نموذج مثالي لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية للبالغين هو بصيلات شعر الفأر. نقدم هنا بروتوكولا لعزل مجموعات مختلفة من بصيلات الشعر والخلايا الجذعية والخلايا الكيراتينية للبشرة ، باستخدام الهضم الأنزيمي للجلد الظهري للفأر متبوعا بتحليل FACS.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل بصيلات الشعر الخلايا الجذعية والخلايا الكيراتينية البشرة من الجلد الظهرية ماوس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد بصيلات الشعر (HF) نظاما مثاليا لدراسة بيولوجيا وتنظيم الخلايا الجذعية البالغة (SCs). يتم تجديد هذا العضو الصغير الديناميكي من خلال مجموعات مميزة من SCs ، والتي تقع في الجزء الدائم من HF ، وهي منطقة تعرف باسم الانتفاخ. تم تحديد هذه SCs الانتفاخية متعددة القدرات في البداية على أنها خلايا احتفاظ بتسمية التدوير البطيء. ومع ذلك ، فقد أصبح عزلها ممكنا بعد تحديد علامات خلوية معينة ، مثل CD34 والكيراتين 15 (K15). هنا ، نصف طريقة قوية لعزل الخلايا السرطانية المنتفاخة والخلايا الكيراتينية للبشرة من HFs للفأر باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). يمكن استخدام بصيلات الشعر المعزولة (HFSCs) في نماذج تطعيم مختلفة في الجسم الحي وهي نموذج قيم في المختبر لدراسة الآليات التي تحكم تعدد القدرات والسكون والتنشيط.
المقدمة
الخلايا الجذعية البالغة (المنبوذة) ضرورية للحفاظ على توازن الأنسجة عن طريق استبدال الخلايا الميتة وإصلاح الأنسجة التالفة على الاصابة. وتعرف هذه المنبوذة من خلال قدرتها على الخضوع المستمر تجديد الذات والتمايز إلى مختلف الأنساب الخلية 1-3. وتشمل أنظمة أفضل درس، التي تعتمد على المنبوذة الكبار للتجديد، ونظام المكونة للدم، والأمعاء والجلد 1،2،4.
خلال مرحلة التطور الجنيني، ويبدأ الجلد وطبقة واحدة من خلايا البشرة. التشكل من بصيلات الشعر (HF) يبدأ عندما إلى ملء خلايا اللحمة المتوسطة الجلد وتشكل الأدمة الكولاجينية الكامنة 5. المتخصصة خل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وزارة اسرائيل من الصحة. تم التعامل مع كل من الحيوانات وفقا لوافقت على بروتوكول رعاية الحيوان المؤسسية IL-02302-2015 معهد التخنيون إسرائيل للتكنولوجيا.
1. إعداد التجريبية
- إعداد بالكلاب مصل بقري جنيني
ملاحظة: الخلايا الظهارية حساسة جدا للكالسيوم لذا فمن الأهمية بمكان للسيطرة على التعرض لهذه الخلايا إلى الكالسيوم. من أجل ضمان أن الخلايا لا يتعرض إلى الكالسيوم أثناء عمل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل تخصيب اليورانيوم وعزل نوعين من السكان: انتفاخ المنبوذة والخلايا الكيراتينية البشرة الشكل 2 يوضح الخطوات الرئيسية للبروتوكول. استخدام الجلد إزالتها من الظهرية الخلفي من 8 أسابيع الفئران القديمة، ونحن المخصب المنبوذة انتفاخ باستخدام علامة CD34، وهو ما يعبر عنه فقط في HFSCs. وهيئة السلع التموينية-1، التي تصف الكيراتينية في البشرة. ويبين الشكل 3 أنماط مختلفة من CD34 وهيئة السلع التموينية-1 ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بروتوكول الموصوفة هنا راسخة لعزل HFSCs من الجلد الظهري للفئران بالغة ولكن يمكن أن تطبق بالتساوي لعزل السكان الآخرين داخل بنية HF، استنادا إلى التحديد من علامات 2،16،23،28،29. هذا الأسلوب هو خصوصا مفيد أكثر من غيرها من أساليب عزل الخلايا، مثل التفكك الأنسجة، في أن نوع خلية معينة يمكن تحديدها والتي تحصد من خليط من السكان الخلية غير المتجانسة. وعلاوة على ذلك، فإن الطريقة الموصوفة هنا هو سريعة وموثوق بها، ويمكن استخدامها لعزل ما يصل إلى أربعة السكان HFSC مختلفة على أساس مست.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يعلنون عنه
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة RO1GM60124 (إلى HS). HS هو باحث في معهد هوارد هيوز الطبي. Y.F. مدعوم من قبل كرسي Deloro للتقدم الوظيفي والمؤسسة الألمانية الإسرائيلية (I-2381-412.13 / 2015). DS مدعوم من قبل زمالة Coleman-Cohen لما بعد الدكتوراه.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| إيزوفلوران | الرعاية الحرجة البدائية | 66794-017-10 | |
| ثاني أكسيد الكربون | - | ||
| ماكينة حلاقة كهربائية | Oster ؛ | يمكن استخدام ماكينة الحلاقة | الذهبية A5 |
| 70٪ إيثانول | Gadot Lab | 830000051 | 96٪ إيهتانول مخفف بالماء المقطر ؛ |
| أدوات التشريح من | أي مزود | ||
| Fallps | Dumont | 11251-10 | Foreceps من أي شركة أخرى يمكن استخدامها |
| Scissors ؛ | مقص Dumont | 14094-11 | من أي شركة أخرى |
| الإبر / الدبابيس | - | ||
| مشرط | ألبيون | 10 | تأكد من أن المشرط يحتوي على طرف غير حاد |
| طبق زراعة الأنسجة 60 مم × 15 مم | سيجما ألدريتش | CLS430166 | |
| PBS | في المنزل PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم | ||
| 0.25٪ التربسين / EDTA | الصناعات البيولوجية | 03-050-1A | قد يكون للتربسين الذي تم الحصول عليه من شركة مختلفة نشاط مختلف ويجب تعديل مدة هضم التربسين وفقا لذلك |
| الماصات 10 مل | سيجما ألدريتش | كورنينج ، 4488 | |
| ثلج | - | ||
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي المعقمة | Minplast Ein-shemer | 35050-43 | |
| 70 & micro ؛ م مصفاة الخلية | فيشر | 22362548 | |
| 40 & م مصفاة الخلية | فيشر | 22362549 | |
| تلطيخ عازلة | الطرد | ||
| المركزي | Eppendorf 5804 R | 5805 000.017 | |
| أنابيب FACS مع أغطية مصفاة الخلية ؛ | فالكون | 352235 | |
| أنابيب FACS | فالكون | 352063 | |
| Integrin & beta ؛ 1 | eBioscience | 25-0291 | 1: 400 |
| Integrin & alpha ؛ 6 | eBioscience | 15-0495 | 1:600 |
| Sca I | eBioscience | 11-5981 | 1:200 |
| CD34 | eBioscience | 9011-0349 | 1:300 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 50 نانوغرام / مل |
| جاف Chelex | BioRad | 142-2842 | |
| Beaker | بيركس | المقطر | |
| H2O | - | ||
| شريط التحريك | - | ||
| NHCl | BioLab | 1903059 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) يمكن | استخدام Beit Haemek Biological Industries | 400718 | FBS التي تم الحصول عليها من شركة مختلفة |
| زجاجية سعة 1 لتر | Ilmabor | Boro 3.3 | |
| فلتر علوي للزجاجة | Autofil | 1102-RLS |
المراجع
- Wagers, A. J., Weissman, I. L. Plasticity of adult stem cells. Cell. 116, 639-648 (2004).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
