مقالة منهجية

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D في فيفو

DOI:

10.3791/53989

⸱

مايو 9, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكولاجين هو العنصر الأساسي للECM، ويوفر منبهات أساسية لعدة عمليات الخلوية التي تتراوح بين الهجرة إلى التمايز والانتشار. المقدمة هنا هو بروتوكول لدمج الخلايا داخل الهلاميات المائية الكولاجين 3D، وتقنية أكثر تقدما لتوليد مصفوفات الكولاجين العشوائية أو الانحياز باستخدام microchannels PDMS.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تاريخيا ، تمت دراسة معظم العمليات الخلوية في بعدين فقط. في حين أن هذه الدراسات كانت مفيدة حول آليات إشارات الخلية العامة ، إلا أنها تهمل الإشارات الخلوية المهمة الواردة من الخصائص الهيكلية والميكانيكية للبيئة المكروية المحلية والمصفوفة خارج الخلية (ECM). لفهم كيفية تفاعل الخلايا داخل ECM الفسيولوجي ، من المهم دراستها في سياق فحوصات ثلاثية الأبعاد. هجرة الخلايا وتمايز الخلايا وتكاثر الخلايا ليست سوى عدد قليل من العمليات التي ثبت أنها تتأثر بالتغيرات المحلية في الخصائص الميكانيكية ل ECM ثلاثي الأبعاد. الكولاجين الأول ، وهو مكون ليفي أساسي في ECM ، هو أكثر من مجرد عنصر هيكلي بسيط للنسجة. في ظل الظروف العادية ، تقوم الإشارات الميكانيكية من شبكة الكولاجين بتوجيه التشكل والحفاظ على الهياكل الخلوية. في البيئات الدقيقة المريضة ، مثل البيئة المكروية للورم ، غالبا ما يتم إعادة تشكيل شبكة الكولاجين بشكل كبير ، مما يدل على تغيير التركيب والترسيب المعزز وتغيير تنظيم الألياف. في سرطان الثدي ، تعتبر درجة محاذاة الألياف مهمة ، حيث ارتبطت الزيادة في الألياف المحاذاة المتعامدة مع حدود الورم بتشخيص المريض الفقير1. تؤدي مصفوفات الكولاجين المحاذاة إلى زيادة انتشار الخلايا السرطانية عن طريق الهجرة المستمرة2،3. فيما يلي بروتوكول بسيط لتضمين الخلايا داخل هيدروجيل الكولاجين الليفي ثلاثي الأبعاد. هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة مع العديد من المنصات ، ويمكنه إنشاء مصفوفات كولاجين محاذاة وعشوائية بشكل متكرر للتحقيق في هجرة الخلايا وانقسام الخلايا والعمليات الخلوية الأخرى في بيئة مكروية فسيولوجية قابلة للضبط وثلاثية الأبعاد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'>تمت دراسة العديد من العمليات الخلوية على نطاق واسع في بعدين ، وبالتالي تشكيل معرفة جماعية بآليات إشارات الخلية الأساسية. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات تهمل الإشارات الخلوية المهمة الواردة من الخصائص الهيكلية والميكانيكية للبيئة الخلوية المحلية والمصفوفة خارج الخلية (ECM). لفهم كيفية تفاعل الخلايا بشكل أفضل في سياق فسيولوجي ، من المهم دراستها في فحوصات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). يمكن أن تكون ECM لهذه المقايسات ثلاثية الأبعاد مشتقة من الخلية أو إعادة تكوينها من البروتينات المنقاة. بغض النظر عن مصدر ECM ، أثبتت فحوصات المصفوفة ثلاثية الأبعاد أنها لا تقدر بثمن لفهم كيفية تنقل الخلايا وتفاعلها داخل العالم الفسيولوجي. على سبيل المثال ، تعرض الخلايا المزروعة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد أنماطا مميزة للحركة تعتمد على الطبيعة الميكانيكية ل ECM المحيطة بها والتي لم يتم ملاحظتها في التجارب ثنائية الأبعاد4-6. علاوة على ذلك ، تحتوي الخلايا المزروعة في 3D أيضا على ألياف إجهاد والتزامات بؤرية أقل وضوحا من نظيراتها المزروعة على الأسطح الصلبة مثل الزجاج أو البلاستيك7.

لا تقتصر أهمية المقايسات ثلاثية الأبعاد السياقية على هجرة الخلايا. لا يمكن التحقيق في بعض أحداث إشارات الخلية الأخرى إلا من خلال استخدام المقايسات ثلاثية الأبعاد. أثناء تمايز الأنسجة والخلايا ، توفر تصلب البيئة خارج الخلية و ECM إشارات يمكن أن تؤثر على الأحداث المورفولوجية. على سبيل المثال ، يحدث تكوين الأنابيب الظهارية الثديية فقط في المصفوفات ثلاثية الأبعاد منخفضة الصلابة ، ولكن ليس في المصفوفات الصلبة ولا في الطبقات السفلية ثنائية الأبعاد8،9. عند استزراعها داخل مصفوفات ثلاثية الأبعاد صلبة ، تأخذ هذه الخلايا الظهارية نفسها نمطا ظاهريا شاذا مع زيادة التكاثر ونتوءات غشاء الخلية مدفوعة من خلال إشارات FAK و ERKالمتغيرة 10. من المعروف أن العديد من مسارات الإشارات والعمليات الخلوية الأخرى تتأثر بالمثل بصلابة البيئة الخلوية المحلية ، وتسلط شلالات الإشارات هذه الضوء على أهمية التحقيق في أحداث الإشارات والنمط الظاهري الخلوي في سياق الخصائص الميكانيكية المحلية المناسبة ل 3D ECM.

Collagen I هو بروتين مناسب بشكل خاص لاستخدامه في الدراسات المختبرية لأنه المكون الأكثر وفرة في ECM وهو مسؤول عن العديد من الخصائص الميكانيكية للبيئة الخلوية المكروية. بينما كان يعتقد في الأصل أنه مجرد بروتين هيكلي ، إلا أنه من المعروف الآن أن دوره أكثر تعقيدا. توفر تركيبة ألياف الكولاجين ، والهندسة المعمارية ، والتوجيه ، والكثافة ، والصلابة بيئة مركزة من معلومات الإشارات5. أثناء تطور بعض الأمراض ، مثل الالتهاب المزمن وتكوين الأورام ، يتم إعادة تشكيل شبكة الكولاجين بشكل كبير2،11. وبشكل أكثر تحديدا في سرطانات الثدي ، يصاحب ترسب الكولاجين المتزايد وتصلب الأنسجة ويساهم على الأرجح في تطور الورم. في هذه الأورام المبكرة ، تبدو شبكة الكولاجين المتصلبة متوترة وأكثر محاذاة ، بحيث تغلف معظم الألياف الورمالمتنامي 2. مع تقدم الورم ، يستمر الكولاجين في إعادة التنظيم ، وتصبح مناطق الشبكة الليفية موجهة بشكل عمودي على حدود الورم2،12. تعمل المحاذاة العمودية كمؤشر حيوي تنبؤي حيث يكون لدى هؤلاء المرضى تطور أضعف خال من المرض والبقاء على قيد الحياةبشكل عام 1. أحد تفسيرات هذا الارتباط هو أن النتائج السيئة هي نتيجة لزيادة انتشار الخلايا السرطانية عن طريق هجرة الخلايا المستمرة في شبكات الكولاجينالمحاذاة 3.

لفهم كيفية استجابة الخلايا على وجه التحديد للمحاذاة والتنظيم الذي يتم ملاحظته في تطور الورم ، من الضروري إنشاء مصفوفات كولاجين ثلاثية الأبعاد عشوائية ومحاذاة للتجريب. هناك ثلاث منهجيات أساسية للحث على المحاذاة داخل الشبكات الليفية. تستخدم التقنية الأولى جهازا محفزا للإجهاد حيث يتم تقلص الكولاجين بين نقطتين أو تمديده لتوليد المحاذاة. يتم سحب الألياف الموازية لمحور القوة مشدودة بينما يتم ضغط الألياف العمودية على المحور والتواءها. في حين أن التقنيات التي يسببها الإجهاد توفر عادة محاذاة رائعة ، فإن هذا النهج يتطلب معدات ضخمة لا يمكن تكييفها بسهولة مع العديد من المنصات3،13. بدلا من ذلك ، يمكن إنشاء سلالة ناتجة عن الخلايا عن طريق وضع سدادات موضعية من الخلايا التي تنقبض لاحقا وتحذي الكولاجين13. هذه الطريقة لديها مشكلة كونها متغيرة ، حيث قد تكون العديد من المعلمات عرضة للتغيير. تستخدم الطريقة الثانية حبات مغناطيسية ومجالا مغناطيسيا أثناء البلمرة للحث على محاذاة الكولاجين13،14. يمكن الحصول على نتائج جيدة من هذه الطريقة باستخدام معدات غير متطورة ، ولكنها تتطلب استخدام الأجسام المضادة أو بعض الطرق الأخرى لمغنطة البوليمر. لذلك ، قد يكون استخدامه مكلفا إلى حد ما ، ومن المحتمل أن يتم تعديل صلابة هلام الكولاجين من خلال زيادة الاتصالات في الشبكة. علاوة على ذلك ، غالبا ما تكون الخرزات المغناطيسية المستخدمة في هذه العملية ذاتية الفلورسنت ، مما يمثل مشكلة في تجارب التصوير. أخيرا ، يمكن إنشاء المحاذاة بواسطة قنوات الموائع الدقيقة PDMS3،15،16. في هذه الطريقة ، يتم تحقيق محاذاة الكولاجين عن طريق تدفق بلمرة الكولاجين عبر قنوات الموائع الدقيقة الصغيرة. يمكن صنع هذه القنوات الموائع الدقيقة في العديد من التصميمات ، ويمكن تكييفها بسهولة مع العديد من المنصات. علاوة على ذلك ، فهي اقتصادية للغاية حيث يتم استخدام كميات صغيرة جدا من الكولاجين والكواشف الأخرى نظرا لأحجامها الضئيلة.

بشرط أن يكون هناك بروتوكول بسيط لتضمين الخلايا داخل هيدروجيل الكولاجين الليفي ثلاثي الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا توفير تقنية أكثر تقدما ، حيث يتم استخدام قنوات الموائع الدقيقة PDMS للتحكم في تنظيم ومحاذاة مصفوفة الكولاجين. هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة مع العديد من المنصات ، ويمكنه إنشاء مصفوفات كولاجين محاذاة وعشوائية بشكل متكرر للتحقيق في هجرة الخلايا وانقسام الخلايا والعمليات الخلوية الأخرى في بيئة مكروية فسيولوجية ثلاثية الأبعاد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحييد، التخفيف وبلمرة الكولاجين حلول للتحقيق 3D والخلوية تقلص فحوصات

  1. على الجليد في معقم غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، وتحييد الكولاجين (1: 1) مع معقم، المثلج 100 ملي HEPES في 2X في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4، في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تخلط جيدا مع ماصة بلاستيكية حتى الحل هو متجانس والدوامات الاختلاط لم تعد مرئية. يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء أثناء عملية الخلط. تخزين لفترة وجيزة على الجليد.
  2. تمييع الكولاجين تحييد لتركيز مناسب مع وسائل الاعلام الخلية (مثل RPMI، DMEM، وما إلى ذلك).
    1. لحساب كمية الكولاجين تحييد اللازمة لتعويض تركيز الكولاجين المطلوب، استخدم المعادلة N = (D * V) / (S / 2)، حيث N هو كمية الكولاجين تحييد المطلوبة، D هو تركيز الكولاجين المطلوب، والخامس هو الحجم النهائي للتركيز الكولاجين المطلوب، وS هو رانه ابتداء من تركيز الأسهم الكولاجين.
    2. طرح كمية الكولاجين تحييد لحجم بإضافة حل الخلية وسائل الاعلام الخلية. تخلط جيدا وتخزينها على الجليد حتى جاهزة للادلاء.
      1. مثال: ل2 ملغ هلام مل / في حجم هلام 1 مل (حجم نموذجي ليلقي جل في 6 لوحة جيدا أو 50 ملم الزجاج طبق السفلي)، لأول مرة تتضاعف التركيز المطلوب (2 ملغ / مل) من الحجم النهائي المطلوب (1 مل). خذ هذا الرقم (2 ملغ) ونقسمه نصف تركيز الأسهم المدرجة في زجاجة (9.49 ملغ / مل). في هذه الحالة، يتم تخفيفه 0.42 مل من الكولاجين تحييد مع 0.58 مل من وسائل الاعلام / خلية الخليط.
  3. الماصة الكولاجين / خلية / خليط سائل الإعلام الجليد الباردة إلى أي ثقافة غير الأنسجة تعامل وحة 6 جيدا أو 50 ملم الزجاج طبق أسفل. استخدام طرف الماصة لموزعة بالتساوي على الحل.
    ملاحظة: من المهم استخدام ثقافة غير الأنسجة لوحة المعالجة للحد من المرفق أو نمو الخلايا خارج collagأون هلام.
  4. السماح لبلمرة في درجة حرارة الغرفة لحوالي 10-15 دقيقة. يجب أن المواد الهلامية تتحول مبهمة على البلمرة.
  5. بعد أن حولته مبهمة، نقل لوحة أو طبق إلى 37 مئوية لمدة إضافية 45 - 60 دقيقة لإنهاء البلمرة.
  6. بعد 45 - 60 دقيقة، إضافة 2-3 مل من وسائل الاعلام والافراج عن المواد الهلامية من جوانب البئر عن طريق تشغيل طرف P200 الماصة حول محيط البئر أو الطبق. طبق دوامة بلطف للافراج عن هلام. جل الكولاجين يجب أن يتحرك في وسائل الإعلام.

2. الغربية التنشيف، خلية التشكل وجل Gontractility الفحص

  1. لتقييم مستويات البروتين، مورفولوجيا أو انقباض الخلوية فيما يتعلق ECM صلابة، وتبدأ بصب المواد الهلامية الكولاجين، وفقا ل1،1-1،6، المصنف مع الخلايا لمدة 7 - فحص 10 يوم. تحديد كل معدل البذر خط الخلية تجريبيا اعتمادا على معدل النمو وconfluency. لفحص 10 يوما، يمكن للكثافة البذر تتراوح بين 20،000 - 100،000 خلية / هلام.
  2. لقياسانقباض الخلايا، وقياس قطرها هلام باستخدام مسطرة أو كاميرا كل 24 ساعة أو في الفاصل الزمني المناسب.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، الصور المقابلة التي جمعت من مجهر يمكن فحص للميزات المورفولوجية سمة من خط الخلية المصنف في هلام، مثل هياكل تشبه عنيبات، الأنابيب الظهارية، نتوءات الخلوية، وlameliapodia.
  3. لتقييم مستويات البروتين، ليز المواد الهلامية في المعهد الملكي العازلة وعملية تحليل لطخة غربية من البروتينات ذات الاهتمام كما هو موضح في وزنياك وآخرون. 17 و غالاغر وآخرون. 18.
    1. هام: في مقارنات انقباض بين خطوط الخلايا، وتطبيع انقباض في مجموع الحمض النووي، التي يمكن استخلاصها من المواد الهلامية على النحو المبين من قبل لوي، وآخرون 19، أو إلى لا تتغير، والبروتين التجهيزات المنزلية (الهستونات، GAPDH، الخ) عن طريق ويسترن. تحليل لطخة، كما هو موضح في وزنياك وآخرون. 17 و غالاغر وآخرون. 18. إذا عد الخلايا داخل الجل باستخدام عدادة الكريات، للتأكد من تطبيع عدد الخلايا إلى مجموع مساحة جل مثل هلام التعاقد سوف تركز الخلايا.
  4. المواد الهلامية تغذية كل 3-4 أيام عن طريق إزالة 1 مل من وسائل الإعلام واستبدالها مع 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة. تأكد لتغذية المواد الهلامية بعد أخذ قياس كما وبالاضافة الى وسائل الإعلام الجديدة / المصل يؤدي إلى ارتفاع في انقباض.

3. الجيل من PDMS Microchannels لالكولاجين الألياف محاذاة

ملاحظة: لتوليد مصفوفات الكولاجين الانحياز، قالبا للmicrochannels PDMS (الشكل 2A) يتطلب السيليكون سيد SU-8 التي تتم عن طريق لينة الطباعة الحجرية 15.

  1. لجعل قنوات PDMS، مزيج PDMS جيدا في كوب المتاح بعصا الحرفية. للسيد سيليكون 6 بوصة، مزج 20 غراما من قاعدة المطاط الصناعي مع 2 غرام من وكيل علاج.
  2. دي من الغاز الطبيعي في خليط PDMS عن طريق وضع كوب المتاح في فراغ الغرفة تحت ضغط الفراغ550 ملم زئبق. دي الغاز ل1-1،5 ساعة.
  3. في حين دي بالغاز في PDMS، وإعداد سيد السيليكون للصب. إعداد من خلال وضع ورقة نظيفة من فيلم الشفافية على موقد تليها سيد السيليكون. تأكد من أن القالب متناهية يواجه عقوبة تصل.
    ملاحظة: أثناء الصب PDMS والمعالجة، سوف تكون محصورة سيد سيليكون بين ورقتين من فيلم الشفافية.
  4. بعد 1-1،5 ساعة، وإزالة PDMS بالغاز دي من فراغ الغرفة، وببطء أكثر من صب سيد السيليكون.
    هام: تجنب فقاعات الهواء. يواصل صب في مركز الرئيسي، والسماح خطورة لانتشار بالتساوي.
    ملاحظة: انخفاض PDMS لا يحتاج إلى تقديم كل الطريق إلى حافة الرئيسي.
  5. بعد أن تم سكب PDMS على الماجستير، وتطبيق الورقة الثانية من فيلم الشفافية على رأس سيد السيليكون وPDMS. بعناية، ولفة ورقة الشفافية الثانية أسفل على رأس سيد PDMS / سيليكون لتجنب فقاعات الهواء. لا تستعجل. PDMS يجب الآن موزعة بالتساوي سالنسخة الرئيسية.
  6. وضع بلطف ورقة المطاط على أعلى من الشفافية، تليها "الاكريليك ورقة 1/8.
  7. إضافة ثلاثة 10 رطل الأوزان على الجزء العلوي من الاكريليك ورقة. في البداية، سوف الأوزان "تعويم". تسمح لهم لتسوية وتحقيق الاستقرار قبل المضي قدما.
  8. ضبط درجة الحرارة موقد 70 ج وعلاج PDMS لمدة 4 ساعة. السماح لتبرد لمدة لا تقل عن 1 ساعة إضافية قبل إزعاج.
  9. بعناية قشر ورقة أعلى من فيلم الشفافية من الرقاقة، وإزالة القنوات مع ملقط.
  10. متجر في طبق خالية من الغبار حتى جاهزة للاستخدام.

4. الإستعداد PDMS Microchannels للاستخدام

  1. قنوات المكان رأسا على عقب الجديد، فيلم الشفافية نظيفة. نظيف كافة المنافذ (الشكل 2B) باستخدام حركة دائرية مع ملقط حادة. إزالة أي أجزاء من PDMS.
  2. قنوات نظيفة باستخدام قطعة من التعبئة الشريط باعتباره القماش تك. تطبيق الشريط إلى سطح مقاعد البدلاء (الجانب زجة متابعة)، ثم قم بتعيين قناة سن أعلى. اضغط لأسفل على قنوات مع نهاية الجولة من ملقط لضمان اتصالات جيدة. إزالة وتكرار على كلا الجانبين حتى تتم إزالة الحطام وضوحا.
  3. نقل تنظيفها، وهيأهم قنوات PDMS إلى 50 مل المخروطية مع 70٪ ETOH. دوامة في سرعة قصوى تصل لمدة 30 ثانية. تجاهل ETOH واستبدالها مع الطازجة 70٪ ETOH. متجر في 70٪ ETOH حتى جاهزة للاستخدام.
  4. في نسيج الثقافة هود وباستخدام تقنيات العقيم، ونقل قنوات PDMS لغطاء زجاجي نظيف ومعقم أو أطباق أسفل الزجاج. وضع القناة حتى الجانب والأشعة فوق البنفسجية علاج حتى يتبخر ETOH.
  5. الجاف مرة واحدة، والوجه PDMS بحيث تواجه القنوات أسفل نحو ساترة. اضغط على قناة PDMS لأسفل على الزجاج لجعل ختم جيدة. إضافة رقعة من PDMS العقيمة لتغطية / إغلاق المنفذ مركز (منفذ B، الشكل 2B). السماح ليجف تماما قبل المتابعة.
  6. قبل معطف داخل القناة مع 10 ميكروغرام الكولاجين / مل في الماء المعقم. إلى معطف، ضع قطرات 100 ميكرولتر على الجزء العلوي من channايل، ورسم طريق مع فراغ. بعد 1 ساعة على 37 ج، وقنوات نقل مملوءة بمحلول الكولاجين طلاء للثلاجة. البرد لمدة حوالي 15-30 دقيقة.
  7. إزالة الكولاجين حل طلاء مع الشافطة أو الماصة، والبدء في إعداد الكولاجين.

5. إعداد الكولاجين للاستخدام في Microchannels

  1. على الجليد، تحييد الكولاجين (1: 1) مع المثلج 100 ملي HEPES في 2X في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4. تخلط جيدا حتى متجانسة (لمزيد من التفاصيل، انظر القسم 1.1).
  2. تمييع الكولاجين تحييد لتركيزات مناسبة مع وسائل الإعلام خلية (لمزيد من التفاصيل، انظر القسم 1.2). احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
  3. في نفس الوقت، والبرد شنت القنوات على الجليد.
    ملاحظة: إن الهدف هو أن تكون جميع مكونات العملية القناة عند 4 مئوية أو أقل. الكولاجين درجة الحرارة التنوي والوقت هي المعايير الأساسية لعملية البلمرة، ويمكن أن تكون نقطة انطلاق لمزيد من التحسين، إذا لزم الأمر.
  4. اشعرخلايا تي مع عدادة الكريات و resuspend في مناطق ذات كثافة البذر المناسبة في هذا الوقت. لسهولة الحسابات، و resuspend إلى 1-3٬000٬000 خلية / مل. (لمزيد من التفاصيل، انظر أيضا القسم 2.1).
  5. مرة واحدة وقد تم فرز الخلايا ومرت 15 دقيقة، انتقل إلى الكولاجين صب.

6. صب الانحياز والكولاجين عشوائية Microchannels

  1. قبل الرسم الكولاجين من خلال القنوات، وضبط وتحديد ضغط الفراغ مع منظم فراغ المضمنة. يوفر ضغط فراغ القوة لحمل والسيطرة على معدلات تدفق الكولاجين، الذي يحدد درجة من التوافق.
    1. للمصفوفات عشوائية أو الصغيرة المحايدة، استخدام قناة واسعة (3mm ويوسع x 200 ميكرون طويل القامة) مع الضغط فراغ من 10 ملم زئبق أو أقل.
    2. للمصفوفات الانحياز، استخدام قناة ضيقة (1MM واسعة × 200 ميكرون طويل القامة) مع الضغط فراغ من 60 ملم زئبق أو أكثر.
  2. إزالة قناة شنت من الجليد وضعها على سطح نظيف، مطهرة من تدفق الصفحي حالعود.
  3. العمل بسرعة وتحميل 120-150 ميكرولتر من الكولاجين تحييد بمنفذ ألف (الشكل 2B).
  4. رسم الكولاجين من خلال القناة من خلال وضع 25 مل الماصة تعلق على خط فراغ عبر منفذ ج (الشكل 2B). رسم الكولاجين من خلال في واحد، وحركة موحدة. هام: للمصفوفات عشوائية أو الصغيرة المحايدة، رسم الكولاجين ببطء عبر قناة (حوالي 0،5-1 ملم في الثانية الواحدة)، ووقف مرة واحدة تصل إلى نهاية. للمصفوفات الانحياز، رسم الكولاجين عبر بسرعة أكبر، ولكن الحرص على تجنب فقاعات الهواء.
  5. إزالة بعناية الكولاجين الزائد من منطقة الميناء مع pipetman P200 أو الشافطة.
  6. ضع PDMS بقع معقمة على كل المنافذ الآن يجب أن تكون مشمولة ألف وجيم جميع المنافذ.
  7. بعد 2-3 دقائق، وإزالة مركز PDMS التصحيح (منفذ B) وإضافة 2-3 ميكرولتر من الخلايا (5-10000 الخلايا) في منفذ المركز. السماح لبلمرة جزئيا (إيقاف مبهمة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 آخر - 15 دقيقة.
  8. بعد 10- 15 دقيقة، ونقل إلى 37 مئوية لمدة إضافية 15 - 30 دقيقة لإنهاء البلمرة. إزالة أغطية PDMS وإضافة وسائل الإعلام لتغطية تماما الخلايا قناة والثقافة حسب الحاجة. الخلايا ويمكن تغذية عن طريق إزالة مل من وسائل الإعلام القديمة، واستبدالها مل من وسائل الإعلام الجديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين المقايسات 3D يمكن القيام به في نفس صلابة من هلام الكولاجين، وتختلف صلابة هلام يمكن استخدامها لتحديد كيفية الخلايا سترد على التغييرات الميكانيكية في المكروية الخلوية. ويعرف هيدروجيل الكولاجين قاسية كما هلام حيث الخلايا جزءا لا يتجزأ من غير قادرة على التعاقد محليا الكولاجين المحيطة بها. انقباض لا يتجزأ من أنواع مختلفة من الخلايا هي فريدة من نوعها، وبالتالي فمن الأفضل أن تبدأ مع منحنى انقباض بسيط لإنشاء تركيز الكولاجين التي سيتم مست المتوافقة و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد الهلامية الكولاجين 3D هي إضافة قيمة إلى الأدوات لفهم كيفية تفسير الخلايا والرد على المكروية المحلية. وقد وفرت هذه المخطوطة بروتوكول أساسي جدا لدمج خلايا داخل مصفوفة الكولاجين 3D، وتوليد بتكاثر المصفوفات مع ألياف الكولاجين عشوائية أو الانحياز. كلا البروتوكولين متنقلة كما قابلة للتكيف حيث يحتمل أن يضاف مختلفة الأشكال الإسوية الكولاجين، crosslinkers، أو البروتينات مصفوفة أخرى في وقت البلمرة. كما أنه من السهل لتعديل منصات لتقييم الأطر الزمنية ونقاط النهاية مختلفة للتعبير عن الج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما تكشف

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أن نعترف أرقام منحة UO1CA143069، R01CA142833، R01CA114462، RO1CA179556، T32-AG000213-24، وT32-GM008692-18 لتمويل هذا العمل. ونحن نعترف أيضا جيريمي Bredfelt ويو مينغ ليو من المساحات اللازمة للتنمية والمساعدة مع تحليل CT إطلاق النار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
عالية التركيز ذيل الفئران الكولاجينCorning354249
SylGard184 طقم المطاط الصناعيCorningNC9285739المطاط الصناعي لقنوات
PDMS HEPESFisherBP310لتحييد
HEPES KCl & nbsp ؛فيشرBP366للمخزن المؤقت لتحييد HEPES
KH2< / sub>PO4< / sub>FisherBP362للمخزن المؤقت لتحييد HEPES
Na2< / sub>HPO4< / sub>FisherS374للمخزن المؤقت لتحييد HEPES
NaClFisherBP358لضريبة عازلة تحييد HEPES
تحسين مقياس الدم NeubauerFisher15170-208عد الخلايا
6 آبار لوحة زراعة غير الأنسجة   ؛كورنينج351146
طبق سفلي زجاجي 50 ممMatTekP50g-1.5-30-f
Bel-Art البلاستيك فراغ المجففBel-ArtF4200-2021غرفة التفريغ لفيلم
الشفافية PDMS 3Mpp2950فيلم بلاستيكي لصب قنوات pdms
ThermoScientific CimaRecThermoScientific HP141925صفيحة ساخنة لعلاج القنوات الدقيقة PDMS
منظم فراغدقيق طبيPM3100منظم فراغ لقنوات الكولاجين الدقيقة
8 × 8 بوصة صفائح مطاطيةأمازون - سيليكون مطاطي- سيليكون مطاطي 60 أمبيرلصب
صفائح أكريليك PDMS صغيرة مقاس 8 × 8 بوصة × 0.125 بوصة صفائحزجاج شبكي من أمازونلصب القنوات الدقيقة PDMS
10 أرطال من أوزانAmazonCAP Barbellلصب القنوات الدقيقة
PDMS 15 مل أنابيب مخروطيةفيشر352097
50 مل أنابيب مخروطيةفيشر352098
ماصات بلاستيكيةدوت Scientific229202B و 229206B و 667225B2 & nbsp; مل ، 5   ؛ مل ، و 25   ؛ مل
70٪ EtOHفيشرNC9663244

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
  2. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38(2006).
  3. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
  4. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).
  5. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
  6. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
  7. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
  9. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  10. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  11. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
  12. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11(2008).
  13. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
  14. Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
  15. Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
  16. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
  17. Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
  18. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18(2008).
  19. Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14(2013).
  20. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
  21. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007(2014).
  22. Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

مقالات ذات صلة