التحقيق في وظيفة من Coronin (أ) في المجاعة الاستجابة المبكرة لل<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; من جانب تجميع فحوصات

ملخص

الأميبا الاجتماعية Dictyostelium discoideum تخضع لانتقال تنموي إلى كائن متعدد الخلايا عند تجويعها. يلعب البروتين التطوري المحفوظ كورونين أ دورا مهما في بدء التطور. باستخدام فحوصات التجميع كطريقتنا الرئيسية ، نهدف إلى توضيح دور الكورونين أ في التطور المبكر.

الملخص

تم العثور على Dictyostelium discoideum الاميبا في التربة وتتغذى على البكتيريا. عندما تصبح المصادر الغذائية الشحيحة، لأنها تفرز عوامل لبدء برنامج تنمية متعددة الخلايا خلالها الخلايا وحيدة chemotax نحو مراكز التجميع ^1-4. هذه العملية تعتمد على إطلاق سراح الأدينوزين الأدينوزين الحلقي (المخيم) ^5. وينتج المخيم في موجات من خلال اتخاذ إجراءات متضافرة من محلقة محلقة وphosphodiesterases، ويربط G البروتين يقترن مستقبلات المخيم ^6،7. وفحص تستخدم على نطاق واسع لتحليل الآليات التي تشارك في دورة التنموية للانخفاض حقيقي النواة Dictyostelium discoideum يقوم على الملاحظة من تجميع الخلايا في ظروف المغمورة ^8،9. يصف هذا البروتوكول تحليل دور coronin (أ) في دورة التنموية جوعا في لوحات زراعة الأنسجة مغمورة في محلول ملحي متوازن (BSS) ^10. Coronin (أ) هو عضو في العلاقات العامة المحفوظة على نطاق واسععائلة otein من coronins التي تورطت في مجموعة واسعة من الأنشطة ^11،12 الخلايا Dictyostelium تفتقر coronin وغير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا، ويمكن إنقاذ هذا العيب من خلال تزويد البقول من المخيم، مما يوحي بأن coronin وأعمال المنبع لل تتالي المخيم ^10. التقنيات الموضحة في هذه الدراسات توفر أدوات قوية لتحقيق وظائف البروتينات خلال المراحل الأولى من دورة التنموية للDictyostelium discoideum المنبع من سلسلة المخيم. لذلك، وذلك باستخدام هذا التجميع الفحص قد تسمح للمزيد من الدراسة coronin وظيفة وتعميق فهمنا للبيولوجيا coronin.

المقدمة

الأسرة coronin من البروتينات وحفظها للغاية في جميع أنحاء حقيقيات النوى. وتتميز هذه البروتينات عن طريق وجود الأمينية محطة التربتوفان اسبارتاتي (WD) تكرار المحتوية على المنطقة تليها منطقة فريدة من نوعها متصلة مجال ملفوف لفائف-كربوكسي محطة ^13،14 (الشكل 1). قد تورطت Coronins في مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك تنظيم هيكل الخلية ونقل الإشارة ^12. في الثدييات، وتصل إلى ستة جزيئات قصيرة coronin (coronin 1-6)، فضلا عن "جنبا إلى جنب" coronin 7، يمكن أن يشترك في اعرب ^12،15. Coronin 1 هو فرد من أفراد الأسرة الأكثر دراسة على نطاق واسع، وتبين أن تشارك في تدمير مسببات المرض، T بقاء....

البروتوكول

1. مراقبة الاستجابة للجوع في وقت مبكر من Dictyostelium discoideum بواسطة المجهر مرور الزمن.
   1. زراعة خلايا DH1.10 أو خلايا كورا -deficient في قارورة تحتوي على Erlenmayer HL-5 متوسط ​​(لمدة 1 L: 5 ز بروتيوز ببتون، 5 ز thiotone E ببتون، و 10 غرام جلوكوز، 5 ز خلاصة الخميرة، 0.35 ز نا ₂ هبو ₄ * 7H ₂ O، 0.35 ز KH ₂ PO _4، 0.05 غ ثنائي هيدروستريبتوميسين للكبريتات، ودرجة الحموضة 6.6) عند 22 درجة مئوية في حاضنة تهتز مع دوران 160 دورة في الدقيقة. حفاظ على الخلا....

النتائج

خلايا من نقص في coronin وتظهر وجود خلل في التنمية في وقت مبكر (الشكل 2). في غياب coronin والخلايا غير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا، التي هي الخطوة الأولى خلال دورة التنموية للDictyostelium discoideum. لذلك، يظهر coronin ألف للعب دور خلال الاستجابة للجوع في وقت مبكر و / أو إشارات المخيم. في الواقع، ويرافق عدم تشكيل الكلي متعددة الخلايا في غياب coronin A عن طريق خفض المخيم مما يشير إلى ^10. ومع ذلك، فإن تط.......

المناقشة

وتوجد البروتينات coronin في معظم الأنواع من كليد حقيقية النواة. Dictyostelium discoideum coronin A، ونديد من coronin الثدييات 1، ويشارك في الاستجابة للجوع في وقت مبكر، منذ coronin A-نقص الخلايا ليست قادرة على تشكيل مراكز التجميع خلال وقت مبكر التنموية دورة ^10. لتكون قادرة على كميا وبدقة تقييم تأخير في التنمية بين السلالات، المجهر الخلية الحية التصوير انشاء مع وحدة تحكم مرحلة الآلي هو أداة أساسية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وسائط HL-5 (ل 1 لتر: 5 جم بيبتون بروتيازي ، 5 جم ثيوتون إي بيبتون ، 10 جم جلوكوز ، 5 جم مستخلص خميرة ، 0.35 جم Na 2< / sub>HPO4< / sub> * 2H2< / sub>O ، 0.35 جم KH2< / sub>PO4< / sub> ، 0.05 جم ثنائي هيدروستربتومايسين كبريتات ، درجة الحموضة 6.6)
البروتيوز البيبتون	BD Bioscience	211693
ثيوتون إي ببتون	BD Bioscience	211684 مستخلص
	Bioscience BD Bioscience	212750
Glucose	AppliChem	A3666
Na 2< / sub>HPO4< / sub> * 2H2< / sub>	O Fluka	71643
KH2< / sub>PO4< / sub>	AppliChem	A1043
ثنائي هيدروستربتومايسين كبريتات	سيجما ألدريتش	D1954000
PBM (0.02 M فوسفات البوتاسيوم ، 10 & mu ؛ M CaCl 2< / sub > ، و l mM MgCl 2< / sub > ، درجة الحموضة 6.1)			عصامي
الصنع (10 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي كلوريد كلوريد ، 2.5 ملي كاستوريد الكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي > ، درجة الحموضة 6.5)			عصامي
0.45-& مو ؛ م مرشح Filtropure S	Sarstedt	83.1826
Falcon 24-well لوحة زراعة الأنسجة	فيشر Scientific	08-772-1H
مجهر Cellobserver	Zeiss		مخصص
مصمم برنامج AxioVision	Zeiss
IPC المعالج الدقيق – مضخة الاستغناء الخاضعة للرقابة	ISMATEC	ISM 931
Axiovert 135M مجهر	Zeiss	491237-0001-000
حضانة شاكر	Inforst HT Minitron

الخميرة BD BSS