مقالة منهجية

غليكان تحليل عقدة: نهج من أسفل إلى أعلى لGlycomics

DOI:

10.3791/53961

⸱

مايو 22, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة شكلا محسنا لتقنية الجليكوميكس الجديدة من أسفل إلى أعلى المصممة لتحليل المظهر التركيبي المجمع للجليكان في السوائل الحيوية غير المجزأة من خلال الانهيار الكيميائي للجليكان إلى السكريات الأحادية الخاصة بالارتباط المكونة لها للكشف عنها بواسطة GC-MS. تشمل التطبيقات المحتملة الكشف المبكر عن السرطان والاضطرابات العاطفية الجليكانية الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تصنيعها في عملية غير مدفوعة بالقالب بواسطة إنزيمات تسمى glycosyltransferases ، وهي لاعب رئيسي في العديد من الأحداث المهمة داخل وخارج الخلية. تؤثر العديد من الحالات المرضية ، ولا سيما السرطان ، على التعبير الجيني ، والذي بدوره يمكن أن يحرر الوفرة النسبية ومستويات نشاط إنزيمات هيدرولاز الجليكوزيد والجليكوسيلترانسفيراز. غالبا ما توجد الجليكانات الكاملة الشاذة الفريدة الناتجة عن الجليكوزيل ترانسفيراز غير المنظم بكميات ضئيلة داخل السوائل الحيوية المعقدة ، مما يجعل اكتشافها صعبا وأحيانا عشوائيا. ومع ذلك ، مع التحضير المناسب للعينة ، يمكن لأحد أقدم أشكال قياس الطيف الكتلي (كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي ، GC-MS) أن يكتشف بشكل روتيني مجموعة السكريات الأحادية ذات النقطة الفرعية والخاصة بالارتباط ("عقد الجليكان") الموجودة في السوائل الحيوية المعقدة. مكملا لتقنيات الجليكوموم التقليدية من أعلى إلى أسفل ، يتضمن النهج الذي تمت مناقشته هنا جمع وتكثيف كل عقدة جليكان مكونة في عينة في إشارة تحليلية مستقلة واحدة ، والتي توفر معلومات هيكلية وكمية مفصلة حول التغييرات التي تطرأ على الغليكوم ككل وتكشف عن الجليكوزيل ترانسفيراز الذي يحتمل أن يكون غير منظم. تعزز التحسينات التي أدخلت على مراحل التخلي عن البيريثيل ومراحل الاستخراج السائل / السائل اللاحقة الواردة هنا قابلية التكاثر والعائد الكلي من خلال تسهيل الحد الأدنى من تعرض الجليكان البيرميثال للظروف المائية القلوية. تزيد التعديلات على مرحلة الأستلة من مدى التفاعل والعائد الإجمالي. على الرغم من قابليتها للتكاثر ، إلا أن الغلة الإجمالية لأسيتات ألديتول بيرميثيل جزئيا (PMAAs) N-acetylhexosamine (HexNAc) أقل بطبيعتها من قيمتها النظرية المتوقعة بالنسبة إلى PMAAs السداسية. إن حساب نسبة المساحة تحت الكروماتوجرام الأيوني المستخرج (XIC) لكل سداسي عشري PMAA فردي (أو HexNAc PMAA) إلى مجموع مناطق XIC هذه لجميع السداسيات (أو HexNAcs) يوفر طريقة تطبيع جديدة تسهل القياس الكمي النسبي لعقد الجليكان الفردية في العينة. على الرغم من أنها مقيدة حاليا من حيث حدودها المطلقة للكشف ، إلا أن هذه الطريقة تسرع من تحليل السوائل الحيوية السريرية وتظهر وعدا كبيرا كنهج تكميلي للجلوسكوميات التقليدية من أعلى إلى أسفل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السكرية، البروتينات السكرية، بروتيوغليكان، والجليكوزامينوجليكان تشكل الطبقات الأربعة الرئيسية، والكربوهيدرات المعقدة غير المتجانسة والتي تعرف باسم glycans. كمكونات في كل مكان ولا يتجزأ من غشاء البلازما، الكنان السكري، والمصفوفة خارج الخلية والسوائل، glycans مشاركة في مثل هذه العمليات الكيميائية الحيوية المتنوعة كما الإلتقام والاتجار داخل الخلايا، حركية الخلية، ونقل الإشارة، والتعرف الجزيئي، تنشيط مستقبلات، التصاق الخلايا والتفاعل المضيف الممرض ، بين الخلايا والاتصالات، والترصد المناعي، والمناعي استجابة بدء 1 الحاضر تقريبا في كل مجال من الحياة، والانزيمات المعروفة باسم glycosyltransferases أن بناء البوليمرات غليكان تعمل جنبا إلى جنب مع هيدروليز الأنتراكينون (المعروف أيضا باسم glycosidases، والذي كسر glycans) لبناء وإعادة تشكيلها، وفي نهاية المطاف تنتج الانتهاء البوليمرات غليكان 2. وعلى الرغم من كل ناقلة الغليكوزيل قد تعمل على غليكوكونجوغاتيس مختلفة، وهي ناقلة الغليكوزيلتقيم عموما linkage- ومصاوغ كربونيلي محددة رابطة غليكوسيدية عن طريق نقل شاردة أحادي السكاريد من معين النوكليوتيدات تنشيط السكر المانحة (على سبيل المثال، الناتج المحلي الإجمالي فوكوسي) على فئة معينة من يقبلون أليفة النواة (على سبيل المثال، الدهن، ببتيد، الحمض النووي، أو تزايد قليل السكاريد). وتشير التقديرات إلى أن أكثر من 50٪ من البروتينات (خاصة غشاء والبروتينات إفرازية) هي مرحلة ما بعد translationally تعديلها من قبل بالغليكوزيل 3 حسابات اندماجي البدائية تقدم تقديرا للتفاوتا كبيرا، وبراعة، وخصوصية الممنوحة للبروتينات سكرية التي كتبها بالغليكوزيل؛ على سبيل المثال، إذا كان الركيزة ببتيد لديها فقط 10 مواقع بالغليكوزيل وكل موقع يمكن أن تشكل صلة غليكوزيدية مع 1 من 3 فقط أحادي السكاريد مختلف الغايات الحد، ثم، من الناحية النظرية، وبروتين سكري النهائي يمكن أن تتحمل 3 10 = 59049 هويات متميزة. في بروتينات سكرية، والروابط غليكوزيدية تشكل عادة مع الجانب سلسلة النيتروجين سالمخلفات و الهليونين في تسلسل الأسباراجين-X-سر / منتدى المجالس الرومانسية (X يمكن أن يكون أي من الأحماض الأمينية إلا البرولين) لانتاج N -glycans 2 والجانبية سلسلة الهيدروكسيل سيرين وثريونين المخلفات لانتاج يا -glycans 4. تكوين glycome الخلية (أي مكمل من المنتجات بالغليكوزيل) هي فريدة من نوعها ومحدود، لأنه مع وجود استثناءات قليلة، glycosyltransferases يحمل المانحة الصارم، متقبل، وخصوصية الربط. 5 بروتين بلازما الدم هامة وفيرة تعاني بالغليكوزيل الشاذة نتيجة المصب التعبير ناقلة الغليكوزيل غير طبيعي والنشاط بسبب العديد من الحالات المرضية، وخاصة السرطان والأمراض الالتهابية. 6-24

ويرجع ذلك أساسا إلى عوامل جينية، وglycome بشكل ملحوظ أكثر تنوعا وديناميكية، ومعقدة من بروتيوم وTranscriptome على. 25،26 بينما ما يقرب من 1٪ من الجينوم الثدييات بترميز تشكيل وتعديل، وتجميع glycans، 27 العائدات بالغليكوزيل بطريقة تناقض ملحوظ مدفوعة غير القالب إلى ببتيد والحيوي الحمض النووي. التفاعل بين كمية النسبية ونشاط الأنزيمات بالغليكوزيل وهذه العوامل البيئية مثل توافر المواد الغذائية والسلائف يحدد في نهاية المطاف الطبيعة، ومعدل، ومدى ارتباط بالغليكوزيل. 5،28 مرحلة التطور الجنيني (على سبيل المثال، تقرير والتمايز)، وتفعيل الخلوي، وتقدم من خلال التعبير تأثير الجينات دورة الخلية (أي النسخ والترجمة) ويغير هوية وكمية من glycosyltransferases المتاحة، الذي النشاط هو المحدد المنبع الفوري لمحة غليكان الخلية. لأن (بعض) التكاثري، لاصق، وخصائص الغازية من الخلايا السرطانية تشبه الخلايا تخلقي العادية، تغييرات محددة في مسارات السكروز غليكان (على سبيل المثال، وتراكم السلائف والتعبير حررت، aberranر التعديل، اقتطاع الهيكلي، أو تشكيل رواية) تخدم المؤشرات الحيوية السرطان العالمية التي تشير إلى مراحل مختلفة من تشكيل الورم، والتقدم، والهجرة، وغزو 29 وعلى الرغم من ارتباط بالغليكوزيل معقد للغاية، ومن الواضح سوى عدد قليل من التعديلات في بالغليكوزيل أن تمكن السرطان وورم خبيث؛ على ما يبدو، بعض "الشاذة" المنتجات بالغليكوزيل تستفيد بالفعل الخلايا السرطانية من خلال تمكينهم من التهرب من الاعتراف المناعة، والبقاء على قيد الحياة لمطالب الهجرة في البيئات داخل الأوعية الدموية والمنتشر وعرة. 28،30،31 ليس من المستغرب، وقد كشفت التجارب أن تعطيل أو منع أنماط تغيير التعبير الجيني وتشكيل غليكان الشاذة يمكن أن توقف تكون الأورام. 29 ومع ذلك، فإن glycans الشاذة في الكشف عن عينة biofluid (على سبيل المثال، والبول واللعاب، وبلازما الدم أو المصل) قد لا تكون المؤشرات المباشرة من السرطان (أو مرض آخر)، ولكن المصب بدلا نتائج خفية بعد هامةتغييرات في الجهاز المناعي أو عواقب يمكن قياسها من شرط الخبيثة في الجهاز لا يمكن التنبؤ بها. 32

على الرغم من أنها تقدم معلومات شاملة عن glycome، العديد من الجزيئية تقنيات glycomics القائم على التفاعل (على سبيل المثال، كتين / صفائف الأجسام المضادة والتمثيل الغذائي / التساهمية التوسيم) تعتمد على الكشف عن هياكل غليكان كلها وليس لتوفير المعلومات الهيكلية المفصلة حول glycans الفردية. في تناقض واضح، ويمكن قياس الطيف الكتلي (MS) تساعد في تحديد وقياس هياكل غليكان الفردية وتكشف هذه المعلومات الهيكلية مثل مواقع التعلق النوى ببتيد. التعبير حررت أو نشاط ناقلة الغليكوزيل واحد فقط يمكن الشروع في سلسلة من الأحداث الجزيئية ضارة في مسارات بالغليكوزيل متعددة. لأن كل ناقلة الغليكوزيل قد تعمل على الركيزة glycoconjugate أكثر من واحد وعبر مختلف البوليمرات غليكان المتزايد، شلالات السكروز حررت تسفر disproporزيادة دوليا هو كميات من المنتج غليكان واحد فقط ولكن عدة فئات غير متجانسة من glycans الشاذة في سوائل البينية أو خارج الخلية، وتعتبر 33 بيد أن هذه glycans الشاذة الفريدة في بعض الأحيان غير عملي والمؤشرات الحيوية للسرطان أو غيره من الأمراض غليكان-الوجدانية ل، مقارنة مع حمام سباحة كبير من glycans منظمة تنظيما جيدا، وهذه glycans الشاذة تمثل جزء صغير جدا التي قد تبقى في كثير من الأحيان لا يمكن الكشف عنها حتى من قبل هذه التقنيات حساسة للغاية كما مطياف الكتلة. على سبيل المثال، في سوائل الجسم البينية وخارج الخلية، وطيف واسع تركيز البروتين (الذي يمتد ثمانية أوامر من حجم) يمكن أن يمنع الكشف عن بروتينات سكرية النادرة التي يتم من قبل ملثمين الأنواع أكثر وفرة. 32 وعلاوة على ذلك، وتحديد النشاط ناقلة الغليكوزيل لا تزال كبيرة عملي والتحدي النظري لأن العديد من glycosyltransferases غائبة في biofluids السريرية أو تصبح غير نشطة خارج الحي. وعلى الرغم من صعوبة consistenكشف TLY وقياس كميات دقيقة جدا من glycans كاملة فريدة من نوعها، جعلت ممارسي قياس الطيف الكتلي خطوات هائلة نحو توظيف glycans سليمة كعلامات السريرية. لقد وضعت مؤخرا اتباع نهج متكامل لتحليل glycans سليمة أن توظف GC-MS، يسهل الكشف عن جميع المكونة فرع نقطة والسكريات الأحادية-الربط معين ( "العقد غليكان") التي نقلها معا تفرد لكل غليكان وفي كثير الحالات تكون مباشرة بدائل كما الجزيئية التي قياس النشاط النسبي للناقلة الغليكوزيل تحت طائلة المسؤولية (ق).

منذ لأول ذكرت التطبيق المباشر لتحليل غليكان في عام 1958، وقد ثبت اللوني للغاز (GC) تقنية قوية لتحليل ميثليته لكل أحادية و disaccharides، 34 تحديد anomericity والتكوين المطلق، وفصلها عن التحليل الطيفي الشامل لاحق. 35 بين عامي 1984 و 2007، Ciucanu والزملاءقدم والمكرر الصلبة مرحلة permethylation غليكان التقنية التي تستخدم هيدروكسيد الصوديوم وiodomethane، تليها استخراج السائل / السائلة من glycans permethylated باستخدام الماء والكلوروفورم. 35،36 بين عامي 2005 و 2008، كانغ وزملاء العمل المتكاملة تدور لتوفير الوقت نهج -column في خطوة permethylation. 37،38 في عام 2008، ابتكرت مجموعة بحث جويتز على كمية الصلبة مرحلة permethylation طريقة غليكان-التنميط باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين (MALDI) قياس الطيف الكتلي للمقارنة والتمييز الغازية وغير محتملة -invasive خلايا سرطان الثدي (39)؛ ثم، في عام 2009، وفريق جويتز جنبا إلى جنب الأنزيمية وتقنيات الافراج الكيميائية ليلتصق يا -glycans من بروتينات سكرية سليمة في مخطط permethylation الصلبة مرحلة شديدة القلوية 40 على الرغم من أن الإجراء جويتز تسهيل permethylation في وقت واحد، والإفراج الكيميائية. من يا -glycans، تم تطبيقه فقط إلى ما قبل معزولة غليكوالبروتينات. نحن تعديل هذه التقنية في عام 2013 وتكييفه لbiofluids غير المجزأ كاملة وعينات الأنسجة المتجانس من خلال دمج حمض trifluoroacetic (TFA) التحلل، والحد، وأستلة الخطوات. 33 وهذه خطوات إضافية أيضا إطلاق سراح glycans من السكرية وN -linked glycans من بروتينات سكرية وتحويل لهم في الأسيتات مميثل جزئيا alditol (PMAAs، الشكل 1)، الذي مميزة أنماط مثيلة، وأستلة تسهيل التحليل GC-MS وفريد ​​تميز العقد غليكان المكونة في الأصلي البوليمر غليكان سليمة 41 (الشكل 2). 33 في نهاية المطاف، وهذا الإجراء ينتج صورة مركبة لجميع glycans في biofluid مجمع على أساس والتقدير الكمي النسبي المباشر من الميزات غليكان فريدة مثل "fucosylation الأساسية"، "6-sialylation"، "تتوسط GlcNAc"، و "بيتا 1-6 المتفرعة" - كل مستمدة من chromatograp GC-MS واحدقمة التحالف الدولي للموئل. تقدم هذه المقالة مزيد من التحسين من permethylation، أستلة، والعزلة، ومراحل تنظيف جنبا إلى جنب مع تحسينات في طريقة تقدير نسبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحذير: تجنب ملامسة الجلد / العين مع أي من الكواشف المستخدمة في هذه التجربة. عند التعرض، تدفق بدقة المنطقة المتضررة بالماء وطلب المشورة الطبية الفورية.

1. Permethylation وغليكان استخراج

  1. إعداد عمود
    1. الحصول على العديد من وحدات العمود microfuge تدور كما العينات لتحليلها. كسر وفصل البلاستيك قبعات أنبوب خزان. وضع مرشح microfuge مصغرة في كل أنبوب خزان. وضع تجميعها الأعمدة تدور microfuge (التي تحتوي على مرشحات صغيرة) في رف microfuge أنبوب.
    2. الحصول على الأسهم من هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حبات (20-40 شبكة). نقل بعض هيدروكسيد الصوديوم إلى قارب وزنها صغير أو، إذا الرطوبة يسبب تراكمها، قذيفة هاون الخزف الساخنة مثل الأوراق المالية العاملة من هيدروكسيد الصوديوم. تجنب استخدام كتل من الخرز هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم أو سحقت / مسحوق.
      تحذير: هيدروكسيد الصوديوم هو مادة سامة قوية وقاعدة للتآكل. تدفق يتعرض الجلد / العينين بالماء لمدة 15 دقيقة. ThorougHLY تنظيف طاولة العمل بعد الانتهاء من التجربة.
    3. استخدام مغرفة صغيرة أو ملعقة، ونقل حبات هيدروكسيد الصوديوم من المخزون تعمل على ملء مرشحات صغيرة microfuge مع هيدروكسيد الصوديوم حتى شطبة الخارجي الأول (~ 5 مم تحت حافة). الاستفادة من المرشحات microfuge شغل على مقاعد البدلاء أعلى لحزم / تكثيف حبات هيدروكسيد الصوديوم.
      ملاحظة: طوال هذه التجربة، لتقليل امتصاص المياه الزائدة من الخرز هيدروكسيد الصوديوم استرطابي، والحفاظ على مستوى من أي سوائل المضافة (مثل، الأسيتونتريل، ثنائي ميثيل سلفوكسيد، تحليلها الحل) فوق سطح العمود التعبئة هيدروكسيد الصوديوم والحد من الاتصال المباشر مع الهواء.
    4. الحصول على مخزون من الأسيتونتريل (إيه سي). نقل ~ 350 ميكرولتر ACN إلى كل مرشح صغير microfuge معبأة هيدروكسيد الصوديوم. الحفاظ على هيدروكسيد الصوديوم المغمورة تحت ACN وإزالة فقاعات الهواء الكبيرة عن طريق اثارة مع هلام التحميل ماصة طرف مجعد.
      تحذير: الأسيتونيتريل هو مصدر إزعاج للاشتعال.
    5. عمود الطرد المركزي
      1. ترتيب الأعمدة microfuge متناظر داخل جهاز للطرد المركزي. استخدام أنبوب التوازن إذا لزم الأمر. تجنب إراقة أي حبيبات هيدروكسيد الصوديوم داخل أجهزة الطرد المركزي. إغلاق الغطاء أجهزة الطرد المركزي.
      2. الطرد المركزي الأعمدة (التي تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم وإيه سي) ل~ 15 ثانية في 2400 × ز.
      3. عند الانتهاء من الطرد المركزي، وإزالة الأعمدة microfuge من أجهزة الطرد المركزي، وتجاهل إيه سي في وعاء النفايات الخطرة. الحفاظ على العمود هيدروكسيد الصوديوم التعبئة سليمة.
    6. إضافة ~ 350 سلفوكسيد ثنائي ميثيل ميكرولتر (DMSO) لكل مرشح صغير microfuge معبأة هيدروكسيد الصوديوم. الحفاظ على هيدروكسيد الصوديوم المغمورة تحت DMSO وإزالة أي فقاعات الهواء الكبيرة مع طرف ماصة. كما هو موضح سابقا، والأعمدة أجهزة الطرد المركزي ل~ 15 ثانية في 2400 × ز، وتجاهل DMSO مع الحفاظ على هيدروكسيد الصوديوم التعبئة سليمة.
      تحذير: DMSO هو المغير وإزعاج ويمتص بسهولة من خلال الجلد.
    7. سد جميع المرشحات مصغرة microfuge مع المقابس المدرجة في تصفية تدورعدة. نقل ~ 350 ميكرولتر DMSO لكل microfuge فلتر صغير معبأة هيدروكسيد الصوديوم واستخدام 200 ميكرولتر ماصة لإزالة فقاعات الهواء في التعبئة والتغليف هيدروكسيد الصوديوم بحيث تصل DMSO جميع المناطق داخل ثم التعبئة هيدروكسيد الصوديوم. تجنب سحق أو إلغاء مفرط حبات هيدروكسيد الصوديوم. مسحوق هيدروكسيد الصوديوم غير مرغوب فيها. الانتهاء من هذه الخطوة بأسرع وقت ممكن.
  2. إعداد مراقبة الجودة البلازما (QC) عينة (ق)
    ملاحظة:     لضمان نتائج متسقة عبر دفعات تجريبية، والنظر في استخدام قسامة واحد على الأقل من عينة مأخوذة من كبير، وجمع معظم متجانس من المواد البيولوجية ذات الاهتمام ليتم تحليلها في كل دفعة. على سبيل المثال، إذا تحليل بلازما الدم، واستخدام قسامة (ق) من مجموعة الجزء الأكبر من بلازما الدم كعينة مراقبة الجودة (ق) في كل دفعة. عينات عملية مراقبة الجودة في بنفس الطريقة التي عينات مجهولة.
    1. الطرد المركزي عينة الأسهم مراقبة الجودة البلازما لمدة 4 دقائق في ~ 10000 × ز. أثناء الطرد المركزي، وبعض راسب عالية الكثافة قد يستقر إلى thالبريد القاع وبعض منخفض الكثافة راسب قد تطفو إلى أعلى البلازما. تجنب سواء عند إزالة قسامة (ق) من البلازما.
    2. انتقل إلى "1.3) إعداد نموذج" أدناه. ثم، والعودة إلى هذه الخطوة بعد الطرد المركزي البلازما كامل.
    3. سحب 9 ميكرولتر من طرد البلازما مراقبة الجودة وتحويلها إلى أنبوب اختبار البولي بروبلين 1.5 مل المسمى بشكل مناسب مجهزة مع قبعة الإضافية اغلاق (يشار إليها فيما يلي باسم "أنبوب اختبار البلاستيك 1.5 مل"). إضافة 1 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى كل قسامة. إذا رغبت في ذلك، واستخدام هذه باعتبارها الناقل لمعيار داخلي (ق).
    4. إضافة 270 ميكرولتر DMSO لهذه السيطرة البلازما. دوامة لضمان حل كامل.
  3. إعداد عينة
    1. الحصول على أكبر عدد ممكن من أنابيب اختبار من البلاستيك 1.5 مل حيث بلغ عدد (الحليلة) العينات البيولوجية.
    2. نقل 9 ميكرولتر من كل (الحليلة) عينة بيولوجية إلى أنبوب اختبار في المقابل 1.5 مل من البلاستيك. نقل 1 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات و 270 ميكرولتر DMSO لكل أنبوب العينة.
    3. مزيج بقوة (على سبيل المثال، دوامة و / أو بشكل متكرر ماصة صعودا وهبوطا) العينات لضمان حل كامل في DMSO.
      تحذير: نفذ الخطوات التالية داخل غطاء الدخان. المستخدمة في الخطوات التالية، iodomethane (CH 3 I)، ثنائي كلورو ميثان (CH 2 الكلورين 2، ويعرف أيضا باسم كلوريد الميثيلين)، والكلوروفورم (CHCl 3، ثلاثي كلور الميثان)، هي السوائل المتطايرة قادرة على حل بعض أنواع البلاستيك (على سبيل المثال، قفازات النتريل) . تأكد من استخدام قفازات مقاومة المذيبات. بسبب انخفاض اللزوجة وبخار عالي الضغط، ويمكن لهذه الكواشف يتقطر من طرف ماصة أثناء النقل. تقليل الخسائر كاشف والتعرض المحتمل من خلال عقد المحلول المتاخمة للسفينة الاستقبال.
    4. نقل إجمالي حجم كاف من iodomethane ل، أنبوب نظيفة صغيرة. وسيكون لكل عينة تحليلها يتطلب 105 iodomethane ميكرولتر. نقل ~ 500 ميكرولتر ثنائي كلورو ميثان إلى عنوتإيه أنبوب نظيفة. لمنع انسداد حقنة، وشطف المحاقن مع ثنائي كلورو ميثان مباشرة بعد نقل iodomethane.
      تحذير: Iodomethane غير حساس، متقلب، والسم قوي قادر على إتلاف الجهاز العصبي المركزي أو التسبب في وفاة حالة استنشاقه أو ابتلاعه. ثنائي كلورو ميثان هو مادة مسرطنة محتملة، المغير الإنجاب، وقوية مهيجة قادرة على إلحاق أضرار عدة أجهزة أو التسبب في الموت.
    5. استخدام حقنة التحليلية لإضافة 105 ميكرولتر iodomethane لكل عينة تحليلها. كاب أنابيب تحليلها فورا للحد من تبخر iodomethane. تماما دوامة، وإذا لزم الأمر، الطرد المركزي لفترة وجيزة جميع العينات لضمان عدم وجود السائل يبقى في الحد الأقصى. أي تغيير اللون (على سبيل المثال، إلى اللون البني والأرجواني، أو أصفر) يشير تدهور iodomethane، الأمر الذي قد يعرض للخطر رد فعل permethylation التالية.
    6. شطف حقنة التحليلية المستخدمة لنقل iodomethane مع ثنائي كلورو ميثان 3 مرات على الأقل. هذا سوف يمنع ذلك جيئة وذهابام انسداد. التخلص من هذا شطف، جنبا إلى جنب مع iodomethane اضافية وثنائي كلورو ميثان في وعاء النفايات الخطرة العضوية. وضع أنابيب الاختبار المستخدمة في حاوية النفايات الخطرة.
    7. الحصول على مجموعة جديدة من أنابيب خزان من البلاستيك 2 مل. إزالة الأداة الإضافية قبعات إذا رغبت في ذلك.
    8. افصل مرشحات microfuge مصغرة. الطرد المركزي الأعمدة موصول لمدة 15 ثانية في 2400 × ز، ثم تجاهل أنابيب خزان جنبا إلى جنب مع النفايات السائلة DMSO.
    9. إعادة توصيل الأعمدة تدور طرد، ووضعها داخل أنابيب خزان جديدة. عدد كل عمود الدوران وأنبوب في خزان المقابلة مع نفس رقم العينة. تأكد من أن المقابس مرشح صغيرة ضيقة. تسرب محتمل يمكن أن تؤثر على الخطوة التالية. تقليل الوقت بين إزالة DMSO من الأعمدة تدور ونقل العينات المراد تحليلها على أعمدة الدوران.
    10. Permethylation
      1. كميا نقل كل محلول العينة إلى المقابلة شغل هيدروكسيد الصوديوم حبة شارك microfuge تدورlumn. استخدام 1000-ميكرولتر ماصة لهذه الخطوة. وبعد نقل، تجعيد ~ 2 ملم من نهاية غيض 200 ميكرولتر وترك الأمر في محتويات عمود لاستخدامه كقاعدة النمام. أكرر لجميع العينات.
        ملاحظة: اللزوجة المنخفضة من iodomethane يمكن أن يسبب فقدان عينة لأن الحل تحليلها يمكن أن يتقطر من طرف ماصة أثناء عملية النقل. عقد أنبوب العينة وعمود الدوران المجاورة لبعضها البعض من ناحية، ونقل بسرعة محلول العينة مع جهة أخرى.
      2. السماح للتفاعل permethylation المضي قدما لمدة 11 دقيقة. يقلب كل عينة 4-5 مرات على الأقل خلال هذه الفترة. لتسهيل permethylation كفاءة، والذي يحدث على سطح حبات هيدروكسيد الصوديوم، استخدام نصائح ماصة هلام التحميل تلميح معقوص كما النمامون إلى المزيج بلطف محتويات العمود. خلط العدواني يمكن أن يثقب مرشح تدور، إسحق وتعليق الخرز هيدروكسيد الصوديوم (والتي يمكن أن تقلل من فعالية السائل / استخراج السائل لاحقا)، و / أو يسبب فقدان العينة (كما ساmple-غارقة حبيبات هيدروكسيد الصوديوم يمكن أن الفائض من العمود).
      3. في إطار التحضير للالسائل / السائلة خطوة استخراج اللاحقة، وإعداد كمية كافية من 0.5 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) حل في الفوسفات عازلة 0.2 M الصوديوم (7.0 درجة الحموضة)، ليتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة. وسيكون لكل عينة تتطلب ما مجموعه ~ 12 مل من محلول كلوريد الصوديوم لجميع المراحل الثلاث لاستخراج السائل / السائلة.
      4. عند الانتهاء من فترة permethylation 11 دقيقة، على الفور بعد فصل بعناية الأعمدة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 2400 × ز. تجاهل المقابس.
    11. على الفور إزالة الأعمدة تدور من أجهزة الطرد المركزي ووضعها في مجموعة جديدة من فارغة أنابيب تدور الخزان، وترك حل التدفق من خلال تحتوي على glycans permethylated الطازجة وراء. لا يستبعد حدوث اي شيء.
    12. في أقرب وقت ممكن، إضافة 300 ميكرولتر أسيتونتريل (إيه سي) إلى الجافة، والمرشحات تدور شغل هيدروكسيد الصوديوم. أجهزة الطرد المركزي المرشحات تدور لمدة 30 ثانية في 9600 × ز.
    13. فوراذ بعد ذلك، نقل الحل permethylation الرئيسي (أي الحل الذي تم تحضين مع حبات هيدروكسيد الصوديوم لمدة 11 دقيقة ثم نسج من خلال تصفية تدور في أنبوب الطرد المركزي قبل إضافة 300 ميكرولتر من إيه سي في الخطوة السابقة) إلى silanized 13 × 100 ملم أنابيب الاختبار الزجاجية التي تحتوي على 42 3.5 مل من 0.2 M عازلة فوسفات الصوديوم التي تحتوي على 0.5 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0 و خلط (دوامة) على الفور. تجنب نقل أي مخلفات صلبة بيضاء خلال هذه الخطوة. هل كل هذا لعينة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    14. دون تأخير، ونقل (الجمع) وإيه سي تدور من خلال في كل أنبوب خزان ل(مع) ما تبقى من عينة السائل في أنبوب زجاجي silanized منها، وخلط (دوامة) على الفور. مرة أخرى، وتجنب نقل أي مخلفات صلبة بيضاء خلال هذه الخطوة. كاب، هزة، ودوامة أنبوب زجاجي. كرر لكل عينة. تجاهل الأعمدة هيدروكسيد الصوديوم والماصات باستور في حاويات النفايات المناسبة.
  4. السائل / السائلة إضافيction وغليكان تنقية
    1. داخل غطاء الدخان، إضافة 1.2 مل كلوروفورم لكل عينة. بعد ذلك مباشرة، وكأب أنابيب زجاجية silanized وتخلط بقوة المحتويات.
    2. الطاقة والمعادن قبل الحرارة إلى حوالي 75 درجة مئوية في مشعب التبخر. استخدام كتل التدفئة مع الآبار التي يمكن أن تستوعب 13 ملم × 100 ملم أنابيب الزجاج.
    3. الحصول على مجموعة جديدة من الماصات silanized باستور، الماصات باستور غير silanized، وsilanized أنابيب الاختبار الزجاجية مع قبعات.
      تحذير: الكلوروفورم (CHCl 3) هو مصدر إزعاج، المغير، والمحتملة مسرطنة قادرة يتسرب من خلال بعض أنواع من القفازات.
    4. لفترة وجيزة الطرد المركزي (~ 3000 × ز) أنابيب زجاجية تحتوي على عينة لفصل الطبقات المائية والعضوية.
    5. استخدام ماصة غير silanized باستور لاستخراج ما يكفي من الطبقة العليا مائي بحيث ~ 3 ملم من الطبقة المائية يبقى فوق طبقة العضوية القاع.
    6. إضافة 3.5 مل من M نا 0.5حل الكلورين في منطقة عازلة الفوسفات 0.2 M الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7) إلى كل أنبوب زجاجي، مزيج بقوة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (~ 3000 × ز). كما في الخطوة السابقة (1.4.3)، واستخدام ماصة غير silanized باستور لاستخراج طبقة المائية.
    7. كرر الخطوة السابقة (1.4.4)، ولكن ترك ~ 1 مل من الطبقة المائية.
    8. استخدام ماصة باستير silanized نظيفة لنقل الطبقة العضوية إلى silanized 13 × 100 مم أنبوب اختبار زجاج نظيفة وصفت بشكل مناسب. تجنب التلوث المائي عن طريق استخراج بالطريقة التالية:
      1. عقد كل من أنابيب الاختبار الزجاجية silanized الحالية والجديدة المجاورة لبعضها البعض في يد واحدة. مع جهة أخرى، اضغط على لمبة ماصة لخلق فقاعات في حين إدراج ماصة إلى أسفل من خلال طبقة المائية.
      2. مرة واحدة داخل طبقة العضوية، والتوقف عن خلق فقاعات، وعقد لمبة ماصة ثابتة للسماح للطبقات العضوية والمائية لتحقيق الاستقرار وفصل مرة أخرى. ثم حرر ببطء لمبة لسحب أكبر قدر من ORGANIطبقة ج ممكن دون أي تلوث مائي.
      3. رفع بسرعة غيض ماصة من خلال طبقة المائية، ومقاومة رد الفعل الطبيعي للإفراج قليلا لمبة (مما يؤدي إلى سحب بعض التلوث المائي)، في حين رفع ماصة من الأنبوب.
      4. بسرعة نقل الطبقة العضوية المنخفضة اللزوجة إلى أنبوب جديد مجاور. وأي تلوث مائي تكون واضحة كما قطرات سائلة صغيرة على الجزء العلوي من طبقة العضوية المستخرجة في أنابيب زجاجية جديدة. إذا مائي التلوث / كلوريد الصوديوم مرئيا، إزالته مع ماصة. أجهزة الطرد المركزي إذا دعت الحاجة لتجميع قطرات مائي في قطرة واحدة.
    9. التخلص السليم من الأنابيب القديمة الزجاج، الماصات، ومائي والحلول النفايات العضوية. غسل وإعادة تدوير قبعات أنبوب زجاجي.
    10. تجفيف جميع العينات تحت تيار لطيف ومستمر من النيتروجين في مشعب تبخر محمى على حرارة 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ~ داخل غطاء الدخان. لضمان التبريد التبخيري خلال كل الظريف الجاف إلى أسفلملاحظة، وتدفق لطيف ومستمر من النيتروجين يجب أن تزعج سطح السائل دون الرش أو يتناثر السائل. إزالة عينات من مشعب تبخر على تجفيف كامل للعينة النهائية. بقع بيضاء في الجزء السفلي من أنابيب الزجاج المجففة تشير عازلة / تلوث كلوريد الصوديوم.
    11. وقفة الإجراء هنا إذا لم يكن هناك ما يكفي من الوقت المتبقي من اليوم لإكمال الخطوة التحلل TFA. مؤقتا (أي، بين عشية وضحاها) تخزين العينات الجافة في -20 درجة مئوية. مواصلة الإجراء بعد التخزين، وإزالة عينات من الثلاجة -20 درجة مئوية، والسماح لهم لتدفئة تماما قبل uncapping.
    12. بينما عينات دافئة، تمهيدا لحمض trifluoroacetic (TFA) التحلل (المرحلة المقبلة)، تعيين عباءة التدفئة مثل أن درجة حرارة محتويات أنبوب اختبار السائل سوف تصل إلى 121 درجة مئوية. إعداد الحل TFA من الأسهم TFA (انظر الخطوة 2.1 أدناه).

2. Trifluoroacetic حمض (TFA) الحلمأة

تحذير: حمض Trifluoroacetic (TFA) هو حمض عضوي للتآكل وتهيج السامة.

  1. إعداد كمية كافية من محلول 2.0 M TFA في الماء منزوع الأيونات. وسيكون لكل عينة تحليلها يتطلب 325 ميكرولتر من 2.0 حل M TFA. المركزة TFA هو 13.0 م.
  2. إضافة 325 ميكرولتر من 2.0 M TFA لكل عينة تحليلها. لمنع TFA التبخر وفقدان العينة خلال خطوة تجفيف اللاحقة (2.3 أدناه)، بإحكام سقف كل أنبوب عينة فورا بعد إضافة TFA. بمناسبة مستوى حل في جميع أنابيب زجاجية. دوامة كل عينة بدقة قبل الخطوة التالية.
  3. احتضان أنابيب العينات توج بإحكام لمدة 2 ساعة في كتلة التدفئة مناسبة قبل ساخنة أو الفرن بحيث محتويات تصل إلى درجة حرارة 121 درجة مئوية. إذا باستخدام كتلة التدفئة بدلا من الفرن، وأنابيب غطاء عينة بورق الألمنيوم لمنع التكثيف من TFA في الجزء العلوي من الأنبوب والتجفيف الجزئي لعينة بقايا في الجزء السفلي من الأنبوب. التحقق من مستويات محلول العينة بعد 20-30 دقيقة.لضمان الحد الأدنى من TFA التبخر. إذا لزم الأمر، وتشديد قبعات أخرى أو استبدال أغطية لتشديد مناسبا.
  4. أثناء الانتظار 2 ساعة، مجموعة متعددة تبخر أخرى إلى 75 درجة مئوية للخطوة التالية (انظر 2.4 أدناه).
  5. عندما تكون فترة التدفئة 2-ساعة كاملة، والعينات الجافة في 75 درجة مئوية تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين ل~ 15 دقيقة. لا تترك عينات غير المراقب لأكثر من 15 دقيقة. كثيرا ما تحقق العينات، ووقف التدفئة والتجفيف مرة واحدة كل العينات الجافة.
  6. وقفة الإجراء هنا إذا لم يكن هناك ما يكفي من الوقت المتبقي من اليوم لاستكمال خطوة التخفيض. مؤقتا (أي، بين عشية وضحاها) عينات مخزن في -80 درجة مئوية. مواصلة الإجراء بعد التخزين، وإزالة عينات من الفريزر -80 درجة مئوية، والسماح لهم لتدفئة تماما قبل uncapping.

3. الحد

  1. داخل غطاء الدخان، وإعداد كمية كافية من 10 ز بوروهيدريد / L الصوديوم (NaBH 4) حل في 1 M العمونيأم هيدروكسيد (NH 4 OH). وسيكون لكل عينة تتطلب 475 ميكرولتر من هذا الحل. تقديم حل جديد لكل دفعة من العينات. هيدروكسيد الأمونيوم المركزة (27-30٪ ث / ث NH 3) ما يقرب من 14.5 م.
    تحذير: بوروهيدريد الصوديوم (NaBH 4) عبارة عن سموم المتفاعلة مع الماء استرطابي وإزعاج قوي يجب النشرات على اتصال مع أبخرة قابلة للاشتعال عالية المياه التي تسبب حروق خطيرة على اتصال استنشاق، ابتلاع، أو العين / الجلد.
    تحذير: هيدروكسيد الأمونيوم (NH 4 OH) هو مهيج للتآكل وسموم قادرة على التسبب بحروق شديدة وتلف الجهاز لا رجعة فيه على اتصال استنشاق، ابتلاع، أو العين / الجلد. غسل المناطق المصابة بالماء لمدة 30 دقيقة، ومنع الضحية من فرك أو خدش المناطق المتضررة.
  2. لكل عينة، إضافة 475 ميكرولتر من 10 جرام / لتر NaBH 4 في 1 M NH 4 OH. عينات المزيج جيدا لإذابة أي مخلفات. كاب أنابيب الاختبار والسماح للتفاعل اختزال أن يستمر لمدة 1 ساعة.
  3. أثناء الانتظار 1 ساعة، تعيين متعددة تبخر تسخينها إلى 75 درجة مئوية. استخدام كتلة التدفئة مع الآبار المناسبة للأنابيب الزجاج (انظر 3.4 أدناه).
  4. عندما تكون فترة رد الفعل 1-ساعة كاملة، إضافة 63 ميكرولتر الميثانول (MeOH) لكل عينة. هذه الخطوة والخطوة التالية إزالة البورون المتبقية كما ثلاثي بورات - السائل متقلبة نسبيا أن يغلي عند 68 درجة مئوية.
  5. العينات الجافة (في مشعب قبل ساخنة) في 75 درجة مئوية تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين ل~ 15 دقيقة. كثيرا ما تحقق العينات ولا تترك لهم غير المراقب. قطرات سائلة صغيرة في الجزء السفلي من أنابيب الزجاج تشير إلى أن العينة لم الجافة.
    ملاحظة: لتمييز فقاعات الهواء من قطرات سائلة، إمالة أنبوب الاختبار. سوف تتحرك إلا قطرات سائلة بعد إمالة، ولكن العكس ليس صحيحا دائما: إذا لم يتحرك فقاعة، يمكن أن يكون لا يزال (صغيرة جدا) قطرة السائل.
  6. مرة واحدة sampl الدراسيوفاق جافة تماما، وإعداد 9: حل 1 (ت / ت) من الميثانول (MeOH) وحمض الخليك (AcOH). إضافة 125 ميكرولتر من هذا MeOH: AcOH حل لكل عينة.
  7. العينات الجافة (في مشعب قبل ساخنة) في 75 درجة مئوية تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين.
  8. عندما تكون العينات الجافة تماما، فراغ تجفيف العينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة: مكان العينات في حوض استحمام في فراغ البلاستيك (مثل تلك التي تباع من قبل فودسافير)، إغلاق غطاء الفراغ، تعيين الطلب فراغ إلى "فراغ"، ربط خرطوم فراغ، وبدوره على فراغ. لتفكيك فراغ، عكس هذه الخطوات. انتظر النظام لضغط تماما قبل محاولة فتح غطاء الفراغ.
  9. وقفة الإجراء هنا إذا لم يكن هناك ما يكفي من الوقت المتبقي من اليوم لاستكمال خطوة التخفيض. مؤقتا (أي، بين عشية وضحاها) عينات مخزن في -80 درجة مئوية. مواصلة الإجراء بعد التخزين، وإزالة عينات من الفريزر -80 درجة مئوية، والسماح لهم لتدفئة تماما قبل uncappinز.
  10. في الوقت الذي تنتظر للحصول على عينات لفراغ الجافة (أو دافئة، بعد التخزين)، وإعداد الكواشف للخطوة التالية. الحصول على عدد من silanized الاوتوماتيكى المخروطية القاع (ع) قنينة (مع غطاء) لكل عينة. وعلاوة على ذلك، قبل الحرارة على حد سواء كتلة التدفئة الضحلة جيدا AS-قنينة وكتلة الزجاج أنبوب في آبار عميقة بحيث محتويات أنبوب زجاجي سوف تصل إلى درجة حرارة تبلغ 50 درجة مئوية.

4. أستلة (المنفذ في الدخان هود)

  1. إضافة 18 ميكرولتر منزوع الأيونات الماء إلى كل عينة. كاب وبدقة دوامة جميع أنابيب إلى حل تماما أي رواسب.
  2. إضافة الخل 250 ميكرولتر الخليك إلى كل أنبوب زجاجي. كاب، دوامة بدقة، ويصوتن في حمام مائي لمدة 2 دقيقة لضمان حل كامل من أي مخلفات ورواسب.
  3. تغطية أنابيب زجاجية مع رقائق الألومنيوم، واحتضان عند درجة حرارة داخلية تبلغ 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 230 ميكرولتر يتركز حامض trifluoroacetic (TFA) لكل عينة. سقف على الفورد مزج العينات. ثم، احتضان عينات مغطاة رقائق الألومنيوم لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة داخلية تبلغ 50 درجة مئوية.
  5. بعد الحضانة، إضافة 1.8 مل ثنائي كلورو ميثان (CH 2 الكلورين 2) لكل عينة. سقف وتخلط جيدا.
  6. إضافة 2.0 مل منزوع الأيونات الماء إلى كل عينة. كاب وعينات المزيج جيدا. أجهزة الطرد المركزي من 0 إلى 3000 × ز لفصل طبقات. استخدام ماصة غير silanized باستور لأداء السائل استخراج / السائل كما هو موضح في الخطوة 1.4.6، وتجنب تلوث المياه.
  7. كرر استخراج مرة أخرى، ليصبح المجموع اثنين الاستخراج. استخدام ماصات باستور silanized لنقل الطبقة العضوية إلى المعنون باسم silanized AS قارورة (عقدت بشكل آمن في رف ع). ملء قارورة AS إلى أقل بقليل من أسنانها.
  8. استخدام قبل ساخنة، كتلة التدفئة الضحلة جيدا لعينات الجافة (في AS قارورة) لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية تحت غاز النيتروجين. لا أكثر الجافة. ومن المعروف أن المنتجات النهائية كما الأسيتات alditol مميثل جزئيا (PMAAs).

5. الغاز اللوني - الطيف الكتلي (GC-MS)

  1. إعادة كل عينة في 100 ميكرولتر من الأسيتون وتخلط جيدا. استخدام الاوتوماتيكى لحقن 1 ميكرولتر من كل عينة في وضع الانقسام في GC انقسام وضع بطانة (الحفاظ على 280 درجة مئوية، وتحتوي على المكونات الصغيرة من الصوف الزجاجي silanized). استخدام نسبة الانقسام 40. استخدام الهيليوم بوصفها الناقل للغاز في نمط التدفق الثابت في 0.8 مل / دقيقة خلال 30 م DB-5MS العمود GC مع معرف 0.25 مم و 0.25 ميكرون سمك الفيلم.
  2. عقد درجة حرارة الفرن GC الأولية في 165 درجة مئوية لمدة 0.5 دقيقة. بعد وقت عقد الأولي، برنامج الفرن إلى منحدر درجة الحرارة، ولكل شوط، من 165 درجة مئوية إلى 265 درجة مئوية بمعدل 10 درجة مئوية / دقيقة (والذي يستغرق 10 دقيقة)، وبعد ذلك على الفور منحدر درجة حرارة 265 درجة مئوية إلى 325 درجة مئوية في معدل 30 درجة مئوية / دقيقة (الذي يأخذ 2 دقيقة) والحفاظ على درجة حرارة 325 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. إجمالي وقت التشغيل في العينة 15.5 دقيقة.
  3. استخدام مؤيدضبطها بيرلي ومعايرة مطياف الكتلة لإخضاع مكونات عينة يبلغ حجمه من العمود GC إلى إلكترون التأين (EI، 70 فولت عند 250 درجة مئوية). لمحلل كتلة TOF وتحليل شظايا من م / ض 40 إلى م / ض 800 مع 0.1 ثانية معدل الجمع النبض. تعيين EI خيوط تأخير الوقت المذيبات من 2.5 دقيقة.

تحليل 6. البيانات

  1. في حالة استخدام محلل كتلة TOF، خلاصة القول أيونات جزء الأكثر وفرة و / أو التشخيص لكل PMAA من خلال تطبيق إطار شامل من 0.15 دا للحصول على اللوني ايون المستخرج. وقد نشرت أيونات هدف لكل PMAA في أي مكان آخر، 33 ولكن تم إجراء التعديلات التالية: أيونات تي GLC الآن 145.1 + 205.1. 2-رجل الأيونات 161.1 + 189.1. 3-غال الأيونات 161.1 + 233.1، 6 غال الأيونات 161.1 + 189.1 + 233.1. 2،6 الرجل أيون هو 189.1. أيونات 3،6 الرجل هي 189.1 + 233.1.
  2. استخدام QuanLynx أو غيرها من البرامج لدمج المناطق الذروة لكل لخص استخراج اللوني ايون تلقائيا.
    3. يدويا تحقق نتائج التكامل عن طريق عرض كل متكامل اللوني ايون المستخرج. ثم، تصدير البيانات ذروة التكامل إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل وتطبيع البيانات، والذي ينطوي على تقسيم مساحة كل XIC هيكسوز الفردية عن طريق مجموع كل المناطق هيكسوز XIC. وبالمثل، يتم تقسيم مساحة كل فرد HexNAc XIC على مجموع كل المناطق HexNAc XIC. هذا الإجراء ينتج فرة طبيعية لكل هيكسوز الفردي وHexNAc.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأظهرت اللوني الحالي مجموع ايون (TIC) تظهر permethylation ناجحة، التحلل، والحد، وأستلة من عينات بلازما الدم الإنسان بالنسبة إلى الحالات التي تم فيها تنفيذ خطوتين permethylation الحرجة بشكل غير صحيح في الشكل (3).

مطلق محصول HexNAcs بالنسبة إلى Hexoses:

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بشكل عام، وإنتاج ناجحة من الأسيتات alditol مميثل جزئيا (PMAAs) من hexoses محفوف صعوبات أقل وأكثر قوة من الإنتاج الناجح لN -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. الآلية الدقيقة وراء هذه الظاهرة كما أنه يلعب بها في كل خطوة من هذا الإجراء غير معروف، ولكن يجب أن تتصل الكيمياء فريد من مجموعة -acetyl N (بدلا من مجموعة الهيدروكسيل) التي هي فريدة من نوعها لHexNAcs نسبة إلى hexoses. وأوضح آلية وراء هذه الظاهرة من حيث صلته حمض المائي في أماكن أخرى. 43 وباختصار، فإن ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل كلية الفنون والعلوم الليبرالية بجامعة ولاية أريزونا في شكل أموال بدء تشغيل المختبرات ل CRB. كما تم دعمه بمنحة من مؤسسة فلين (المنحة رقم 1977) ومن المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R33CA191110. تم دعم JA من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة برنامج تعليم أبحاث ما بعد البكالوريا (PREP) بموجب الجائزة رقم R25GM071798. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حبات هيدروكسيد الصوديوم 367176Sigma-Aldrich 20-40 شبكة ، درجة الكاشف 97٪
0.9 مل عمود الدوران69705قسم بيرس من ThermoFisher Scientific   ؛يشمل المقابس وفريتس البولي إيثيلين 
قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية GC-MS (سيليانية) *C4000-9ThermoFisher ScientificTarget DP قارورة استرداد عالية ، 1.5 & nbsp ؛ مل ، 12   ؛ مم × 32   ؛ مم ، ويشمل أغطية مثقوبة مبطنة بالتفلون
1.5 مل أنابيب اختبار البولي بروبلين05-402-25ThermoFisher Scientific   ؛غطاء كبس
2 مل أنابيب اختبار البولي بروبلين05-408-138ThermoFisher Scientific غطاء كبس
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)D8418سيجما ألدريتش   ؛الكاشف الحيوي للبيولوجيا الجزيئية ، درجة الكاشف >99.0٪
اليودوميثان I8507سيجما - ألدريتش   ؛يحتوي على النحاس كمثبت ، ReagentPlus 99٪
أسيتونيتريلA955-4ثيرموفيشر العلمي أوبتيما LC / MS
أجهزة الطرد المركزيالدقيقة 75002436: Sorvall Legend Micro 17 جهاز طرد مركزيThermoFisher Scientific دوار 24 × 1.5 / 2.0 مع غطاء الاحتواء الحيوي ClickSeal. رقم كتالوج الدوار: 75003424
13 × 100 أنبوب اختبار زجاجي (سيلياني) *53283-800VWR13 مم × 100 مم أنابيب اختبار زجاجية من البورسليكات مع غطاء لولبي
أغطية لأنابيب اختبار الزجاج14-930-15DThermoFisher Scientific   ؛Kimble& trade; أغطية برغي الفينول السوداء. 13  مم -415 خيط GPI ؛ بطانة مطاطية ذات وجه PTFE.
كلوريد الصوديوم S7653سيجما ألدريتش  >99.5٪ نقي
الكلوروفورم4440-08ماكرون فاين كيماويات 
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 299537Sigma-Aldrich 99٪ منقى عن طريق إعادة التقطير لتسلسل البروتين   ؛
بوروهيدريد الصوديوم71321Fluka Analytical  99٪
محلول هيدروكسيد الأمونيوم  320145Sigma-Aldrich محتوى NH3: 28.0-30.0٪
الميثانولAH230-4هانيويل بورديك & أمبير جاكسونHPLC الصف
حمض الخليك 320099Sigma-Aldrich 99.70٪
مجفف فراغ بلاستيكي   ؛أي نموذج من الحجم المناسبFoodSaver
خليك أنهيدريد  539996Sigma-Aldrich 99.50٪
ثنائي كلورو ميثان D143SK-4ThermoFisher العلمية درجة HPLC مستقرة
الأسيتون 9006-03تحليل جي تي بيكربيكر 
مشعب التبخر الساخن (الوحدة الرئيسية)pi18823ThermoFisher Scientific التسخين والتحريك الحرارية العلمية * Reacti-Therm ؛ نموذج ثلاثي الكتل مع وظيفة التسخين والتحريك
مشعب التبخر الساخن (المبخر العلوي)pi18826ThermoFisher Scientific مبخر ThermoScientific * Reacti-Vap ، 27 منفذا ؛ للاستخدام مع وحدة التسخين ثلاثية الكتل Reacti-Therm
كتل حامل عينة من الألومنيوم لمشعب التبخرpi18816ThermoFisher Scientific   ؛بلوك ، ألومنيوم ، Reacti-block S-1 ، يحمل 13   ؛ مم أنابيب اختبار ضياء ، 13 ثقبا (14 & nbsp ؛ مم قطر × 45 & nbsp ؛ مم)
كروماتوجراف الغازنموذج A7890Agilent & nbsp ؛مجهزة بجهاز أخذ العينات الآلي CTC PAL
مطياف الكتلة GCT Premier (Time-of-Flight)Waters 
بطانة الوضع المنفصل (معطلة / سيليانية)5183-4647Agilentتحتوي على سدادة صغيرة من الصوف الزجاجي السيلاني
DB-5ms GC العمود122-5532Agilent30 م × 0.25 مم معرف × 0.25 ميكرون سمك الفيلم
Chlorotrimethylsilane95541Sigma-Aldrich & nbsp ؛
مجفف فراغ زجاجي (لسيلان الأواني الزجاجية)EW-06536-30Cole-Parmer12 بوصة عريضة ؛ حجم اللوحة 230 مم
وحدة < td colspan = "4" > * يتم تنفيذ سيلان الأواني الزجاجية في المنزل ، طوال الليل باستخدام بخار الكلوروتريميثيل سيلان في مجفف فراغ زجاجي كبير.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
  2. Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).
  3. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  4. Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
  5. Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
  6. Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
  7. An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
  8. Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
  9. Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
  10. Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
  11. Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
  12. Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
  13. Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
  14. Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
  15. Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
  16. Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
  17. Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
  18. Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
  19. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
  20. Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
  21. Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
  22. Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
  23. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  24. Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
  25. Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
  26. Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
  27. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
  28. Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
  29. Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
  30. Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
  31. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  32. Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
  33. Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
  34. Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
  35. Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
  36. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
  37. Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
  38. Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
  39. Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
  40. Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
  41. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
  42. Seed, B. Silanizing glassware. Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).
  43. Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة