مقالة منهجية

التحقيق في وظيفة من Coronin (أ) في المجاعة الاستجابة المبكرة لل Dictyostelium discoideum من جانب تجميع فحوصات

DOI:

10.3791/53972

⸱

يونيو 18, 2016

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأميبا الاجتماعية Dictyostelium discoideum تخضع لانتقال تنموي إلى كائن متعدد الخلايا عند تجويعها. يلعب البروتين التطوري المحفوظ كورونين أ دورا مهما في بدء التطور. باستخدام فحوصات التجميع كطريقتنا الرئيسية ، نهدف إلى توضيح دور الكورونين أ في التطور المبكر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم العثور على Dictyostelium discoideum الاميبا في التربة وتتغذى على البكتيريا. عندما تصبح المصادر الغذائية الشحيحة، لأنها تفرز عوامل لبدء برنامج تنمية متعددة الخلايا خلالها الخلايا وحيدة chemotax نحو مراكز التجميع 1-4. هذه العملية تعتمد على إطلاق سراح الأدينوزين الأدينوزين الحلقي (المخيم) 5. وينتج المخيم في موجات من خلال اتخاذ إجراءات متضافرة من محلقة محلقة وphosphodiesterases، ويربط G البروتين يقترن مستقبلات المخيم 6،7. وفحص تستخدم على نطاق واسع لتحليل الآليات التي تشارك في دورة التنموية للانخفاض حقيقي النواة Dictyostelium discoideum يقوم على الملاحظة من تجميع الخلايا في ظروف المغمورة 8،9. يصف هذا البروتوكول تحليل دور coronin (أ) في دورة التنموية جوعا في لوحات زراعة الأنسجة مغمورة في محلول ملحي متوازن (BSS) 10. Coronin (أ) هو عضو في العلاقات العامة المحفوظة على نطاق واسععائلة otein من coronins التي تورطت في مجموعة واسعة من الأنشطة 11،12 الخلايا Dictyostelium تفتقر coronin وغير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا، ويمكن إنقاذ هذا العيب من خلال تزويد البقول من المخيم، مما يوحي بأن coronin وأعمال المنبع لل تتالي المخيم 10. التقنيات الموضحة في هذه الدراسات توفر أدوات قوية لتحقيق وظائف البروتينات خلال المراحل الأولى من دورة التنموية للDictyostelium discoideum المنبع من سلسلة المخيم. لذلك، وذلك باستخدام هذا التجميع الفحص قد تسمح للمزيد من الدراسة coronin وظيفة وتعميق فهمنا للبيولوجيا coronin.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسرة coronin من البروتينات وحفظها للغاية في جميع أنحاء حقيقيات النوى. وتتميز هذه البروتينات عن طريق وجود الأمينية محطة التربتوفان اسبارتاتي (WD) تكرار المحتوية على المنطقة تليها منطقة فريدة من نوعها متصلة مجال ملفوف لفائف-كربوكسي محطة 13،14 (الشكل 1). قد تورطت Coronins في مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك تنظيم هيكل الخلية ونقل الإشارة 12. في الثدييات، وتصل إلى ستة جزيئات قصيرة coronin (coronin 1-6)، فضلا عن "جنبا إلى جنب" coronin 7، يمكن أن يشترك في اعرب 12،15. Coronin 1 هو فرد من أفراد الأسرة الأكثر دراسة على نطاق واسع، وتبين أن تشارك في تدمير مسببات المرض، T بقاء الخلية والإشارات العصبية. كيف، بالضبط، coronin 1 تنفذ هذه الأنشطة لا تزال غير واضحة. في حين coronin 1 وقد تبين لتنظيم الكالسيوم 2+ إشارة، التي تعتمد على المخيم وكذلك F-الأكتين الهيكل الخلوي تعديل 16-18، وشارك محتملجعلت -expression تصل إلى 7 أفراد الأسرة في الثدييات صعوبة في دراسة وظيفة الجزيئية للcoronins في هذه الأنظمة، وذلك بسبب التكرار المحتملة. على عكس الكائنات الثديية، وانخفاض discoideum حقيقي النواة Dictyostelium يعبر عن اثنين فقط من أعضاء coronin الأسرة (coronin ألف، ortholog من الثدييات coronin 1 و coronin باء، ortholog من coronin الثدييات 7) مع وظائف على ما يبدو غير زائدة 15،19،20. هذه الحقيقة تجعل Dictyostelium discoideum نموذجا قويا لدراسة وظيفة coronins.

لدراسة دور coronin وفي Dictyostelium discoideum، نحن الناجم عن دورة التنموية جوعا في لوحات زراعة الأنسجة التي تحتوي على عازلة متوازن محلول الملح (BSS) باستخدام خلايا نوع البرية أو الخلايا التي تفتقر إلى coronin و10. لقد وجدنا أن الخلايا التي تفتقر إلى coronin وكانت غير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا على الموت جوعا. للحصول على التقييم الكمي الدقيق لهذا النمط الظاهري للالآلية تصوير الخلايا الحية وصفها في هذا البروتوكول هو أداة حيوية. الخلل في الشروع في الاستجابة للجوع في وقت مبكر في الخلايا التي تفتقر إلى coronin ويمكن إنقاذهم عن طريق توفير نبضات من المخيم، مما يوحي بأن coronin وأعمال المنبع من سلسلة المخيم. وقد استخدم تطبيق خارجي من البقول المخيم لمحاكاة بدء التنمية من خلال عدة مختبرات في 8،9 الماضي. ومع ذلك، ويعرف هذا الإجراء أيضا أن تعتمد إلى حد كبير على كثافة الخلايا وتوقيت. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يهدف للحد من هذه المتغيرات وذلك لضمان درجة عالية من التكاثر. معا، والتقنيات المستخدمة في هذه الدراسات توفر أدوات قوية لتحقيق وظائف البروتينات خلال المراحل المبكرة من دورة التنموية للDictyostelium discoideum ولديها القدرة على تحديد حتى- وكذلك المؤثرات المصب coronin وظيفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. مراقبة الاستجابة للجوع في وقت مبكر من Dictyostelium discoideum بواسطة المجهر مرور الزمن.
    1. زراعة خلايا DH1.10 أو خلايا كورا -deficient في قارورة تحتوي على Erlenmayer HL-5 متوسط ​​(لمدة 1 L: 5 ز بروتيوز ببتون، 5 ز thiotone E ببتون، و 10 غرام جلوكوز، 5 ز خلاصة الخميرة، 0.35 ز نا 2 هبو 4 * 7H 2 O، 0.35 ز KH 2 PO 4، 0.05 غ ثنائي هيدروستريبتوميسين للكبريتات، ودرجة الحموضة 6.6) عند 22 درجة مئوية في حاضنة تهتز مع دوران 160 دورة في الدقيقة. حفاظ على الخلايا في مناطق ذات كثافة بين 0.01 × 10 6 خلية / مل و 2 × 10 6 خلية / مل.
    2. دراسة تجميع الخلية، من خلال حصاد سجل مرحلة النمو خلايا DH1.10 21 أو خلايا كورا -deficient 10 ولدت في الخلفية DH1.10، ونمت في هز الثقافة مع HL-5 المتوسط ​​عند 22 درجة مئوية. للقيام بذلك، أخذ كمية مناسبة من الخلايا (عادة ما بين 10 و 50 مل)، الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 x ج وغسل الخلايا مرتين في BSS (10 ملي كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل2.5 ملي CaCl 2، ودرجة الحموضة 6.5).
    3. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. وفي وقت لاحق، وخلايا لوحة في كثافة (5، 10، 20، أو 40) × 10 4 خلية / سم 2 في 24 لوحة جيدا. تسمح لهم الالتزام لمدة 1 ساعة على 22 درجة مئوية في BSS.
    4. تصور التجميع بواسطة المجهر مرور الزمن كما هو موضح قبل 10، التقاط الصور في كل 135 ثانية. باستخدام التصوير الخلية الحية اقامة مجهزة الهدف 5X وكاميرا الجهاز المسؤول عن جانب-بضرب الإلكترون الآلي عن البرنامج المناسب (انظر المواد الجدول).
  2. ينبض معسكر خلايا discoideum Dictyostelium خلال المجاعة.
    1. دراسة تأثير البقول المخيم تطبيقها خارجيا على تطوير خلايا DH1.10 21 أو خلايا 10 DH1.10 كورا -deficient، من خلال حصاد الخلايا. للقيام بذلك، أخذ كمية مناسبة من الخلايا (عادة ما بين 10 و 50 مل)، الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 x ج ويغسل مرتين في BSS.
    2. فصول التوجيه الجامعيخلايا الإقليم الشمالي باستخدام عدادة الكريات و resuspend الخلايا إلى كثافة من 1 × 10 7 خلية / مل في BSS. يهز الثقافات (160 دورة في الدقيقة) عند 22 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل تطبيق البقول. إضافة البقول المخيم باستخدام جهاز توقيت تسيطر مضخة تحوي. برمجة المضخة لتسليم نبض 5 ثانية كل 6.5 دقيقة 15 ميكرولتر من 50 نانومتر مخيم (تركيز النهائي) خلال الفترة من 5 ساعة.
    3. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. وفي وقت لاحق، لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من (5، 10، 20، أو 40) × 10 4 خلية / سم 2 في 24 لوحة جيدا. السماح لتنضم لمدة 1 ساعة في BSS.
    4. تصور التجميع بعد 16 ساعة على 22 درجة مئوية بواسطة المجهر مشرق الميدان باستخدام الهدف 5X.
  3. تحريض Dictyostelium تطوير discoideum من خلال التعرض إلى متوسطة مكيفة.
    1. إعداد المتوسطة مشروط جديدة كما هو موضح 22. جمع سجل في المرحلة خلايا DH1.10 21 أو خلايا 10 DH1.10 كورا -deficient، من الهز عبادةures مع HL-5 المتوسط ​​عند 22 درجة مئوية باستخدام ماصة، الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 x ج وغسل خلايا ثلاث مرات في PBM (0.02 فوسفات البوتاسيوم M، 10 ميكرومتر CaCl 2، و 1 ملي MgCl 2، ودرجة الحموضة 6.1).
    2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، و resuspend هذه في PBM في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 7 خلية / مل ويهز لمدة 20 ساعة على 110 دورة في الدقيقة / 22 ° C.
    3. جمع المتوسطة مكيفة بعد الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 3 دقائق وتوضيح بواسطة الطرد المركزي في 8000 × ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    4. مرشح مكيفة المتوسطة من خلال مرشح 0.45 ميكرون (انظر الجدول المواد)، ويخفف بمقدار ثلاثة أضعاف في PBM.
    5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ولوحة في كثافة (5، 10، 20، أو 40) × 10 4 خلية / سم 2 في 24 لوحة جيدا. تسمح لهم الالتزام لمدة 1 ساعة عند 22 درجة مئوية.
    6. صرف طاف من الخلايا مع المتوسط ​​مكيفة أعدت مسبقا.
    7. تصور تجميع لfter 16 ساعة بواسطة المجهر مشرق الميدان باستخدام الهدف 5X.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا من نقص في coronin وتظهر وجود خلل في التنمية في وقت مبكر (الشكل 2). في غياب coronin والخلايا غير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا، التي هي الخطوة الأولى خلال دورة التنموية للDictyostelium discoideum. لذلك، يظهر coronin ألف للعب دور خلال الاستجابة للجوع في وقت مبكر و / أو إشارات المخيم. في الواقع، ويرافق عدم تشكيل الكلي متعددة الخلايا في غياب coronin A عن طريق خفض المخيم مما يشير إلى 10. ومع ذلك، فإن تط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتوجد البروتينات coronin في معظم الأنواع من كليد حقيقية النواة. Dictyostelium discoideum coronin A، ونديد من coronin الثدييات 1، ويشارك في الاستجابة للجوع في وقت مبكر، منذ coronin A-نقص الخلايا ليست قادرة على تشكيل مراكز التجميع خلال وقت مبكر التنموية دورة 10. لتكون قادرة على كميا وبدقة تقييم تأخير في التنمية بين السلالات، المجهر الخلية الحية التصوير انشاء مع وحدة تحكم مرحلة الآلي هو أداة أساسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مركز مخزون Dictyostelium على السلالات والكواشف. تم تمويل هذه الدراسة من خلال منح من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم وكانتون بازل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسائط HL-5 (ل 1 لتر: 5 جم بيبتون بروتيازي ، 5 جم ثيوتون إي بيبتون ، 10 جم جلوكوز ، 5 جم مستخلص خميرة ، 0.35 جم Na 2< / sub>HPO4< / sub> * 2H2< / sub>O ، 0.35 جم KH2< / sub>PO4< / sub> ، 0.05 جم ثنائي هيدروستربتومايسين كبريتات ، درجة الحموضة 6.6)
البروتيوز البيبتونBD Bioscience211693
ثيوتون إي ببتونBD Bioscience211684 مستخلص
Bioscience BD Bioscience212750
GlucoseAppliChemA3666
Na 2< / sub>HPO4< / sub> * 2H2< / sub>O Fluka71643
KH2< / sub>PO4< / sub>AppliChemA1043
ثنائي هيدروستربتومايسين كبريتاتسيجما ألدريتشD1954000
PBM (0.02 M فوسفات البوتاسيوم ، 10 & mu ؛ M CaCl 2< / sub > ، و l mM MgCl 2< / sub > ، درجة الحموضة 6.1)عصامي
الصنع (10 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي كلوريد كلوريد ، 2.5 ملي كاستوريد الكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي > ، درجة الحموضة 6.5)عصامي
0.45-& مو ؛ م مرشح Filtropure SSarstedt83.1826
Falcon 24-well لوحة زراعة الأنسجةفيشر Scientific08-772-1H
مجهر CellobserverZeissمخصص
مصمم برنامج AxioVisionZeiss
IPC المعالج الدقيق – مضخة الاستغناء الخاضعة للرقابةISMATECISM 931
Axiovert 135M مجهرZeiss491237-0001-000
حضانة شاكرInforst HT Minitron
الخميرة BD BSS

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
  2. Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
  3. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
  4. Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
  5. Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
  6. Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
  7. Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
  8. Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
  9. Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
  10. Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
  11. Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268(2011).
  12. Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
  13. Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
  14. Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
  15. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
  16. Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820(2014).
  17. Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
  18. Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
  19. de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
  20. Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
  21. Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
  22. Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
  23. Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
  24. Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
  25. Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
  26. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Dictyostelium discoideumCoronin AAggregation AssayCyclic AMP PulsesCell AggregationTime lapse MicroscopyHemocytometer CountingConditioned MediumStarvation ResponseDevelopmental Biology

مقالات ذات صلة