الفئران هند الاطراف طويل العظام تشريح ونخاع العظم عزل

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا لتشريح العظام الطويلة للأطراف الخلفية (عظم الفخذ والساق) من فأر المختبر. نصف أيضا تقنية سريعة لعزل نخاع العظم من هذه العظام والتي تستخدم الطرد المركزي لإزالة نخاع العظم من مساحة نخاع العظم.

الملخص

يعد التحقيق في العظام ونخاع العظم أمرا بالغ الأهمية في العديد من المجالات البحثية بما في ذلك بيولوجيا العظام الأساسية ، وعلم المناعة ، وأمراض الدم ، ورم خبيث للسرطان ، والميكانيكا الحيوية ، وبيولوجيا الخلايا الجذعية. على الرغم من أهمية العظم في الحالات الصحية والمرضية ، إلا أنه عضو لم يتم بحثه بشكل كبير بسبب نقص المعرفة المتخصصة بتشريح العظام وعزل نخاع العظم. الفئران هي كائن حي نموذجي شائع لدراسة التأثيرات على العظام ونخاع العظام ، مما يستلزم طريقة موحدة وفعالة لتشريح العظام الطويل وعزل نخاع العظام لمعالجة الأفواج التجريبية الكبيرة. نصف إجراء تشريح مباشر لإزالة عظم الفخذ والساق المناسب للتطبيقات النهائية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر التحليل النسيجي واختبار القوة. بالإضافة إلى ذلك ، نحدد إجراء سريعا لعزل نخاع العظم عن العظام الطويلة عن طريق الطرد المركزي مع وقت معالجة محدود ، وهو مثالي لفرز الخلايا ، وزراعة الخلايا الأولية ، أو استخراج الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتين. تم تبسيط البروتوكول للمعالجة السريعة للعينات للحد من الخطأ التجريبي ، ويتم توحيده لتقليل التباين من مستخدم إلى آخر.

المقدمة

تعد دراسة العظام الطويلة وخلايا نخاع العظم أمرا أساسيا لعدد لا يحصى من التخصصات البحثية ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، بيولوجيا العظام ، وبيولوجيا السرطان ، وعلم المناعة ، وأمراض الدم ، والميكانيكا الحيوية. العظم هو عضو ديناميكي للغاية يشكل مع الغضروف الهيكل العظمي لتوفير الدعم الميكانيكي ضد تحميل الأعضاء الداخلية وحمايتها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المكونات المعدنية للعظام هي حوض تخزين لجزيئات الإشارات الحرجة الكالسيوم والفوسفور ، بالإضافة إلى عوامل أخرى¹. أخيرا ، تحتوي العظام على نخاع العظام ، جنبا إلى جنب مع بانيات العظم المكونة للعظام النشطة الأيضية وناقضات العظم الممتصة للعظام ، توفر مكانة الخلايا الجذعية اللازمة للحفاظ على مجموعات الخلايا المكونة للدم واللمفاوية.

تتأثر نخاع العظام والعظم في العديد من الاضطرابات ، مما يؤدي غالبا إلى خلل وظيفي في نخاع العظم ، وآلام شديدة في العظام ، وكسر مرضي. العظام هي موقع شائع للورم الخبيث في العديد من الأورام الصلبة ، وأبرزها سرطان الثدي وسرطان البروستاتا ، حيث تشرك الخلايا السرطانية مباشرة في نخاع العظم لبدء الحلقة المفرغة للورم الخبيث في العظام وإزاحة الخلايا الجذعية المكونة للدم^2،3. تتميز الأورام الخبيثة المكونة للدم بما في ذلك الورم النقوي وسرطان الدم بخلل في نخاع العظام بالإضافة إلى عدم تنظيم إعادة تشكيل العظام الصحية¹. تعد اضطرابات الهيكل العظمي الأخرى غير الخبيثة أيضا مجالات بحثية نشطة ، مثل هشاشة العظام وهشاشة العظام والجنف والكساح. حتى في الفرد السليم ، يؤدي الفشل الميكانيكي الحيوي في العظام إلى كسر مؤلم. تمثل كل هذه الاضطرابات مجالات بحثية نشطة بهدف تحديد تدابير وقائية وأنظمة علاجية جديدة للحد من المراضة والوفيات.

للبحث عن عدد كبير من أدوار العظام ونخاع العظام ، في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية ، من الأهمية بمكان أن يكون لدى الباحثين طريقة موحدة بسيطة وفعالة لتشريح عظام الفأر الطويلة للمعالجة السريعة للتجارب الكبيرة في الجسم الحي. بروتوكول التشريح الموضح هنا مناسب لجميع تحليلات العظام الطويلة بما في ذلك التصوير خارج الجسم الحي ، وعلم الأنسجة ، وقياس الأنسجة ، واختبار القوة ، من بين أمور أخرى. وبالمثل ، فإن طريقة عزل نخاع العظم الموحدة مع ارتفاع استعادة خلايا نخاع العظم والتباين المنخفض بين المستخدمين مهمة للتحليل التجريبي مثل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) بالإضافة إلى التطبيقات النهائية مثل زراعة الخلايا الأولية لخلايا نخاع العظام.

البروتوكول

وقد وافق كل عمل الحيوانية رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة.

تشريح 1. هند الاطراف طويل العظام

1. الموت ببطء الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
2. ضع الماوس في موقف ضعيف ويضعوا التي تعلق كل أربع أرجل من خلال منصات الماوس مخلب أدناه مفصل الكاحل.
3. رذاذ الفأر مع 70٪ من الإيثانول، يسكب دقيق الساقين.
4. إجراء شق صغير على يمين خط الوسط في أسفل البطن، وذلك فوق الورك.
5. تمديد شق أسفل الساق والماضي مفصل الكاحل.
6. سحب الجلد وقطع عضلة الفخذ ترتكز على نهاية القريبة من عظم الفخذ لفضح الجانب الأمامي من الفخذ ويعلقون الخروج من المحطة، ووضع دبوس في زاوية 45 درجة من المجلس.
7. مع هؤلاء الاشخاص(ه) من مقص ضد الجانب الخلفي من الفخذ، وقطع أوتار الركبة بعيدا عن مفصل الركبة.
8. سحب الجلد والعضلات في اوتار الركبة ترتكز على نهاية القريبة من عظم الفخذ لفضح الجانب الخلفي من الفخذ ويعلقون الخروج من المحطة، ووضع دبوس في زاوية 45 درجة من المجلس.
9. مع ملقط، عقد نهاية البعيدة للعظم الفخذ، وذلك فوق مفصل الركبة. توجيه شفرات المقص على جانبي جسم الفخذ نحو مفصل الورك، والحرص على عدم قطع في عظمة الفخذ نفسها.
10. بعد الوصول إلى رأس الفخذ، التي أشار إليها مقص فتح قليلا، تحريف مقص مع شفرة العليا من مقص تتحرك مباشرة على رأس الفخذ إلى خلع عظم الفخذ، والحرص على عدم التقاط العظم تحت رأس الفخذ.
11. فهم الجزء العلوي من جسم الفخذ مع ملقط، وقطع الأنسجة اللينة بعيدا عن رأس الفخذ لتحريرها من الحق.
12. سحب عظم الساق بأكملها، بما في ذلكعظم الفخذ والركبة، والساق، وحتى بعيدا عن الجسم، قطع بعناية بعيدا النسيج الضام والعضلات التي تربط المحطة على الجلد.
13. تجهد مفصل الكاحل ومرة ​​أخرى استخدام مقص في حركة التواء لخلع الساق.
14. استيعاب النهاية البعيدة من الساق، مع الحرص على عدم قطع الأوتار، وسحب الساق وحتى بعيدا عن الجسم ومجلس دبوس.
15. قطع أي نوع من الأنسجة الضامة المتبقية ربط العظام الطويلة على الماوس عند الركبة.
16. إزالة أي عضلة إضافية أو النسيج الضام تعلق على عظم الفخذ والساق.
17. للحصول على أي التطبيقات التي تتطلب العظام لتبقى سليمة (علم الأنسجة، histomorphometry واختبار النشاط الحيوي، الخ.)، والمضي قدما مع البروتوكولات في المنزل القياسية (كما هو الحال في ^4-7). لعزل نخاع العظم، انتقل إلى القسم 2.

2. إعداد العظام الطويلة لنخاع العظم عزل

1. باستخدام ملقط، فهم عظم الفخذ مع الرضفة تواجه بعيداالثانية نهاية الداني (رئيس الفخذ) إلى أسفل.
2. تجهد مفصل الركبة واستخدام المقص في حركة التواء لخلع الساق والفخذ.
3. قطع أي النسيج الضام عقد عظم الفخذ والساق معا.
4. باستخدام ملقط، فهم عظم الفخذ مع الجانب الأمامي تواجه بعيدا والنهاية القريبة (الفخذ نهاية الرأس) أسفل.
5. توجيه مقص فوق رمح الفخذ إلى اللقم.
6. تناوب بلطف المقص ذهابا وإيابا لإزالة اللقم، الرضفة، والكردوس لفضح الكردوس.
7. إزالة أي عضلة إضافية أو النسيج الضام تعلق على عظم الفخذ باستخدام ملقط، مقص، وKimwipes.
8. باستخدام ملقط، فهم الساق مع الجانب الأمامي تواجه بعيدا والنهاية البعيدة (نهاية الكاحل) إلى أسفل.
9. إذا الكردوس قصبي غير سليمة، توجيه مقص فوق رمح الساق إلى اللقم.
10. تناوب بلطف المقص ذهابا وإيابا لإزالة اللقم والكردوس لفضح metaphيسيس.
11. إزالة أي عضلة إضافية أو النسيج الضام تعلق على الساق باستخدام ملقط، مقص، وKimwipes.

3. نخاع العظم عزل

1. دفع على إبرة G 18 من خلال الجزء السفلي من أنبوب 0.5 مل microcentrifuge ل.
2. وضع العظام الطويلة (بحد أقصى 2 عظام الفخذ والظنبوب 2) في أنبوب، وصولا في نهاية الركبة نهاية أسفل وإغلاق الغطاء.
3. عش أنبوب 0.5 مل microcentrifuge لفي أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
4. أنابيب الطرد المركزي المتداخلة في ≥10،000 x ج في microcentrifuge لمدة 15 ثانية.
5. تحقق من أن نخاع العظام قد خرجت العظام عن طريق التفتيش البصري. يجب أن تظهر عظام بيضاء، وينبغي أن يكون هناك بيليه البصرية كبير في أنبوب أكبر.
6. تجاهل أنبوب 0.5 مل microcentrifuge لمع العظام.
7. تعليق نخاع العظام في حل مناسب (على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني، وسائل الإعلام والثقافة، وFACS العازلة)، والمضي قدما في البروتوكول التجريبي (DNA، RNA، أو العزلة البروتين،تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، أو زراعة الخلايا الأولية).

النتائج

هو الأمثل لبروتوكول الموصوفة هنا لتشريح السريع لعظم الفخذ والساق الماوس مع حد أدنى من الأضرار التي لحقت الأنسجة والعظام. هذا الأسلوب هو مناسبة لعدد من التحليلات التحويلية، بما في ذلك دراسات الميكانيكا الحيوية، histomorphometry (الشكل 1A - B)، والأنسجة (الشكل 1C) ^4،7. وhistomophometric ممثل micoCT 3D إعادة الإعمار (الشكل 1A - B) يدل على أن كلا من العظام إسفنجي وقذيفة القشرية يتم الاحتفاظ تسمح الكميات دقيقة من المعلمات الهيكلية موحدة لhistomorphometry العظام، بما في ذلك عدد التربيقي، سمك، والمباعدة بين الولادات. حجم العظام. وسماكة القشرية، ضمن تدابير أخرى ^8. يظهر مقطع تمثيلي نسيجية والثابتة الفورمالين وdecalcified الساق H & E الملون (الشكل 1C). توضح الصورة وسلامة كل من ب متكلسةواحد ونخاع العظام الخلوي للتحليل النسيجي.

الإجراء نخاع العظام العزلة يحافظ على عقم مساحة النخاع العظمي، له معالجة منخفضة للحد من التلوث، ولا يتطلب قطع من العظام الطويلة، وبالتالي تقليل فقدان العائد نخاع العظام. هذا نخاع العظم هو مناسبة للعديد من التطبيقات المصب، بما في ذلك التدفق الخلوي ⁵ و PCR تحليل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الإجراء يمكن أن تستخدم لعزل نخاع العظام للثقافة الخلية الأولية من خلايا نخاع العظام، بما في ذلك الخلايا الآكلة وبانيات (الشكل 2A - B) ^4،6.

الشكل 1. Histomorphological والتحليلات النسيجية من الماوس لونغ العظام. إعادة الإعمار microCT ثلاثي الأبعاد من الساق الماوس تظهر (أ) قذيفة القشرية الخارجية و (ب ترونج>) العظام تربيقية (مقياس بار = 0.5 ملم). (C) نسيجية H & E وصمة عار على الساق decalcified ومقطوع (4X). صور من باب المجاملة كاثرين Weilbaecher، جامعة واشنطن مدرسة الطب، الولايات المتحدة الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الابتدائية نخاع العظم الثقافة الخليوي لتمايز الخلايا الآكلة وبانيات. تلطيخ (A) TRAP لالآكلة متعددة النوى بعد 7 أيام في وسائل الإعلام osteoclastogenic (4X). (ب) الفوسفاتيز القلوية (اللون الأرجواني) لبانيات والأحمر الأليزارين (اللون الأحمر) وصمة عار لتمعدن بعد 21 يوما في وسائل الإعلام عظمي المنشأ. صور من باب المجاملة كاثرين Weilbaecher، جامعة واشنطن مدرسة الطب، الولايات المتحدة الأمريكية.ديزيل / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

نقدم طريقة بسيطة وفعالة لإزالة العظام الخلفية الطويلة للفأر وعزل نخاع العظم اللاحق. تحافظ هذه الطريقة على السلامة الهيكلية والخلوية العالية للعظام ونخاع العظام ولها وقت معالجة منخفض ، مما يقلل من احتمالية حدوث كسر أو تسجيل العظام الناجم عن المستخدم والذي قد يؤثر على التحليلات النهائية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة الطرد المركزي لعزل نخاع العظم لا تتطلب قطع العظم لفضح مساحة نخاع العظم أو السائل لطرد نخاع العظم ، مما يقلل من نقاط التلوث المحتملة. علاوة على ذلك ، فإن تقنية أجهزة الطرد المركزي عالية الإنتاجية نسبيا مع وقت عملي أقل من الطرق الأخرى ، وبالتالي تقليل وقت المعالجة.

التباين الكبير متأصل في دراسات الفئران في الجسم الحي بسبب التباين العالي في النمط الظاهري من الفأر إلى الفأر. من أجل تعظيم التأثير البحثي لدراسات الفئران باهظة الثمن وكثيفة العمالة ، من الأهمية بمكان تقليل الخطأ التجريبي التقني^9،10. يقدم الوقت من التضحية بالحيوان إلى التحليل النهائي أو تثبيت الأنسجة تباينا تجريبيا قد يتغلب على التغييرات الطفيفة ويقلل من الاختلافات الكبيرة بين المجموعات. لذلك ، تعد المعالجة السريعة للعينات ضرورية لتحليل البيانات بدقة. تم تحسين تقنيات تشريح العظام الطويلة وعزل نخاع العظم الموضحة هنا للمعالجة السريعة للحيوانات والعينات لتقليل التباين التقني.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث ، بما في ذلك فحص أنسجة العظام نفسها أو استجواب خلايا نخاع العظم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا النهج المباشر لتشريح العظام الطويل سيمكن الباحثين في المجالات ذات الصلة من استجواب مساهمات العظام مباشرة من أجل توسيع معرفتنا بالخلل الوظيفي في نخاع العظم في الأمراض غير المدروسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اللوح
70
الإيثانول
ملقط
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 G إبرة
1.5 مل أنبوب
الدقيق 0.5 مل أنبوب