مقالة منهجية

عزل وتوصيف من الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا حيوانية وجود الجذعية خصائص الخلية

DOI:

10.3791/53958

⸱

مايو 11, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCBL1, UMR/CNRS 5822, Laboratoire de Radiobiologie Cellulaire Moléculaire, Université de Lyon, 2Hospices-Civils-de-Lyon, Centre Hospitalier Lyon-Sud

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح فهم دور الخلايا الجذعية الشبيهة بالسرطان في تكرار الورم ومقاومة العلاجات موضوعا ذا أهمية كبيرة في العقد الماضي. توضح هذه المقالة عزل وتوصيف السكان الفرعيين للخلايا الشبيهة بالجذع السرطاني من خطوط خلايا سرطان الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من التقدم في فهم الرأس والعنق سرطان الخلايا الحرشفية (HNSCC) تقدم، يبقى معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات منخفضا بسبب تكرار المحلية والانبثاث البعيد. إحدى الفرضيات لتفسير هذا تكرار هي وجود سرطان خلايا شبيهة بخلايا المنشأ (الجذعية السرطانية) التي تقدم chemo- الكامنة والإذاعة المقاومة. من أجل وضع استراتيجيات علاجية جديدة، فمن الضروري أن يكون هناك نماذج التجريبية التي تحقق فعالية من العلاجات المستهدفة، وبالتالي لديها وسائل موثوق بها لتحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية. تحقيقا لهذه الغاية، نقدم بروتوكول لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا HNSCC الإنسان أن يعتمد على مزيج من اثنين من sortings المتعاقبة الخلية التي يقوم بها مضان خلية تنشيط الفرز (FACS). ويستند أول واحد على الممتلكات الخلايا الجذعية السرطانية إلى بإفراط ATP-التجليد كاسيت (ABC) بروتينات نقل، وبالتالي استبعاد، من بين أمور أخرى، والأصباغ الحمض النووي الحيوية مثل هويشت 33342. الخلايا فرزها مع الويتم تحديد طريقة ك "سكان الجانب" (SP). كما تمثل الخلايا SP نسبة منخفضة (<5٪) من الخلايا الأبوية، في مرحلة النمو أمر ضروري من أجل زيادة عددهم قبل الفرز الخلية الثانية. الخطوة التالية تسمح لاختيار الخلايا التي تمتلك اثنين من الخصائص الخلايا الجذعية HNSCC أخرى أي مستوى التعبير عال من علامة سطح الخلية CD44 (CD44 عالية)، والإفراط في التعبير عن نازعة ألدهيد (عالية ALDH). لأن استخدام علامة واحدة لديها العديد من القيود والعثرات لعزل الخلايا الجذعية السرطانية، والجمع ليرة سورية، وCD44 وعلامات ALDH توفر أداة مفيدة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية لمزيد من المقايسات التحليلية وظيفية تتطلب خلايا قابلة للحياة. تم التحقق من صحة خصائص تشبه الجذعية الخلايا الجذعية السرطانية في نهاية المطاف في المختبر عن طريق تشكيل tumorispheres والتعبير عن β-كاتينين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الرأس والرقبة الخلايا الحرشفية سرطان (HNSCC) هي خباثة مشتركة في جميع أنحاء العالم، وعلى الرغم من التقدم في العلاجات الحالية، والمرضى الذين يعانون من مرض متقدم لها بسوء التشخيص. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات الشامل للمريض حوالي 30٪ على الرغم من مزيج من الطرق العلاجية بما في ذلك الجراحة، العلاج الكيميائي، العلاج الإشعاعي والعلاجات المستهدفة. وتعزو الدراسات الحديثة تكرار المحلية والانبثاث البعيد لبقاء الخلايا السرطانية شبيهة بخلايا المنشأ (الجذعية السرطانية) بعد العلاجات المضادة للسرطان 1. وهناك أدلة تراكم دعم وجود خلايا تقديم الخلايا الجذعية خصائص (وضع غير متمايز، تجديد الذات والتمايز القدرات، والنشاط التيلوميراز) في الأورام الصلبة المختلفة بما في ذلك الثدي والدماغ والبروستاتا والرئة والقولون والبنكرياس والكبد والجلد 2- 10. ومع ذلك، فإن أصل الخلايا الجذعية السرطانية لا يزال من غير الواضح 11،12. ويمكن أن ينتج عن التحول السرطاني للخلايا الجذعية العادية 3،13 أو dedifferentiation من الخلايا السرطانية التي تحصل على ميزات الخلايا الجذعية السرطانية مثل 14،15. ولذلك، فهم مسارات مميزة تتعلق الخلايا الجذعية السرطانية ستوفر نظرة ثاقبة على تشخيص وعلاج HNSCC مقاومة في وقت مبكر.

وقد اقترح أن الخلايا الجذعية السرطانية تمتلك أيضا الظواهر مقاومة تتهرب من العلاج الكيماوي التقليدي والعلاج الإشعاعي، مما أدى إلى انتكاس الورم مقارنة مع الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية 16-19 وتكون مترجمة إلى نقص الأوكسجين الكوات 20. وقد اقترحت عدة عوامل لتفسير هذه المقاومة الخلايا الجذعية السرطانية، مثل الميل إلى السكون، وتعزيز إصلاح الحمض النووي، وآليات الرقابة دورة الخلية يصل التنظيم، والكسح الجذور الحرة 21. وعلاوة على ذلك، العديد من المسارات الجزيئية أنكجنيك قد يتم تفعيلها على وجه التحديد في الخلايا الجذعية السرطانية 17. من أجل تحسين المعرفة الخلايا الجذعية السرطانية مقابل العلاجات المستهدفة أبعد من ذلك، نحن بحاجة الى طرق يمكن الاعتماد عليها لتحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية، وذلك بسبب عدم تجانس علامات ذات الصلة الخلايا الجذعية فيأنواع مختلفة من السرطانات 22.

في HNSCC، وقف مثل تم عزلها الخلايا السرطانية بدء من أورام المريض الأساسي عن طريق فرز الخلايا معربا عن المؤشرات الحيوية CSC مختلفة (مثل هروب رأس المال المخدرات النقل التعبير 23، CD44 عالية، CD24 CD133 ارتفاع منخفض، ج-الأرصاد + النمط الظاهري 10،24، 25، أو ALDH ارتفاع النشاط 26) أو زراعة ورم المريض الأساسي لتشكيل squamospheres التي لها خصائص ديوان الخدمة المدنية. ومع ذلك، فإن عددا من squamospheres يقلل بشكل كبير بعد اثنين من الممرات، مما يعطي حجم العينة صغير لمزيد من التوصيف يدرس 27. لذلك، فحوصات في المختبر بدءا من خطوط الخلايا راسخة هو الحل الأسهل لتصميم التجارب من أجل تحسين المعرفة الخلايا الجذعية السرطانية.

والهدف من هذه المقالة هو اقتراح طريقة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا HNSCC باستخدام multiparametric تدفق cytometric التحليلالثانية خلية الفرز. التعبير عن CD44 في علاقة مع العديد من الخصائص الخلايا الجذعية السرطانية بما في ذلك النشاط ALDH، وتستخدم جانب السكان (SP) النمط الظاهري، والقدرة تشكيل كروي وtumorigenicity لعزل وتوصيف هذا شبه السكان الخلايا الجذعية السرطانية. CD44، وهو بروتين سكري سطح الخلية، وتشارك في التصاق الخلية والهجرة. وأعرب عن CD44 للغاية في كثير من الأورام الصلبة الخلايا الجذعية السرطانية 28، بما في ذلك سرطان الرأس والعنق نماذج 29-31. وعلاوة على ذلك، يمكن CD44 الخلايا عالية تولد في الجسم الحي الورم غير المتجانسة في حين الخلايا منخفضة CD44 لا يمكن 10. ويستند مقايسة SP على إمكانات التفاضلية من الخلايا لهروب رأس المال الصبغة هويشت 22 عن طريق الأسرة كاسيت ملزمة ATP (ABC) من البروتينات نقل overexpressed داخل غشاء ديوان الخدمة المدنية. ويشمل هذا الاختبار استخدام مثبطات نقل ABC مثل فيراباميل في عينات السيطرة. ألدهيد نازعة (ALDH) هو انزيم الخلايا التي تشارك في تحويل الريتينول إلى المتقاعدحمض inoic خلال الجذعية في وقت مبكر تمايز الخلايا 25،26. الخلايا التي تظهر ارتفاع ALDH عرض النشاط سلوك الخلية مثل الجذعية في HNSCC 26 وعدد قليل جدا من خلايا عالية ALDH قادرة على توليد أورام في الجسم الحي 26،32.

تم استخدام مزيج من هذه العلامات والخصائص بنجاح من قبل برتراند ه ر ال. لدراسة المقاومة في التجارب المختبرية والحية من هذه الخلايا الجذعية السرطانية إلى الفوتون والإشعاع 19 أيون الكربون. وأظهرت نتائجها بوضوح أن الجمع بين مختلف علامات الخلية وخصائص أكثر انتقائية للدراسات مفيدة على السكان HNSCC الخلايا الجذعية السرطانية من النهج علامة واحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية على رعاية الحيوان. تمت الموافقة على جميع تفاصيل هذه الدراسة من قبل CECCAPP، لجنة الأخلاق الفرنسية.

1. اختيار من السكان الجانب (SP) من قبل هويشت صبغ الدفق الفحص

  1. تلطيخ 50 مليون الخلايا مع هويشت 33342 صبغ.
    1. إعداد اثنين من 15 مل أنابيب معقمة مع قاع مخروطي الشكل: أنبوب واحد المسمى "هويشت" واحد المسمى "هويشت وفيراباميل". إعداد 10 مل من 5 ملي فيراباميل حل هيدروكلوريد في الماء المعقم. إعداد مستنبت (CM) للخلايا الجذعية.
      1. لإعداد CM لديوان الخدمة المدنية (CM-CSC)، والجمع بين ما يلي: Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM): F12 (1: 3، ت: ت)، و 5٪ من مصل العجل الجنين (FCS)، 0.04 ملغ / لتر من الهيدروكورتيزون و 100 U / مل من البنسلين، 0.1 غرام / لتر من الستربتومايسين، و 20 ميكروغرام / لتر من عامل نمو البشرة (EGFR).
    2. تحت غطاء تدفق الصفحي، ويعرض للتريبسين الخلايا. إزالة وسائل الاعلام، ويغسل مع الصورةterile الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA (0.5 جم / لتر) لقارورة 75 سم مربع. احتضان 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. وقف رد فعل عن طريق إضافة مستنبت المستخدمة في خط الخلية الوالدية. حساب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلية.
      1. لإعداد CM عن خط الخلية الوالدية (CM-P)، تكملة DMEM مع 10٪ FCS، 0.4 ملغم / لتر من الهيدروكورتيزون، 100 U / مل من البنسلين و 0.1 غرام / لتر من الستربتومايسين).
    3. تمييع تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.1.2 للحصول على 10 7 خلية / مل في CM-P. تقسيم تعليق خلية في أنابيب 2 إعداد: وضع 100 ميكرولتر (10 6 خلايا) في الأنبوب "هويشت وفيراباميل" و 4 مل (4 × 10 7 الخلايا) في أنبوب "هويشت".
    4. في عينة "هويشت وفيراباميل"، إضافة 10 ميكرولتر من 5 ملم فيراباميل هيدروكلوريد الحل (تركيز النهائي: 0.5 ملم) وتخلط بلطف. إضافة 5 ميكرولتر من 1 غرام / حل L هويشت (تركيز النهائي: 0.1 جم / لتر). في عينة & #34؛ هويشت "، إضافة 5 ميكرولتر من 1 غرام / لتر الحل لكل 10 6 خلايا (200 ميكرولتر الكل) هويشت من الآن فصاعدا، والحفاظ على عينات الحماية من التعرض للضوء المباشر باستخدام رقائق الألومنيوم.
    5. احتضان جميع الأنابيب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة. المزيج بلطف كل 15 دقيقة لمنع الخلايا من يستقر.
    6. أنابيب الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend كل بيليه مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
    7. أنابيب الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. و resuspend "هويشت وفيراباميل" بيليه في 500 ميكرولتر من 5 ملغم / لتر يوديد propidium (PI) المخفف في برنامج تلفزيوني العازلة و"هويشت" بيليه في 4 مل من 5 ملغ / لتر PI مخففة في العازلة في برنامج تلفزيوني.
    8. نقل الحلول العينة من خلال مصفاة 70 ميكرومتر خلية لإزالة الركام وجمع الخلايا وحيدة في أنابيب لامتصاص العينة على تدفق عداد الكريات. الاحتفاظ بعينات على الجليد وحماية من التعرض للضوء المباشر باستخدام رقائق الألومنيوم.
  2. أناتحلول من سكان جانبية باستثناء هويشت صبغ من قبل الفرز الخلية.
    1. أداء هويشت فصل الخلية سلبي على التدفق الخلوي فارز مع المعلمات التالية: ليزر الأشعة فوق البنفسجية (355 نانومتر)، 2 كاشفات على مسار الأشعة فوق البنفسجية ليزر مع هويشت الأزرق (450/50 BP) والأحمر هويشت (610/20 BP) مرشحات، و 2 جامعي.
      1. أولا، تحليل عينة "هويشت" التي هي بمثابة مراقبة إيجابية لتلطيخ وتدفق عداد الكريات انشاء.
      2. باستخدام برنامج الكريات، في إطار "ورقة عمل العالمي"، انقر على "مؤامرة نقطة" (الخامسة أعلى الصورة اليمنى) وإنشاء تخطيط في ورقة العمل العالمية. على تنسيق، مع النقر بالزر الأيمن، حدد FSC-A (مبعثر إلى الأمام) وعلى الإحداثي السيني، SSC-A (الجانب مبعثر) (الشكل 1A). في نفس الطريق، وإنشاء SSC-W مقابل SCC-H مؤامرة نقطة. في هذه مؤامرة نقطة الثانية، لإنشاء منطقة P1، انقر فوق "بوليجون بوابة" (الرابع عشر أعلى الصورة اليمنى) (الشكل 1B) 33.
        ملاحظة: إن المنطقة P1تشمل الخلايا واحد وتميز الحلل.
      3. اختياري: استبعاد PI خلايا إيجابية من خلال خلق FSC-A مقابل PI بوابات على P1. في هذه النقطة المؤامرة، حدد PI سلبي للسكان (P2) لاستبعاد PI الخلايا الميتة إيجابية.
      4. باستخدام برنامج الكريات، في إطار "ورقة عمل العالمي"، انقر على "مؤامرة نقطة" وإنشاء مخطط في ورقة العمل العالمية. على تنسيق، مع النقر بالزر الأيمن، حدد الأزرق هويشت-A وعلى الإحداثي السيني، أحمر هويشت-A. مع الحق في الضغط على السكان، حدد "إظهار السكان" و P1. في هذه مؤامرة نقطة، وخلق منطقة (P2) لتحديد الخلايا سلبي هويشت السكان الجانب صبغ (SP) الذي يظهر على شكل ذراع الجانب على الجانب الأيسر من السكان الرئيسي من الخلايا (الشكل 1C).
    2. تحليل العينة "هويشت" وجمع 10،000 الأحداث. للتأكد من أن P2 البوابة، التي تمثل السكان ليرة سورية، في وضع جيد، وتحليل عينة "هويشت وفيراباميل" (10000 الأحداث)لمراقبة اختفاء السكان SP (1D الشكل).
    3. جمع الخلايا السلبية SP هويشت صبغ في أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من CM-CSC أعد 1.1.1.1.
    4. في نهاية الفرز الخلية، الطرد المركزي تعليق خلية في 250 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف و resuspend بيليه مع 1 مل من CM-CSC. حساب عدد الخلايا فرزها باستخدام عداد الخلايا ونقل العدد المناسب من الخلايا إلى قارورة الثقافة (انظر الجدول 1). إضافة CM-CSC واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
    5. الحفاظ على الخلايا في الثقافة تحت نفس الظروف لمدة أقصاها 2 الممرات حتى يكون هناك ما لا يقل عن 5 × 10 7 خلايا (راجع الخطوة 3، "طريقة خلية ثقافة").

2. اختيار من CD44 عالية / ALDH عالية الفرعية السكان في مجال السكان التصنيف الجانبية لل

  1. تلطيخ 50 مليون من خلايا ليرة سورية مع كشف ALDH كيت وCD44 الجسم المضاد.
    1. إعداد سبعة 15 مل أنابيب معقمة وصفت على النحو التالي: "غير ملوثين" (أنبوب أ)، "CD44-APC" (أنبوب ب)، "IgG1-APC" (أنبوب ج)، "ALDH" (أنبوب د)، "ALDH وDEAB "(أنبوب ه)،" ALDH وCD44-APC "(أنبوب و)،" ALDH، DEAB وCD44-APC "(أنبوب ز). منع جميع الأنابيب والكواشف في 4 درجات مئوية خلال تلطيخ.
    2. إعداد عازلة مع 4.5 مل من العازلة 1 (الواردة في المجموعة) و 45 ميكرولتر من-APC CD44 (Allophycocyanin) الأجسام المضادة (التخفيف 1: 100). إعداد B العازلة مع 100 ميكرولتر من العازلة 1 و 1 ميكرولتر من IgG1-APC الأجسام المضادة (التخفيف 1: 100). إعداد عازلة C مع 4 مل من العازلة 1 و 20 ميكرولتر من كاشف لعدة.
    3. إعداد تعليق خلية من الخلايا مرتبة سابقا (الخطوة 1.2.5) في 10 7 خلية / مل. إضافة 100 ميكرولتر (10 6 خلايا) من خلية إلى تعليق أنابيب أ، ب، ج، و 4 مل (4 × 10 7 خلايا) لأنبوب و. لحظة لا تترك الخلايا في أنابيب د، ه) و (ز.
    4. أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على الخلايا في 250 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف و resuspend الكريات في أنابيب أ، ب، ج في 100 ميكرولتر من العازلة 1. إضافة 5 ميكرولتر من diethylaminobenzaldehyde (DEAB)، مثبط ALDH لأنابيب الإلكترونية وز.
      1. Resuspend الخلايا في الأنبوب و مع 4 مل كاشف C وعلى الفور نقل 100 ميكرولتر في أنابيب د، ه) و (ز. احتضان جميع الأنابيب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وحماية من التعرض للضوء المباشر باستخدام رقائق الألومنيوم. مزيج تعليق خلية بلطف قبل vortexing بعد 15 دقيقة لمنع الخلايا من تسوية.
    5. من هذه اللحظة، والحفاظ على أنابيب على الجليد وحمايتها من التعرض للضوء المباشر باستخدام رقائق الألومنيوم. الطرد المركزي جميع الأنابيب في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
    6. أنبوب و resuspend و في 4 مل والأنابيب و (ز) مع 100 ميكرولتر من العازلة ألف و resuspend أنبوب ج مع 100 ميكرولتر من العازلة B. لأنابيب أخرى، إضافة 100 ميكرولتر من العازلة 1. احتضان 10 دقيقة على 4 درجات؛ ج.
    7. الطرد المركزي جميع الأنابيب في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف. شطف مرة واحدة مع 1 مل من العازلة 1 (4 مل لأنبوب و) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. اعادة تعليق أنبوب و بيليه في 4 مل وجميع أنابيب أخرى في 1 مل من العازلة 1.
    8. نقل الحلول من خلال عينة 70 مصافى خلية ميكرون لإزالة الركام وجمع الخلايا وحيدة في أنابيب المناسبة لامتصاص العينة على تدفق عداد الكريات.
  2. عزل CD44 عالية ALDH السكان / ارتفاع الخلية بواسطة الإسفار المنشط الفرز الخلية.
    1. أداء CD44 عالية / ALDH خلية عالية فرز على التدفق الخلوي فارز مع المعلمات التالية: الليزر الأزرق (488 نانومتر) والليزر الأحمر (633 نانومتر) (1)، للكشف على طريق الليزر الأزرق مع فلتر FITC (530/30) (1)، كاشف على طريق الليزر الأحمر مع مرشح APC (660/20) و 2 جامعي.
    2. باستخدام برنامج الكريات، انقر على "دوت منظمة التحرير الفلسطينيةر "(خامس أعلى الصورة اليمنى) لإنشاء FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة نقطة كما هو موضح في قسم 1.2.1.2، للتحقق مورفولوجيا الخلايا وحدد السكان يتألف من خلايا وحيدة مع SSC-W مقابل SSC-H نوع من الرسم البيانى الأحصائى.
    3. باستخدام برنامج الكريات، في إطار "ورقة عمل العالمي"، انقر على "مؤامرة نقطة" وإنشاء مخطط في ورقة العمل العالمية. على تنسيق، مع النقر بالزر الأيمن، حدد APC-A وعلى الإحداثي السيني، FITC-A من أجل تحديد السكان الملون مزدوج. إنشاء بوابة باستخدام أنابيب d و e لتحديد الخلايا عالية ALDH (الشكل 2A). ملاحظة: خلايا الإيجابية تختفي في أنبوب البريد تعامل مع DEAB (الشكل 2B).
      1. على نفس الرسم البياني، إنشاء بوابة ثانية باستخدام أنابيب ب و ج من أجل تحديد خلايا عالية CD44 (الشكل 2C و 2D). تختفي خلايا إيجابية في أنبوب يحتوي على IgG1-APC. تحليل أنابيب f و g وإنشاء بوابة الثالثة التي تضم CD44 عالية / ALDH <سوب> خلايا عالية (الشكل 2E و2F).
        ملاحظة: إذا خلايا إيجابية موجودة في أنبوب يحتوي على IgG1-APC (الشكل 2D)، والتفاعل بين الخلايا والأجسام المضادة الملون APC-ليست محددة.
    4. جمع CD44 عالية / ALDH خلايا عالية في أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من CM-CSC. جمع أيضا انخفاض CD44 / ALDH أدنى مستوى في أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من CM 19. ملاحظة: إعداد CM-CSC كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.1.
    5. الطرد المركزي تعليق خلية في 250 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف و resuspend بيليه مع 1 مل من CM-CSC. حساب عدد الخلايا فرزها.

3. خلية أسلوب ثقافة

  1. بعد المزدوج فرز الخلايا كما هو موضح أعلاه، لوحة الخلايا التي تم فرزها في ثقافة قارورة المناسبة (الجدول 1) مع CM-CSC عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. بعد 18-24 ساعة،معرفة ما اذا انضمت الخلايا وتغيير ثقافة المتوسط. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 3 أيام حتى المستعمرات توسيع أكبر من 50٪ متموجة.
  2. استخدام حجم مناسب من التربسين 0.5 غرام / لتر - EDTA (الجدول 1) يعرض للتريبسين الخلايا من قارورة الثقافة. احتضان خلايا 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة حجم مناسب من CM-CSC (الجدول 1) إلى وقف عمل التربسين.
  3. حساب عدد الخلايا التي تم الحصول عليها ولوحة 4 × 10 5 خلايا في قارورة الثقافة 175 سم ² مع CM-CSC. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. في هذا التركيز، فإن الخلايا مع مضاعفة زمن قدره 24 ساعة يكون 70٪ متكدسة في 7 أيام.
  4. استخدام الخلايا الجذعية السرطانية لفي المختبر أو في التجارب المجراة قبل أن خضعت 3 الممرات.

4. التأكيد على إمكانية ورم وخصائص CSC

  1. ورم المجال تشكيل لتأكيد إمكانية ورم من CD44 عالية / ALDHخلايا عالية.
    1. يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في 3.2. إضافة 1 × 10 6 خلايا لأنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه في DMEM: F12 (3: 1) FCS المتوسطة مجانا، 20 نانوغرام / مل من rhEGF، 4 ملغم / لتر من الهيبارين و1X B27. احتضان الخلايا في 6 المنخفضة جيدا لوحات مرسى الثقافة قارورة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
      ملاحظة: استخدام DMEM: F12 (3: 1) متوسطة تحتوي على 5٪ من FCS، 20 نانوغرام / مل من rhEGF، 4 ملغم / لتر من الهيبارين و1X B27 إذا كانت الخلية التي لا تنمو دون FCS.
    2. مراقبة تشكيل الورم المجال مع المجهر الضوئي 4-10 أيام بعد البذر (الشكل 3A).
      ملاحظة: يجب أن تكون ورم المجال قطرها أكثر من 35 ميكرون. سوف CD44 عالية ALDH خلية / عالية تظهر تكوين المجال بشكل أسرع وأكثر المحسنة الورم من حيث العدد والحجم بالمقارنة مع CD44 منخفض منخفض / ALDH.
  2. تقييم في فيفو Tumorigenicity بعدحقن تحت الجلد CD44 ارتفاع الخلايا عالية / ALDH في الفئران-NOD SCID.
    1. بعد الفرز، وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني في ثلاثة تركيزات مختلفة (10 4 خلية / مل، 10 5 خلية / مل، و 10 6 خلية / مل). حقن تحت الجلد 100 ميكرولتر من 10 4 خلية / مل (10 3 خلايا) في منطقة الجهة اليمنى من 6 الفئران. تفعل الشيء نفسه لمدة 10 5 خلية / مل (10 4 خلايا)، و 10 6 خلية / مل (10 5 خلايا).
      ملاحظة: تخفيف أقل مما يمكن اختبار 10 3 خلايا.
    2. حقن نفس التركيز من CD44 الخلايا منخفضة منخفضة / ALDH في منطقة الجناح الأيسر. رصد حقن الفئران لمدة تصل إلى 10 أسبوعا لمعرفة تطور الورم 19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا HNSCC المطلوبة اثنين الفرز على التوالي بسبب نسبة ضئيلة جدا من الخلايا الجذعية السرطانية في خط الخلية الوالدية. واستند الفرز الأول على قدرة الخلايا الجذعية السرطانية لاستبعاد الصبغة هويشت يرجع إلى النقل هروب رأس المال المخدرات. وأدى ذلك إلى الحصول على 1-5٪ من مجموع السكان خلية مرتبة (الشكل 1). خلال هويشت صبغ الخلايا السلبية الفرز، والتحقق من حجم وتحبيب الخلايا مرتبة من خلال النظر في FSC-...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول وسيلة يمكن الاعتماد عليها لعزل الخلايا الجذعية السرطانية ناجحة من خط خلية معينة أن تنطبق على خطوط الخلايا HNSCC أخرى. معزولة الخلايا الجذعية السرطانية في الرأس والرقبة ثم يتم مناسبة لمزيد من التوصيف الجزيئي في المختبر، والتحقق من صحة وظيفية من قبل زرعها في الفئران العوز المناعي (19). ومع ذلك، يمكن اختبار بعض التعديلات تبعا لعدد السكان الجانب أو CD44 عالية / ALDH نسب عالية موجودة في خط الخلية الوالدية. على سبيل المثال، إذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Thibault Andrieu و Sebastien Dussurgey من منصة قياس التدفق الخلوي التابعة ل UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444 / US8) على نصيحتهم ومساعدتهم أثناء الفرز. تم إنجاز هذا العمل في الإطار العلمي ل ETOILE و Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصل عجل الجنين GoldGE HealthcareA15-151
هيدروكورتيزون قابل للذوبان في الماءسيجما ألدريتشH0396-100MG
بنسلين / ستربتومايسين 100xدومينيك دوتشرL0022-100
DMEMGibco61965-026
F12 مزيج الجوز (1x) + GlutaMAX-IGibco31765-027
EGFPromegaG5021يجب تحضير المحلول قبل الاستخدام مباشرة لأنه غير مستقر للغاية
هيبارينStemcellTM Technologies7980
B-27 (50x) ، ناقص فيتامين أجيبكو12587-010
Hoechst 33342Sigma-Aldrich14533سمية أكالة وحادة (عن طريق الفم ، الجلد ، الاستنشاق) الفئة 4
هيدروكلوريدفيراباميلSigma-AldrichV-4629السمية الحادة (الفموية والجلدية والاستنشاق) الفئة 3
بروبيديوم يوديدسيجما ألدريتشP4170السمية الحادة (الفم ، الجلد ، الاستنشاق) الفئة 4
ALDEFLUOR Kitالخلايا الجذعية1700
CD44-APC ، الجسم المضاد البشريMiltenyi Biotech130-095-177
IgG1-APC ، الجسم المضاد البشريMiltenyi Biotech130-093-189
Z1 جسيمات كولتربيكمان كولتر6605698
المجهر البصريأوليمبوس & nbsp ؛CKX31
SQ20Bمن جون ليتل sمختبر-خط
خلايا FaDuATCCHTB-43
ألواح التثبيت المنخفضةThermo Fischer Scientific145383
BD FACSبرنامج ديفا v8.0.1BD Biosciences-
مكمل هدية خط خلية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
  2. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  3. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  4. Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
  5. Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
  6. Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
  7. Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
  8. Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
  9. Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
  10. Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
  11. Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
  12. Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
  13. Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
  14. Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
  15. Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
  16. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  17. Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67(2006).
  18. Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
  19. Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
  20. Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
  21. Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
  22. Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064(2009).
  23. Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
  24. Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
  25. Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
  26. Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
  27. Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
  28. Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
  29. Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
  30. Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
  31. Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
  32. Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
  33. Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
  34. Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
  35. Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
  36. Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
  37. Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
  38. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD44 ALDH

مقالات ذات صلة