Method Article

المجهر الإلكتروني من الأنسجة متآكلة إلى تصور مصفوفة خارج الخلية

DOI:

10.3791/54005

⸱

June 14th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 4Cardiovascular Institute, Maine Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر هنا طريقة لتصور البنية الفوقية للمصفوفة خارج الخلية في أنسجة القلب منزوعة الخلايا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التليف هو أحد مكونات جميع أشكال أمراض القلب بغض النظر عن المسببات ، وبينما تم إحراز تقدم كبير في مجال بيولوجيا مصفوفة القلب ، لا تزال هناك فجوات كبيرة تتعلق بكيفية تكوين المصفوفة ، وكيف تختلف إعادة التشكيل الفسيولوجية والمرضية ، والأهم من ذلك كيف يمكن التلاعب بديناميكيات المصفوفة لتعزيز الشفاء وتثبيط التليف. لا يوجد حاليا خيار علاجي للسيطرة على التليف القلبي أو الوقاية منه أو عكسه. من المحتمل أن يكون جزء من السبب هو التعقيد الهائل لتكوين ندبة القلب ، مثل ما يحدث بعد احتشاء عضلة القلب ليحل محل خلايا عضلة القلب الميتة أو المحتضرة على الفور. تشارك المصفوفة خارج الخلية نفسها في إعادة التشكيل عن طريق تنشيط الخلايا المقيمة وأيضا من خلال المساعدة في توجيه الخلايا المتسللة إلى الآفة البائدة. المصفوفة هي أيضا خزانة تخزين من نوع ما للبروتينات الأمومية التي تعتبر ضرورية لدوران المصفوفة الطبيعي ، بالإضافة إلى الإشارات الليفية. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن المصفوفة تلعب دورا كهروميكانيكيا في أنسجة القلب. معظم تقنيات تقييم التليف ليست نوعية بطبيعتها ، ولكنها توفر نتائج كمية مفيدة للمقارنة بين مجموعتين ولكنها لا توفر معلومات تتعلق ببنية المصفوفة الأساسية. تم تسليط الضوء هنا على تقنية لتصور البنية الفوقية لمصفوفة القلب. يكشف الفحص المجهري الإلكتروني لأنسجة القلب منزوعة الخلايا عن اختلافات مذهلة في البنية التي قد يتم تفويتها باستخدام طرق البحث الكمي التقليدية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعطل التليف شبكة الكولاجين الطبيعية لعضلة القلب ، وهو أمر بالغ الأهمية للوظائف الميكانيكية الطبيعية لخلايا عضلة القلب 1،2 وكذلك للاتصال بين الخلايا والإشارات داخل الخلايا وبقاء الخلية 3. يعد تطور التليف محددا رئيسيا لوظيفة القلب ، وتؤدي إعادة تشكيل التليف للخلال القلبي الناجم عن مجموعة متنوعة من المسببات إلى زيادة تصلب البطين الأيسر والخلل الوظيفي الانبساطي 4. قد يؤدي تليف عضلة القلب أيضا إلى عدم انتظام ضربات القلب ، وسواء كان تطور إعادة تشكيل التليف ظاهرة عامة أو محلية ، فإنه يرتبط ارتباطا وثيقا بسوء التشخيص لدى المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب الإقفاري وغير الإقفاري 5. وبالمثل ، فإن غياب تليف عضلة القلب هو مؤشر قوي على الانتعاش الوظيفي للبطين والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل 6.

السمة المميزة للتليف هي ترسب الكولاجين الزائد ، الذي يتمتع بقوة شد الفولاذ 7 ويمكن أن يؤثر سلبا على وظيفة خلايا عضلة القلب على مستويات متعددة. يمكن أن تؤدي القوى الميكانيكية الناتجة عن مصفوفة كولاجينية مفرطة إلى ضمور عضلة القلب 8،9 ، وتصلب الأنسجة السلبية 10 ، وتصلب عضلة القلب الناجم عن تقلص المنشط 11-13 ، وتقليل توصيل الأكسجين إلى السكان المتبقين من خلايا عضلة القلب. يمكن أن يؤدي اقتران تقاطع الفجوة بين خلايا عضلة القلب و myoFbs أيضا إلى الإضرار بالخصائص الكهربائية للقلب ، مما يخلق خطرا أكبر على تطور عدم انتظام ضربات القلب 14-16. يغير التليف المحيطي التفاعل الحركي الوعائي للشرايين التاجية والشرايين داخل الجدارية 17 ويساهم في التضيق اللمعي الذي يقلل من إمداد الأكسجين وبالتالي بقاء خلايا عضلة القلب 17-22. تتطور إعادة التشكيل الليفي والكهربائي المسببة للأمراض ، المنبثقة من موقع أولي للإصابة الإقفارية أو اختلال توازن الطاقة ، حتما إلى قصور القلب.

يبدأ نخر خلايا عضلة القلب في الاستجابة الليفية ، ويمكن أن تحدث إعادة تشكيل ليفية ضارة لاحقة بغض النظر عن المسببات. سيكون إيجاد طريقة للسيطرة على التليف القلبي مفيدا سريريا لعلاج اعتلال عضلة القلب الإقفاري ومجهول السبب ، وأمراض القلب المرتفعة ، واعتلال عضلة القلب الضخامي ، وأمراض القلب الصمامية واعتلال الضمور 23-42. بغض النظر عن كيفية بدء عملية المرض الليفي ، يمكن للعوامل القابلة للذوبان والتليفية أن تعبر الفضاء الخلالي وتثير تنشيط الخلايا الليفية الخلالية والعرضية في المواقع البعيدة عن الندبة الليفية الأولية ، مما يخلق تأثيرا متتاليا يؤدي في النهاية إلى قصور القلب. سيكون السيناريو الأمثل هو استغلال عملية الرجفان باستخدام علاج مستهدف يمكن تطبيقه خلال المرحلة التضخمية التعويضية لاعتلال عضلة القلب قبل أن يتطور إلى فشل المضخة الانقباضية أو قصور القلب الانبساطي أو نتائج المرحلة النهائية الأخرى. الهدف النهائي هو عكس التليف بحيث يمكن استبدال خلايا عضلة القلب الميتة واستعادة وظائف القلب بالكامل.

أهمية المصفوفة مفهومة على نطاق واسع ، ومع ذلك فإن طرق دراسة المصفوفة تقتصر بشكل أساسي على القياسات الكمية للمكونات الهيكلية الرئيسية ، وخاصة الكولاجين ، والمستويات النسبية لبروتينات المصفوفة والأمومة المختلفة. يسلط هذا البروتوكول الضوء على تقنية نادرا ما تستخدم ومفيدة لتقييم الاختلافات النوعية في مصفوفة القلب. تم استخدام هذه التقنية مؤخرا لمقارنة ومقارنة الاختلافات الأساسية في مصفوفات القلب من مسببات مختلفة لأمراض القلب (في الاستنتاجات البشرية) ، لفحص قلوب الخنازير بعد الاحتشاء المعالجة بالشكل الإسوي لعامل النمو الدبقي (GGF) من neuregulin-1β ، بالنسبة للحيوانات غير المعالجة 43 ، وللتحقيق في الاختلافات في مصفوفات أنسجة القلب من mdx الفئران (نموذج حيواني شائع الاستخدام لحثل دوشين العضلي) في أعمار مختلفة ومقارنته بعناصر التحكم من النوع البري. تم تقديم هذه التقنية لأول مرة من قبل الدكتورين كولفيلد وبورغ في عام 1979 44 ، لكن القليل من الدراسات استخدمت منذ ذلك الحين هذه التقنية القوية 45-47 ، والتي أعيد تقديمها هنا مع تعديل طفيف فقط. هذه المنهجية هي أداة بحث قيمة ، لأنها توفر معلومات نوعية حول البنية الفوقية للمصفوفة خارج الخلية التي قد يتم تجاهلها عند قياس محتوى مكون المصفوفة و / أو مستوى التليف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على بروتوكولات التعامل مع الحيوانات التي فاندربيلت المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC، البروتوكولات رقم م / 10/117 (الخنازير) وM / 10/219 (الفئران) والتي أجريت وفقا للمعايير AAALAC الدولية. تمت الموافقة على استخدام أنسجة القلب الإنسان يدخر جامعة فاندربيلت المركز الطبي IRB (البروتوكول رقم 100887).

1. عينة جمع وتخزين

  1. جعل الطازجة 4٪ غلوتارالدهيد في 0.1 م العازلة الفوسفات (PB) حل.
    تنبيه: غلوتارالدهيد هي سامة، وارتداء قفازات والعمل في غطاء الدخان.
    1. جعل حل 0.2 M الأسهم من الجريدة الرسمية، ودرجة الحموضة 7.4 باستخدام 21.8 ز نا 2 هبو 4 و 6.4 غ ناه 2 ص 4. الكم ساتيس (كيو إس) إلى 1000 مل درهم 2 O.
    2. إضافة 400 ميكرولتر من 50٪ غلوتارالدهيد إلى 2.5 مل من PB حل سهم و 2.1 مل درهم 2 O.
  2. تزج قطعة (لا يزيد حجمها عن 2 جم 2) من الأنسجة في حل غلوتارالدهيد 4٪. ملاحظة: يمكن أيضا قطع صغيرة يمكن استخدامها ولكن ينبغي أن تكون ذات حجم كاف (أي أقل من 5 مم 2) أن تصور بسهولة بالعين من أجل تسهيل خطوات لاحقة من البروتوكول.
  3. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، ثم تخزينها إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية.

2. Decellularization من نسيج القلب

  1. جعل الطازجة 10٪ محلول هيدروكسيد الصوديوم المائي باستخدام 10 غرام حبيبات هيدروكسيد الصوديوم / 100 مل درهم 2 O.
    تنبيه: حلول هيدروكسيد الصوديوم هي تآكل ويمكن أن يسبب حروق القلويات، ارتداء القفازات.
  2. شطف الأنسجة في DH 2 O.
  3. احتضان في 10٪ محلول هيدروكسيد الصوديوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 - 10 أيام (حتى التغيرات النسيجية من البني المحمر إلى من البيض أو أبيض).
  4. شطف في DH 2 O حتى تصبح الأنسجة شفافة.
  5. تزج الأنسجة في حمض التانيك 1٪ لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدام 1 مل 5٪ محلول المخزون في 4 مل درهم 2 O.
    تنبيه: حمض التانيكهو مهيج قوي، وارتداء القفازات.
  6. شطف في DH 2 O بين عشية وضحاها.

3. المعاملة بالأوزميك وتجفيف الأنسجة القلب (في الدخان هود للسلامة)

  1. جعل حل 0.2 M الأسهم العازلة كاكوديلات الصوديوم باستخدام 21.4 غرام كاكوديلات الصوديوم، 10.0 غرام كلوريد الكالسيوم و 450 مل درهم 2 O. المزيج، ثم إضافة حمض الهيدروكلوريك حسب الحاجة لضبط درجة الحموضة إلى 7.4. كيو إس 500 مل مع DH 2 O.
    تنبيه: كاكوديلات الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك سامة، وارتداء قفازات والعمل في غطاء الدخان.
  2. جعل حل الأسهم 2٪ مائي من رباعي أكسيد الأوزميوم في غطاء الدخان للسلامة عن طريق إذابة 1 غرام رباعي أكسيد الأوزميوم وضوح الشمس في 50 مل درهم 2 O.
    تنبيه: رباعي أكسيد الأوزميوم يعتبر خطرا استنشاق شديد. تثبيت البخار من الأغشية المخاطية أو مقل العيون ممكن، وبالتالي التعامل فقط في غطاء الدخان مع قفازات. ينصح حارس البداية.
  3. شطف الأنسجة في 0.1 م العازلة كاكوديلات الصوديوم (خلط المحلول 1: 1 مع DH 2 O) لمدة 5 دقائق على محور دوار (أو الإثارة لطيف).
  4. كرر الخطوة السابقة مرتين، ليصبح المجموع ثلاثة يشطف العازلة.
  5. تزج الأنسجة في 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في 0.1 العازلة كاكوديلات M الصوديوم (مزيج كاكوديلات الأسهم الصوديوم والأسهم رباعي أكسيد الأوزميوم 1: 1) على محور دوار لمدة 1 ساعة.
  6. شطف الأنسجة في 0.1 م العازلة كاكوديلات الصوديوم 3 مرات لكل يوم المدورة 5 دقائق.
  7. شطف الأنسجة باستخدام تركيزات متزايدة من الايثانول (30٪، 50٪، 75٪، 85٪، 95٪، وأخيرا 100٪) لمدة 15 دقيقة لكل منهما على محور دوار.

4. المقطع العرضي تحضير السطح لوزارة شؤون المرأة

  1. نقل الأنسجة في الإيثانول بنسبة 100٪ على طبق بيتري الضحلة أيضا تحتوي على 100 الإيثانول٪.
  2. عقد اجتماعين شفرات الحلاقة الحادة جدا مثل أن الشقق من الجانبين على اتصال مع بعضها البعض وحواف القطع عبر لتشكيل الجانبين من مثلث متساوي الاضلاع فوق العينة. ولتحقيق ذلك، استخدام اليد اليسرى لوضع شفرة واحدة على أقصى الجانب الأيسر من العينة وقطع نحو اليسار. في نفس الوقت، واستخدام اليد اليمنى لوضع شفرة الثانية في أقصى اليسار من العينة، وشريحة اليمين. وبالتالي، سيتم تراجع ريش ضد بعضها البعض من اتجاهين متعاكسين لجعل خفض سلس واحد.
  3. حرك الجانبين شفرة مسطحة ضد بعضها البعض لاجراء خفض نظيفة جدا من العينة مع الحد الأدنى من التشويه أو تمزيق القوة، ويفضل تعريض الكبيرة ومساحة ممكنة دون الإضرار العينة.
  4. كرر لكل عينة لفضح أنظف الممكنة السطوح المقطع العرضي للفحص في وزارة شؤون المرأة.

5. الحرجة نقطة التجفيف (CPD) من أنسجة القلب

  1. استخدام ملعقة أو ملاقط لنقل الأنسجة لصاحب العينة من الحرج مجفف نقطة (CPD)، وضمان أن الأنسجة لا تزال في الإيثانول بنسبة 100٪ في جميع الأوقات. تأكد من أن حامل ومغمورة في الإيثانول وأن يتحقق نقل مع النسيج تعرضها للهواء لمدة لا تتجاوز بضع ثوان.
  2. تعمل وثيقة البرنامج القطري لكل منادليل إيه لإكمال 3 تطهير وملء دورات ليحل محل الايثانول مع ثاني أكسيد الكربون السائل.
  3. تعمل CPD في دليل المستخدم لتحقيق تجفيف نقطة حرجة من العينات وإعادتها إلى الضغط الجوي مع التنفيس تسيطر عليها CO 2.

6. تركيب عينات الأنسجة القلب لوزارة شؤون المرأة

  1. إعداد عينة كعب SEM لكل عينة، من خلال الالتزام علامة تبويب لاصق الكربون إلى السطح العلوي من كعب الألومنيوم.
  2. مع المعونة من مجهر تشريحي، والتمسك بعناية العينة إلى علامة التبويب لاصق مع قسم سطح عريض من الفائدة مواجهة (بعيدا عن علامة التبويب، مرئية)، وفي أقرب وقت ممكن موازية مع الطائرة من سطح العينة كعب. لا التحقيق أو لمس سطح الفائدة.
  3. كسر قضيب عصا خشبية لتحقيق فرشاة مدببة، مثالية لتطبيق الطلاء. تطبيق الفضة أو طلاء الكربون في قاعدة وجوانب من العينة، لتحسين الالتزام كعب.
  4. تمديد خط رفيع جدا من الفضة أو الكربون طلاء يصل إلى حافة السطح من الاهتمام، لتوفير مسار تهمة من سطح تهم الأرض.
  5. تطبيق 2 أو 3 اللمسات صغيرة من الفضة أو طلاء الكربون حول محيط علامة التبويب الكربون، لتوفير مسار موصل من سطح التبويب الكربون إلى كعب المعدن وبالتالي إلى الأرض.
  6. السماح الطلاء موصل لتجف لمدة ساعة.
  7. تعمل المغطى تفل في دليل المستخدم لتطبيق الطلاء الثقيلة نسبيا (النطاق المستهدف من 30 - 40 نانومتر) من سبائك الذهب والبلاديوم أو الذهب. ضخ غرفة العينة إلى ما يقرب من 0.1 مللي بار. مجموعة الموقت إلى 40 ثانية. فتح مجموعة صمام إلى (تدفق غاز الأرغون معتدل) 08:00 الموقف. اضغط على بدء لبدء طلاء بالرش في 30 مللي أمبير. يجب أن يكون التفريغ توهج الأرجواني مرئية في غرفة العينة.

7. SEM فحص عينات الأنسجة القلب

  1. أداء المجهر الإلكتروني في الجهد تسريع منخفضة نسبيا للحد من التصوير صroblems المرتبطة الفقراء تبديد المسؤول في العينة (شحن). اقترح حالة التصوير الأولي هي: 5 كيلو فولت يتسارع الجهد، 10 مم العمل عن بعد.
  2. مع مساعدة من عامل من ذوي الخبرة، وزيادة توظيف العمل عن بعد لتوسيع عمق الميدان في ظروف التصوير التي تحتاج إلى تركيز من الألياف في طائرات التنسيق متعددة، أو الألياف تمتد لطول كبير في البعد ض.
    1. لالاداة المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد)، في الوصول إلى واجهة المستخدم علامة التبويب الملاحة في الجزء العلوي الأيمن.
    2. الوصول إلى علامة التبويب الاحداثيات من القائمة المرحلة. لزيادة مسافة العمل، أدخل قيمة أكبر في ملليمتر لZ الإحداثي ثم انقر على الذهاب إلى علامة التبويب لتحريك مرحلة العينة إلى العمل عن بعد إدخالها.
  3. مع مساعدة من عامل من ذوي الخبرة، وتوظيف الميل العينة وتناوب على وضع سطح متعامد تهم شعاع الالكترون. الميل الإضافي من 10-30 degrالبيرينيه من هذا الموقف قد تحسين مراقبة وتوثيق هيكل المصفوفة.
    1. لالاداة المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد)، في واجهة المستخدم، انقر مع الاستمرار على زر الماوس الأيمن، ثم مرر اليسار أو اليمين للتركيز العينة بالقرب من المحيط الخارجي للطائرة سطح المعدة من الفائدة، مشيرا الى ان المسافة العمل المركزة .
    2. انتقل مع دليل واجهة المستخدم عصا التحكم لنقل بالقرب من حافة المتعارضة التركيز السطح وتكرار. إذا العمل عن بعد لا تساوي تقريبا إلى المركز الأول، عينة الميل للتوصل إلى اتفاق تقريبي في كلا الموقعين باستخدام علامة التبويب إحداثيات القائمة المرحلة (انظر 7.2) وإدخال قيمة الميل في تي تنسيق.
    3. تدوير العينة تسعين درجة (إدخال قيمة في الحقل R تنسيق)، وكرر العملية حتى تتركز كل المواقف تقريبا في المسافة العمل نفسها.
      ملاحظة: يمكن أن يستخدم ضغط متغير ووزارة شؤون المرأة لتحسين تهمة تبديدإذا كانت متوفرة. عالية الفراغ هو وضع التشغيل القياسية لالمجهر الإلكتروني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق هذه التقنية المميزة لأنسجة القلب من غير المستخدمة زرع قلب الإنسان المانحة (الشكل 1)، الأنسجة explanted من متلقى، قلوب من النوع البري والفئران التصنع (الشكل 3)، وبعد عضلة القلب عينات احتشاء القلب من الخنازير نموذج من إصابة القلب (الشكل 2). كما هو مبين في الشكل رقم 1، مصفوفة القلب البشرية هي نسج معقدة من البروتينات عبر ربط ذلك عرض نمط يشبه قرص العسل عند عرضها في المقطع العرض...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عبر إعداد قسم السطح هو الخطوة الأكثر أهمية خلال البروتوكول. للحفاظ على هيكل غرامة، ويجب أن تظل العينات المجففة في الإيثانول بنسبة 100٪ في جميع الأوقات حتى أدخلت على عملية التجفيف نقطة حرجة. وبالتالي فإن تشريح عينات لتحقيق يجب أن يتم السطوح لفحص EM بينما مغمور العينات في الايثانول في طبق ضحل. ومن الأهمية بمكان أيضا أن السطح المعرض لا مست أو سبر خلال معالجة لاحقة. ومن المتوقع إدخال أي تعديلات رئيسية لتطبيق هذه التقنية لأنواع الأنسجة الأخرى لملاحظات مصفوفة مماثلة، على الرغم من أن جزء...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذه الدراسة من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ومعهد القلب والرئة والدم (NIHLB): K01-HL-121045 ، K08-HL-094703 ، 5T32HL007411-35 ، P20 HL101425 ، U01 HL100398.

< p class = 'jove_content'> تم إجراء التصوير ومعالجة الأنسجة (بعد نقع هيدروكسيد الصوديوم) من خلال استخدام الموارد المشتركة لتصوير الخلايا (CISR) التابع للمركز الطبي بجامعة فاندربيلت (VUMC) (بدعم من منح المعاهد الوطنية للصحة CA68485 و DK20593 و DK58404 و DK59637 و EY08126). نحن ممتنون بشكل خاص للمديرين الأساسيين ل VUMC CISR (الدكتور سام ويلز والدكتور دبليو جراي (جاي) جيروم) على المشورة الفنية القيمة وأيضا لتوفير المساحة والموارد الأساسية لأغراض تصوير التقنية الموضحة في هذه الورقة.

نود أن نعرب عن عميق تقديرنا للدكتور يان رو سو والسيدة كيلسي توماسيك في المختبر الأساسي لأمراض القلب للأبحاث الانتقالية والسريرية في جامعة فاندربيلت لتوفير الخبرة الفنية وجمع عينات الأنسجة البشرية المستخدمة في هذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
علوم المجهرالإلكتروني لكلوريد الكالسيوم12340100 جم
المجهراللاصقالكربوني 1266430 جم
لاصقة الكربونيةعلوم المجهر الإلكتروني77825ترتيب لتناسب بذرة
شفرات حلاقة مزدوجة الحواف الفولاذ المقاوم للصدأتيد بيلا ، Inc121-6250 / عبوة من
الإيثانولإلكترون علوم الفحص المجهري15055450 مل
غلوتيراالديهايد ، 50٪ محلولعلوم المجهر الإلكتروني16310درجة EM ، تقطير منقى
حمض الهيدروكلوريكعلوم المجهر الإلكتروني16760 أو 16770100 مل
فوسفات أحادي الصوديوم NaH 2< / sub>PO4< / sub>Sigma-AldrichS9251-250G250 جم
أوزميوم علوم المجهر191001 جم
المجهر الإلكترونياللاصق الموصل للفضة12686-15 15جم
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) سيجماألدريتشS8045-1KG1 كجم
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na 2< / sub>HPO4< / sub>)Sigma-AldrichS3264-500G500 جم
حمض التانيك ، 5٪ Aqueous علوم المجهر الإلكتروني21702-5500 مل
ثلاثي هيدرات الصوديومالكاكوديلات علوم المجهر الإلكتروني12300100 جم
سبائك الذهب والبلاديوم أوأنظمة تكرير الذهب ، Inc.   ؛يختلفبشكل خاص بصنع ونموذج
مجفف النقطة الحرجةعلوم المجهرالإلكتروني 850
أدوات تطبيق خشبيةعادية فيشر Scientific23-400-102
Quanta 250 البيئة SEMFEIQ250 SEM
Sputter CoaterCressington Scientific Instruments Ltd.نموذج 108
بذرة عينة الألومنيوم SEM علومالمجهر الإلكتروني75220-12خاصة بالمنظار
علوم الإلكتروني علامات تبويب الإلكتروني رباعي الأكسيد علوم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robinson, T. F., Cohen-Gould, L., Factor, S. M., Eghbali, M., Blumenfeld, O. O. Structure and function of connective tissue in cardiac muscle: collagen types I and III in endomysial struts and pericellular fibers. Scanning Microsc. 2, 1005-1015 (1988).
  2. Robinson, T. F., Geraci, M. A., Sonnenblick, E. H., Factor, S. M. Coiled perimysial fibers of papillary muscle in rat heart: morphology, distribution, and changes in configuration. Circ Res. 63, 577-592 (1988).
  3. Lunkenheimer, P. P., et al. The myocardium and its fibrous matrix working in concert as a spatially netted mesh: a critical review of the purported tertiary structure of the ventricular mass. Eur J Cardiothorac Surg. 29 Suppl 2, S41-S49 (2006).
  4. Wu, K. C., et al. Late gadolinium enhancement by cardiovascular magnetic resonance heralds an adverse prognosis in nonischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 51, 2414-2421 (2008).
  5. Kramer, C. M. The expanding prognostic role of late gadolinium enhanced cardiac magnetic resonance. J Am Coll Cardiol. 48, 1986-1987 (2006).
  6. Park, S., et al. Delayed hyperenhancement magnetic resonance imaging is useful in predicting functional recovery of nonischemic left ventricular systolic dysfunction. J Card Fail. 12, 93-99 (2006).
  7. Weber, K. T. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network. J Am Coll Cardiol. 13, 1637-1652 (1989).
  8. Jalil, J. E., Janicki, J. S., Pick, R., Abrahams, C., Weber, K. T. Fibrosis-induced reduction of endomyocardium in the rat after isoproterenol treatment. Circ Res. 65, 258-264 (1989).
  9. Fidzianska, A., Bilinska, Z. T., Walczak, E., Witkowski, A., Chojnowska, L. Autophagy in transition from hypertrophic cardiomyopathy to heart failure. J Electron Microsc (Tokyo). 59, 181-183 (2010).
  10. Lopez, B., Querejeta, R., Gonzalez, A., Larman, M., Diez, J. Collagen cross-linking but not collagen amount associates with elevated filling pressures in hypertensive patients with stage C heart failure: potential role of lysyl oxidase. Hypertension. 60, 677-683 (2012).
  11. Gabbiani, G., Ryan, G. B., Majne, G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction. Experientia. 27, 549-550 (1971).
  12. Lorell, B. H. Diastolic dysfunction in pressure-overload hypertrophy and its modification by angiotensin II: current concepts. Basic Res Cardiol. 87 Suppl 2, 163-172 (1992).
  13. Friedrich, S. P., et al. Intracardiac angiotensin-converting enzyme inhibition improves diastolic function in patients with left ventricular hypertrophy due to aortic stenosis. Circulation. 90, 2761-2771 (1994).
  14. Rosker, C., Salvarani, N., Schmutz, S., Grand, T., Rohr, S. Abolishing myofibroblast arrhythmogeneicity by pharmacological ablation of alpha-smooth muscle actin containing stress fibers. Circ Res. 109, 1120-1131 (2011).
  15. Yue, L., Xie, J., Nattel, S. Molecular determinants of cardiac fibroblast electrical function and therapeutic implications for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 89, 744-753 (2011).
  16. Rohr, S. Myofibroblasts in diseased hearts: new players in cardiac arrhythmias? Heart Rhythm. 6, 848-856 (2009).
  17. Coen, M., Gabbiani, G., Bochaton-Piallat, M. L. Myofibroblast-mediated adventitial remodeling: an underestimated player in arterial pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 2391-2396 (2011).
  18. Brilla, C. G., Janicki, J. S., Weber, K. T. Cardioreparative effects of lisinopril in rats with genetic hypertension and left ventricular hypertrophy. Circulation. 83, 1771-1779 (1991).
  19. Youn, H. J., et al. Relation between flow reserve capacity of penetrating intramyocardial coronary arteries and myocardial fibrosis in hypertension: study using transthoracic Doppler echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 19, 373-378 (2006).
  20. Warnes, C. A., Maron, B. J., Roberts, W. C. Massive cardiac ventricular scarring in first-degree relatives with hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 54, 1377-1379 (1984).
  21. Maron, B. J., Wolfson, J. K., Epstein, S. E., Roberts, W. C. Intramural ('small vessel') coronary artery disease in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 8, 545-557 (1986).
  22. Olivotto, I., et al. Microvascular function is selectively impaired in patients with hypertrophic cardiomyopathy and sarcomere myofilament gene mutations. J Am Coll Cardiol. 58, 839-848 (2011).
  23. Beltrami, C. A., et al. Structural basis of end-stage failure in ischemic cardiomyopathy in humans. Circulation. 89, 151-163 (1994).
  24. Factor, S. M., et al. Pathologic fibrosis and matrix connective tissue in the subaortic myocardium of patients with hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 17, 1343-1351 (1991).
  25. Waller, T. A., Hiser, W. L., Capehart, J. E., Roberts, W. C. Comparison of clinical and morphologic cardiac findings in patients having cardiac transplantation for ischemic cardiomyopathy, idiopathic dilated cardiomyopathy, and dilated hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 81, 884-894 (1998).
  26. Schaper, J., Lorenz-Meyer, S., Suzuki, K. The role of apoptosis in dilated cardiomyopathy. Herz. 24, 219-224 (1999).
  27. de Leeuw, N., et al. Histopathologic findings in explanted heart tissue from patients with end-stage idiopathic dilated cardiomyopathy. Transpl Int. 14, 299-306 (2001).
  28. Yoshikane, H., et al. Collagen in dilated cardiomyopathy--scanning electron microscopic and immunohistochemical observations. Jpn Circ J. 56, 899-910 (1992).
  29. Marijianowski, M. M., Teeling, P., Mann, J., Becker, A. E. Dilated cardiomyopathy is associated with an increase in the type I/type III collagen ratio: a quantitative assessment. J Am Coll Cardiol. 25, 1263-1272 (1995).
  30. Pearlman, E. S., Weber, K. T., Janicki, J. S., Pietra, G. G., Fishman, A. P. Muscle fiber orientation and connective tissue content in the hypertrophied human heart. Lab Invest. 46, 158-164 (1982).
  31. Huysman, J. A., Vliegen, H. W., Van der Laarse, A., Eulderink, F. Changes in nonmyocyte tissue composition associated with pressure overload of hypertrophic human hearts. Pathol Res Pract. 184, 577-581 (1989).
  32. Rossi, M. A. Pathologic fibrosis and connective tissue matrix in left ventricular hypertrophy due to chronic arterial hypertension in humans. J Hypertens. 16, 1031-1041 (1998).
  33. Lopez, B., Gonzalez, A., Querejeta, R., Larman, M., Diez, J. Alterations in the pattern of collagen deposition may contribute to the deterioration of systolic function in hypertensive patients with heart failure. J Am Coll Cardiol. 48, 89-96 (2006).
  34. Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79, 744-755 (1989).
  35. Schwarz, F., et al. Myocardial structure and function in patients with aortic valve disease and their relation to postoperative results. Am J Cardiol. 41, 661-669 (1978).
  36. Hein, S., et al. Progression from compensated hypertrophy to failure in the pressure-overloaded human heart: structural deterioration and compensatory mechanisms. Circulation. 107, 984-991 (2003).
  37. Brooks, W. W., Shen, S. S., Conrad, C. H., Goldstein, R. H., Bing, O. H. Transition from compensated hypertrophy to systolic heart failure in the spontaneously hypertensive rat: Structure, function, and transcript analysis. Genomics. 95, 84-92 (2010).
  38. O'Hanlon, R., et al. Prognostic significance of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 56, 867-874 (2010).
  39. Green, J. J., Berger, J. S., Kramer, C. M., Salerno, M. Prognostic value of late gadolinium enhancement in clinical outcomes for hypertrophic cardiomyopathy. JACC Cardiovasc Imaging. 5, 370-377 (2012).
  40. Frankel, K. A., Rosser, R. J. The pathology of the heart in progressive muscular dystrophy: epimyocardial fibrosis. Hum Pathol. 7, 375-386 (1976).
  41. Otto, R. K., Ferguson, M. R., Friedman, S. D. Cardiac MRI in muscular dystrophy: an overview and future directions. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 123-132 (2012).
  42. Finsterer, J., Stollberger, C. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
  43. Galindo, C. L., et al. Anti-remodeling and anti-fibrotic effects of the neuregulin-1beta glial growth factor 2 in a large animal model of heart failure. J Am Heart Assoc. 3, e000773(2014).
  44. Caulfield, J. B., Borg, T. K. The collagen network of the heart. Lab Invest. 40, 364-372 (1979).
  45. Ohtani, O. Three-dimensional organization of the connective tissue fibers of the human pancreas: a scanning electron microscopic study of NaOH treated-tissues. Arch Histol Jpn. 50, 557-566 (1987).
  46. Rossi, M. A., Abreu, M. A., Santoro, L. B. Images in cardiovascular medicine. Connective tissue skeleton of the human heart: a demonstration by cell-maceration scanning electron microscope method. Circulation. 97, 934-935 (1998).
  47. Icardo, J. M., Colvee, E. Collagenous skeleton of the human mitral papillary muscle. Anat Rec. 252, 509-518 (1998).
  48. McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy. Dis Model Mech. 8, 195-213 (2015).
  49. Buckberg, G., Hoffman, J. I., Mahajan, A., Saleh, S., Coghlan, C. Cardiac mechanics revisited: the relationship of cardiac architecture to ventricular function. Circulation. 118, 2571-2587 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Scanning Electron MicroscopyExtracellular MatrixCardiac TissueTissue DecellularizationSample PreparationSEM ImagingGold Palladium CoatingCritical Point DryingOsmium TetroxideSodium Hydroxide

Related Articles