على شرائح المجهر، تضمينها في 1-2 قطرات من تصاعد المتوسط ​​الفلورسنت، إضافة ساترة، وختم ذلك من خلال تغطية حواف مع الورنيش الشفاف، وتخزينها في 4 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا أو فحص مباشرة الشرائح مع متحد البؤر مجهر.
  6. استخدام المجهر متحد البؤر (أو ما يعادلها) لتحليل العينات. استخدام التكبير المطلوب، على سبيل المثال 10-40X التكبير.
  7. للتحقق من سمك العينات، قياس مع المجهر متحد البؤر باستخدام Z-الأكوام. كمية أقسام الصلبة الممكنة يعتمد على مكان وجود الصلبة، ويختلف سمك استوائيا والخلف (قارن المقدمة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في تجارب تمثيلية يؤديها هنا، وهناك فوائد ثابتة مستمدة من استخدام هذه التقنية الترقق معينة. وتوضح التجربة الأولى للشبكة متنوعة من الضفيرة الأوعية الدموية فوق الصلبة في ثلاث صور الممثلة (الشكل 3). الأوعية إيجابية لCD31.

وتبين التجربة الثانية الخلايا المناعية، ولا سيما LYVE1 + خلايا ظاهر الصلبة وعلاقتها CD31 الأوعية الدموية إيجابي. هن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تغليف الصلبة الإنسان هو وسيلة لأداء متحد البؤر المجهر على هذا النسيج. خطوة حاسمة في هذه العملية هو استخدام الإيثانول بدلا من الفورمالين للصق الأنسجة. في تجربتنا، ويتم الحصول على نتائج أفضل عند استخدام الإيثانول بدلا من الفورمالين لتثبيت. المشارط حادة تفاقم الإجراء وينبغي تجنبها. وبالمثل، فإن جفاف الصلبة يجب تجنبها، كما يعقد الداخلي ويقلل من جودة الصور.

وفيما يتعلق تلطيخ المناعى، والأجسام المضادة أخرى غير تلك المط...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولم يعلن المؤلفون عن أي إفصاحات مالية. محتويات هذه المقالة هي مسؤولية المؤلفين وحدهم.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مؤسسة الأبحاث الألمانية (FOR2240 "تكوين الأوعية الدموية (الليمفاوية) والمناعة الخلوية في الأمراض الالتهابية للعين" إلى CC و LMH ؛ HE 6743 / 2-1 و HE 7643 / 3-1 إلى LMH ؛ CU47 / 6-1 إلى CC) ، ومساعدة السرطان الألمانية (إلى LMH و CC) ، وبرنامج GEROK جامعة كولونيا (إلى SLS و LMH) ، و EU COST BM1302 "توحيد القوى لتجديد القرنية" (إلى CC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96٪ إيثانولميرك للكيماويات ، دارمشتات ، ألمانياP075.4
مجهر ستيريو مجهر   ؛Motic, Hongkong, الصينn.a
26 G الإبر Terumo, Leuven, Belgium303800
15.5 mm trepanGeuder, Heidelberg, Germanyn.a
no.10 مشرط ريشة ، pfm الطبية ، أوساكا ، اليابان2E + 08
مشرط العين ريشة صغيرة  ريشة ، pfm الطبية ، أوساكا ، اليابانرقم 7657BR
CD 31 الجسم المضاد (الفأر أحادي النسيلة مضاد للإنسان)داكو ، الولايات المتحدة الأمريكيةIR610
LYVE1 الجسم المضاد   (أرنب متعدد النسيلة مضاد للإنسان)Zytomed ، ألمانياRBK014-05
الماعز المضاد للفأر الأجسام المضادة FITCSigma Aldrich ، شتاينهايم ، ألمانياF0257
الماعز المضاد للأرانب Cy3 الجسم المضادDianov ، ألمانيا111-165-003
مصل الماعز العاديDako ، Glostrup ، الدنماركX090710-8
DAPICarl Roth GmbH ، كارلسروه ، ألمانيا6335.1
مجهر الشرائح Engelbrecht, Edermü nde ، ألمانياWC7695002
Coverslips 24 مم × 24 ممTh. Gayer ، Lohmar ، ألمانيا7695026
DAKO الفلورسنت تصاعد المتوسطة DAKO, الولايات المتحدة الأمريكيةS3023
LSM Meta 510 المجهر متحد البؤر Carl Zeiss AG ، جينا ، ألمانياn.a

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
  2. Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
  3. Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
  4. Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
  5. Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
  6. Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
  7. Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
  8. Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
  9. Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
  10. Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
  11. Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. The sclera. , Springer. (2012).
  12. Kiss, F. Der Blutkreislauf des Auges. Ophthalmologica. 106, 225(1943).
  13. Ashton, N. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
  14. Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
  15. Ashton, N. Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
  16. Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
  17. Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
  18. Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
  19. Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
  20. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
  21. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal MicroscopyHuman ScleraLaminating TechniqueImmunohistochemistryCD31 MarkerLYVE1 MarkerTissue FixationPBS WashingFluorescent MountingZ Stack Imaging

Related Articles