يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تطوير وتوصيف

8.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54014

⸱

مايو 19, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> نمت الخلايا البطانية الأولية للوريد السري البشري (HUVECs) إلى التقاء داخل جهاز شبكة الموائع الدقيقة. تم توضيح تقاطع الخلايا البطانية وتوزيعات F-actin وتم قياس التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وإنتاج أكسيد النيتريك استجابة للأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) في الوقت الفعلي على مستويات الخلايا الفردية.

الملخص

تتعرض الخلايا البطانية (ECS) المبطنة لجدران الأوعية الدموية في الجسم الحي باستمرار في التدفق، ولكن غالبا ما تزرع ECS مثقف في ظل ظروف ثابتة ويحمل النمط الظاهري الموالية للالتهابات. على الرغم من أن تطوير أجهزة ميكروفلويديك وقد تبنت من قبل المهندسين أكثر من عقدين، لا تزال تطبيقاتها البيولوجية محدودة. (أ) في المختبر نموذج microvessel أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية التصديق عليها من قبل التطبيقات البيولوجية مهم للمضي قدما في الميدان، وردم الفجوات بين في الجسم الحي والدراسات في المختبر. هنا، نقدم الإجراءات التفصيلية لتطوير شبكة microvessel مثقف باستخدام جهاز ميكروفلويديك مع قدرة نضح على المدى الطويل. علينا أن نبرهن أيضا تطبيقاتها لقياس الكمية من التغيرات التي يسببها ناهض في المفوضية الأوروبية ط وأكسيد النيتريك (NO) إنتاج [2+ كا] في الوقت الحقيقي باستخدام متحد البؤر والفحص المجهري مضان التقليدية. الشبكة microvessel شكلتوأظهر العمل مع نضح المستمر تقاطعات متطورة بين ECS. VE كادهيرين التوزيع كان أقرب إلى تلك التي لوحظت في microvessels سليمة من الطبقات الوحيدة EC مثقف بشكل ثابت. ATP الناجم عن الزيادات العابرة في المفوضية الأوروبية [كا 2+] تم قياس ط وأي إنتاج الكمية في مستويات الخلايا الفردية، والذي صادق على وظيفة من microvessels مثقف. هذا الجهاز ميكروفلويديك يسمح ECS على النمو في ظل ذلك، تدفق ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي تسيطر عليها بشكل جيد، مما يجعل بيئة زراعة الخلايا أقرب إلى المجراة من ذلك في والثقافات 2D الثابتة التقليدية. تصميم شبكة متناهية أنها تتمتع بتنوع كبير، وعملية التصنيع بسيطة وقابلة للتكرار. الجهاز يمكن دمجها بسهولة إلى النظام المجهري متحد البؤر أو التقليدية تمكين ارتفاع القرار التصوير. الأهم من ذلك، لأن الشبكة microvessel مثقف يمكن تشكيلها من قبل ECS الإنسان الأساسية، وهذا النهج بمثابة أداة مفيدة لمعرفة كيفمرضي مكونات الدم غيرت من عينات المرضى تؤثر ECS الإنسان وتوفر نظرة ثاقبة القضايا السريرية. كما يمكن وضعها كمنصة لفحص المخدرات.

المقدمة

تتعرض الخلايا البطانية (ECS) المبطنة لجدران الأوعية الدموية في الجسم الحي باستمرار في التدفق، ولكن غالبا ما تزرع ECS مثقف في ظل ظروف ثابتة ويحمل النمط الظاهري الموالية للالتهابات 1،2. التكنولوجيا على microfluidics تمكن السائل تسيطر على وجه التحديد من خلال مقيدة هندسيا الميكروسكيل (جنوب ملم) قنوات 3، والذي يوفر فرصة للخلايا المستزرعة، وخاصة بالنسبة الأوعية الدموية ECS، لتنمو في ظل ظروف التدفق المطلوب. هذه الميزات تجعل من شروط الثقافة خلية أقرب إلى المجراة من، ثابتة مزارع الخلايا 2D التقليدية. أنها مهمة للغاية عند استخدام الأجهزة ميكروفلويديك لنموذج أنواع مختلفة من vasculatures ودراسة ردود المفوضية الأوروبية إلى التحفيز الميكانيكية و / أو الكيميائية.

على الرغم من المزايا التي أظهرتها شبكة متناهية على ثقافة خلية ثابتة، وتكييف وتطبيق على microfluidics في و الطبيةدرع لا تزال محدودة. رواه استعراض أجري مؤخرا، فإن الغالبية من منشورات هذا المجال (85٪) لا تزال في المجلات الهندسية 4. لم يكن أداء الأجهزة ميكروفلويديك إقناع بما فيه الكفاية بالنسبة لمعظم علماء الأحياء إلى التحول من التقنيات الحالية مثل فحص Transwell والمستوى الكلي للانزلاق طبق ثقافة / الزجاج لهذا الجهاز المنمنمة. على microfluidics هو حقل متعدد التخصصات، الأمر الذي يتطلب التعاون بين التخصصات لنقل هذا الحقل إلى الأمام. والهدف من هذه المادة هو تقنية للحد من الفجوات المعرفية بين التخصصات وجعل الإجراءات تلفيق مفهومة من قبل علماء الأحياء، في الوقت الذي توفر تطبيق البيولوجي والتحقق من صحة وظيفية من microvessels الموائع الدقيقة. تتضمن البروتوكولات التجريبية تصور تصنيع كلا الجهازين ميكروفلويديك ومرافقها الحيوية، وهو ما يمثل التعاون الوثيق بين المهندسين وعلماء الأحياء.

بلغنا مؤخرا بعضالتطبيقات البيولوجية باستخدام المختبر في شبكة microvessel مع جهاز ميكروفلويديك 5. من أجل تصميم ملائم أبعاد الشبكة متناهية وتطبيق إجهاد القص المطلوب، تم بناء نموذج عددي مع الحسابية البرنامج الحيوي السائل لتقدير عن كثب الشخصي التدفق. الوريد السري الخلايا الأولية البشرية البطانية (HUVECs) التي تم المصنف إلى و microchannels صلت التقاء، أي تغطي الأسطح الداخلية بأكملها متناهية، في 3-4 أيام مع نضح المستمر. وقد تجلى تشكيل حاجز السليم عن طريق تلطيخ VE كادهيرين ومقارنة مع تلك التي تكونت في ظل ظروف زراعة الخلايا الثابتة وفي microvessels سليمة. من خلال تطبيق البروتوكولات التجريبية المتقدمة في microvessels سليمة perfused بشكل فردي 6-8، قمنا بقياس كمي التغييرات في المفوضية الأوروبية [كا 2+] انا واكسيد النيتريك (NO) الإنتاج استجابة لأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) مع الفلورسنت فيdicators ومتحد والفحص المجهري مضان التقليدية. [كا 2+] تم الإبلاغ عن الزيادات الناجمة عن ناهض في المفوضية الأوروبية ط وأي إنتاج كإشارات الخلايا اللازمة لزيادة التهابات الناجمة عن الوسيط في microvessel نفاذية 6-15. على الرغم من أن بعض الدراسات السابقة أظهرت لقطات من أجهزة ميكروفلويديك DAF-2 DA تحميل 16،17، وكان قرار والبيانات المناسبة التحليل لم تحقق بعد 18 عاما. على حد علمنا، توضح هذه الدراسة القياسات الكمية الأولى من التغيير الديناميكي الناجم عن ناهض في البطانية [كا 2+] انا وأي إنتاج الاستفادة ميكروفلويديك النظام القائم.

تقنيات التصنيع الدقيق لديها المرونة لافتعال microchannels وصولا الى بضعة ميكرونات وتمكن من تطوير أنماط معقدة لتقليد هندستها من الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي. نحن هنا قدم شبكة متناهية نموذجية مع ثلاثة مستويات من المتفرعة. هذاملفقة الشبكة عن طريق الجمع بين ضوئيه التي تتم في غرف الأبحاث التصنيع الدقيق والطباعة الحجرية الناعمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصنيع جهاز ميكروفلويديك

  1. تلفيق الطباعة التصويرية القياسية من SU-8 العفن 50 ماستر
    1. تنظيف رقاقة السيليكون قبل تدور طلاء. شطف عارية 2 بوصة رقاقة السيليكون مع الأسيتون لمدة 15 دقيقة تليها الإيزوبروبيل (IPA) لمدة 15 دقيقة. يذوى الرقاقة عن طريق وضعه على موقد في 150 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد الجفاف، تبريد رقاقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. تدور معطف رقاقة السيليكون مع SU-8 مقاومة للضوء. إضافة 2 مل SU-8 مقاومة للضوء على الرقاقة. المنحدر الرقاقة إلى 500 دورة في الدقيقة في 100 دورة في الدقيقة التسارع / ثانية لمدة 10 ثانية، تليها 1000 دورة في الدقيقة في 300 دورة في الدقيقة التسارع / ثانية لمدة 30 ثانية. (انظر التكميلي فيديو 1)
    3. قبل خبز الرقاقة على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم تخبز لينة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. استخدام التعرض للأشعة فوق البنفسجية لتحويل نمط تصميم من قناع الفيلم لمقاومة للضوء المغلفة زيادة ونقصان. طباعة على نمط فيلم شفافة رقيقة كقناع الفيلم. وضع قناع الفيلم على قمةتدور المغلفة مقاومة للضوء وفضح للأشعة فوق البنفسجية مع جرعة من 300 ميغا جول / سم 2. (انظر التكميلي فيديو 2)
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، ونمط شبكة متناهية (159 ميكرون قنوات الأم واسعة المتفرعة إلى أربع 100 ميكرون قنوات ابنة واسعة) صمم مع برنامج CAD. نمط على الفيلم يظهر كحقل واضح ويتم تغطية بقية الفيلم من الحبر الأسود. لأن SU-8 هو مقاومة للضوء سلبي، وجزء من مقاومة للضوء أن يتعرض للأشعة فوق البنفسجية يكون crosslinked وتصبح غير قابلة للذوبان في المذيبات خلال تطوير قالب (الخطوة 1.1.6). بعد التطور، وهذا جزء غير قابل للذوبان تكرار نمط شبكة مصممة، ويكون بمثابة القالب الرئيسي.
    5. بعد خبز الرقاقة تعرض على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    6. تطوير القالب الرئيسي. استخدام SU-8 مطور مثل المذيبات لإزالة مقاومة للضوء، crosslinked الامم المتحدة. تزج الرقاقة في SU-8 المطور لمدة 3 دقائق واشطفيه IPAلمدة 1 دقيقة.
    7. كرر هذه دورة تطوير 2-3 مرات حتى يكون هناك تشكيل خط أبيض (بقايا من مقاومة للضوء عدم الشفاء) بعد شطف IPA. يجف بلطف رقاقة مع غاز النيتروجين ودراسة ملامح صغيرة من نمط تحت المجهر. تكرار دورات تطوير إضافية إذا لزم الأمر.
    8. من الصعب خبز الرقاقة على طبق ساخن على 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. الطباعة الحجرية الناعمة
    1. مزيج يدويا شطري (قاعدة وكيل علاج) من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) المطاط الصناعي في وزن. نسبة 10: 1.
    2. دي من الغاز الطبيعي في خليط PDMS مع مجفف اتصال مع فراغ المنزل لمدة 15 دقيقة. يلقي حل PDMS على القالب مقاومة للضوء الرئيسي. يحتاج سمك PDMS أن يكون أكثر من 3 ملم لتوفير عقد مستقر للأنابيب مدخل / مخرج. دي الغاز PDMS مرة أخرى لمدة 15 دقيقة، وإزالة فقاعات الهواء المتبقية مع غاز النيتروجين إذا لزم الأمر. علاج PDMS مسبوكة في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    3. تنظيف سطحساترة الزجاج مع الاسكتلندي ونظافة البلازما (30 ثانية العلاج البلازما). تدور معطف PDMS الشفاء الامم المتحدة (0.5 مل) على ساترة الزجاج من خلال زيادة إلى 4000 دورة في الدقيقة في 500 دورة في الدقيقة معدل تسارع / ثانية لمدة 30 ثانية. علاج ساترة PDMS المغلفة تدور في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    4. قطع والافراج عن PDMS شفي من القالب الرئيسي. قم بإنشاء مدخل ومخرج مع 1 مم الناخس حفرة قطرها في نهاية البعيدة للقنوات الأم.
    5. السندات الجهاز إلى ساترة الزجاج المطلي تدور PDMS. أكسدة أسطح PDMS وساترة مع نظافة البلازما لمدة 1 دقيقة. بعد العلاج البلازما الأكسجين، ووضع قطرات من الماء منزوع الأيونات (DI الماء) على سطح الترابط، ووضع الأجزاء معا. خبز الجهاز في فرن عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتحقيق الترابط الدائم.

figure-protocol-1
تكميلية الفيديو 1 (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

figure-protocol-2
تكميلية فيديو 2 (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

2. البطانية البذر الخلية والثقافة

  1. تعقيم الجهاز وفيبرونكتين] طلاء
    1. الحفاظ على الملكية مسعور من سطح PDMS حول مدخل / مخرج من الأكسدة. تغطية سطح PDMS حول مدخل ومخرج مع المشارب صغيرة من الشريط سكوتش لمنع التأكسد. هذا الإجراء يمكن أن يمنع الماء DI من الانتشار في جميع أنحاء السطح العلوي من الجهاز أثناء الخطوة ملء (2.1.3).
    2. علاج الجهاز PDMS مع البلازما الأكسجين FOص 5 دقائق لتغيير السطح ليكون ماء، وبالتالي تسهيل تدفق السوائل من خلال متناهية ومنع فقاعة محاصرة في إجراء ملء (2.1.3).
    3. استخدام أي حقنة بإبرة المرفقة أو ماصة لملء الجهاز بالماء DI من المدخل. مواصلة التعبئة حتى لا يكون هناك قطرات من الماء DI (30-50 ميكرولتر) المتراكمة عند مخرج. فحص الجهاز تحت المجهر لمعرفة ما اذا كان هناك فقاعات محاصرين داخل متناهية. إزالة قطرات الماء المفرطة في مدخل ومخرج مع المناديل الورقية.
    4. تعقيم الجهاز في طبق بتري مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة لا تقل عن 3 ساعات في غطاء الصفحي السلامة الأحيائية. لمنع التبخر، وتغطي مدخل / مخرج مع قطعة رقيقة من PDMS، ووضع المناديل الورقية المبللة داخل الطبق، والتفاف الطبق مع بارافيلم.
    5. معطف الجهاز مع فبرونيكتين. شطف الجهاز لأول مرة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ثم معطف مع 100 ميكروغرام / مل فبرونيكتين بين عشية وضحاها في الثلاجة (4 ° C). وضع قطرة من حل على مدخل، ثم خلق ضغط سلبي عند مخرج مع فراغ المنزل، حقنة بإبرة أو ماصة.
    6. شغل الجهاز مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية. شطف الجهاز مع برنامج تلفزيوني يدويا لمدة 3 مرات قبل تحميل وسائل الإعلام ثقافة الخلية. الاحماء الجهاز في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. ECS البذر والغرس والإرواء على المدى الطويل
    ملاحظة: مقارنة مع الثقافة التقليدية ثابتة 2D EC، أدلى في المختبر نموذج شبكة microvessel مع نضح المستمر للبيئة زراعة الخلايا أقرب إلى الأوضاع في الجسم الحي. يمكن الحفاظ في المختبر شبكة microvessel موضح في هذا البروتوكول تصل إلى أسبوعين. ونضح تسيطر عليها بشكل جيد تجديد مستمر المغذية، وإزالة النفايات، ومنع الإفراط في التقاء أحادي الطبقة EC. ولذلك، فإنه يمكن أن تمتد إلى دراسات على المدى الطويل، ومحاكاة البيئة الخلوية والدورة الدموية تحت الفيزيولوجي مختلفةلتر والحالات المرضية.
    1. مزيج HUVECs الأساسي في وسائل الإعلام ثقافة HUVEC (MCDB 131) مع 8٪ ديكستران (مول وزن 70000). يتم استخدام ديكستران لزيادة اللزوجة وسائل الإعلام التحميل وتحقيق أفضل نتيجة خلية البذر. كثافة الخلية الموصى بها هي حوالي 2-4 × 10 6 خلية / مل.
    2. البذور الخلايا في الجهاز. وضع قطرة 10-20 ميكرولتر من الخلايا على مدخل. إدخال تدفق لطيف إما عن طريق إمالة الجهاز، أو عمل شعري باستخدام ماصة باستير الزجاج عند مخرج. المفتاح لتحميل خلية الناجح هو السيطرة على سرعة تدفق أقل من 1 ملم / ثانية ضمن أصغر القنوات.
    3. تحقق من بذر الخلية. بعد البذر الأولي، واحتضان الجهاز لمدة 15-20 دقيقة (جو ترطيب من 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية) قبل التحقق من حالة البذر تحت المجهر. إذا لزم الأمر، نفذ تحميل خلية إضافية لتحقيق كثافة الخلايا المطلوبة.
    4. شطف بلطف الجهاز مع خلية ثقافة المتوسط ​​(37° C) لإزالة ديكستران. ثقافة الجهاز في حالة عدم وجود تدفق لأول ساعة 6 في حاضنة (5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية).
    5. إعداد اتصال أنابيب لنضح على المدى الطويل. الشريط الجهاز في طبق بتري لمنع الحركة. خلق ثقوب صغيرة على غطاء طبق بيتري لمدخل ومخرج أنابيب الإدراج. ربط أنابيب مدخل إلى حقنة بإبرة لوسائل الإعلام نضح ثقافة الخلية. ربط الأنابيب منفذ لجمع النفايات.
      ملاحظة: ضع الجهاز وجمع النفايات في حاضنة الثقافة الخلية، في حين وضع مضخة نضح خارج الحاضنة وتوصيله مع الجهاز عن طريق أنابيب مدخل طويل. يتم تحديد معدل نضح من التصميم التجريبي. في الجهاز الحالي، استخدام معدل نضح من 0.35 ميكرولتر / دقيقة ومجموعة إجهاد القص بين 1-2 داين / سم 2. تحت هذا الشرط التروية، وHUVECs تصل إلى نقطة التقاء في حوالي 3-4 أيام.

3. أناmmunofluorescent تلطيخ

  1. إصلاح ECS في الجهاز عن طريق نضح من 2٪ امتصاص العرق لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، تليها برنامج تلفزيوني 1X الشطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، و 1٪ BSA عرقلة لمدة 30 دقيقة. استخدام معدل نضح هذا هو نفسه الذي استعمل للثقافة الخلية.
  2. Permeabilize وECS ثابتة لتلوين الأجسام المضادة مع 0.1٪ تريتون X-100. يروي الجهاز مع تريتون لمدة 5-7 دقيقة إلى تسمية VE كادهيرين، و 3 دقائق لتسمية F-الأكتين.
  3. تحميل الأجسام المضادة في الجهاز. يروي الجهاز مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لتغسل الحلول السابقة. يدويا تحميل الأجسام المضادة الأولية ضد VE كادهيرين (مكافحة الماعز) في الجهاز على تركيز من 2 ميكروغرام / مل (الحجم الكلي هو 20-50 ميكرولتر). إبقاء الجهاز في الثلاجة على 4 درجات مئوية خلال الليل. يروي الأجسام المضادة الثانوية (حمار المضادة للماعز) من قبل ضخ حقنة في تركيز 7 ميكروغرام / مل لمدة 45-60 دقيقة.
  4. تسمية EC F-الأكتين مع phalloidin. يروي الجهاز مع FO برنامج تلفزيوني 1Xص 15 دقيقة قبل تحميل phalloidin (10 ميكروغرام / مل) يدويا لمدة 7-10 دقائق.
  5. التسمية نوى EC (انظر قائمة المواد).
  6. شطف الجهاز مع برنامج تلفزيوني 1X، والحفاظ عليه في 4 درجات مئوية حتى التصوير.

4. الإسفار التصوير من غشائي [كا 2+] ط

  1. يروي الجهاز مع الزلال (10 ملغ / مل) حل -Ringer لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استخدام نفس معدل نضح كما أن استخدامها للثقافة الخلية. ووصف تركيزات جميع مكونات حل الألبومين قارع الأجراس في قائمة المواد.
  2. اقامة نظام متحد البؤر لEC [كا 2+] ط التصوير مع فلوو-04:00. استخدام نظام المجهري متحد البؤر التصوير كاليفورنيا 2+. استخدام ليزر الأرجون (488 نانومتر) لالإثارة وتعيين الفرقة الانبعاثات كما 510-530 نانومتر. جمع الصور مع الهدف 25X (الغمر بالماء، NA: 0.95) في 512 × 512 شكل المسح الضوئي. استخدام خطوة ض 2 ميكرون وفاصل لمسح كل كومة من أناالسحراء من 20 ثانية.
  3. يروي الجهاز مع فلوو-04:00 (5 ميكرومتر) لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم تغسل التجويف فلوو-04:00 مع حل الألبومين رينغر.
  4. الحصول على صور من microvessels فلوو-4 تحميل. جمع الصور الأساس لمدة 10 دقيقة. يروي الجهاز مع ATP (10 ميكرون) وتسجيل التغيرات في كثافة مضان (FI) لمدة 20 دقيقة.

5. الإسفار التصوير من اكسيد النيتريك الإنتاج

  1. يروي الجهاز مع حل الألبومين رينغر لمدة 15 دقيقة. استخدام معدل نضح هذا هو نفسه الذي استعمل للثقافة الخلية.
  2. إعداد نظام التصوير مضان لقياس يسببها ATP إنتاج أكسيد النتريك. استخدام المجهر مزودة كاميرا CCD الرقمية 12-بت ومصراع الكمبيوتر التي تسيطر عليها لقياس أكسيد النيتريك. استخدام مصباح زينون 75 واط كمصدر للضوء.
    ملاحظة: حدد الإثارة وانبعاث الطول الموجي للDAF-2 DA من قبل مرشح تدخل (480/40 نانومتر) ومرآة مزدوج اللون(505 نانومتر) مع وجود حاجز الفرقة تمرير (535/50 نانومتر). استخدام عدسة الهدف 20X (NA: 0.75) لجمع الصور. لتقليل photobleaching من، وضع مرشح الكثافة المحايدة (0.5 N) أمام مرشح التدخل والحد من وقت التعرض إلى 0.12 ثانية.
  3. تحميل الخلايا مع DAF-2 DA (5 ميكرومتر). يروي الجهاز مع DAF-2 DA لمدة 35-40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تسجيل الأساس DAF-2 مضان شدة (FI DAF) بعد التحميل الأولي.
    ملاحظة: DAF-2 DA موجودا باستمرار في الإرواء في كافة مراحل التجربة 7.
  4. جمع DAF-2 الصور. تسجيل الأساس FI DAF لمدة 5 دقائق. يروي الجهاز مع ATP (10 ميكرون) وجمع الصور لمدة 30 دقيقة مع 1 فترات دقيقة. جمع كل الصور من نفس مجموعة من الخلايا في الطائرة الاتصال نفسه.

تحليل 6. البيانات

  1. يدويا تحديد المنطقة المصالح (رويس) من الصور التي تم جمعها على مستوى الخلايا الفردية. كلالعائد على الاستثمار يغطي مساحة خلية فردية واحدة والتي يمكن أن يتضح من المخطط مضان.
  2. طرح مضان الخلفية وحساب FI يعني كل رويس.
  3. قياس التغيرات التي يسببها اعبي التنس المحترفين في المفوضية الأوروبية [كا 2+] انا وأي إنتاج. حجم التغيرات التي يسببها اعبي التنس المحترفين في المفوضية الأوروبية [كا 2+] ط عن طريق حساب التغيرات في فلوو-4 FI (FI / FI 0 * 100، حيث FI 0 هو متوسط ​​FI الأساسي خلال الألبومين قارع الأجراس نضح قبل إضافة ATP) ناقص قياس خلفية. تحديد NO معدل الإنتاج من خلال إجراء أول تحويل التفاضلية للFI DAF مع مرور الوقت.
    ملاحظة: بالطبع وقت FI DAF يمثل إنتاج NO التراكمي مع مرور الوقت. لذلك، يتم احتساب NO معدل الإنتاج استنادا إلى بيان من FI DAF تحت كلا القاعدية وحفز ATP الظروف. وقد وصفت تفاصيل تحليل البيانات والإجراءات التجريبية في منشور السابق 7.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يعرض هذا القسم بعض النتائج التي تم الحصول عليها مع شبكة microvessel مثقف وضعت لهذا البروتوكول. نمط متناهية هو عبارة عن شبكة المتفرعة ثلاثة مستويات (الشكل 1A). في هذا التصميم، وهو 159 ميكرون واسعة فروع قناة الام الى قسمين 126 ميكرون قنوات واسعة، وفروع أخرى إلى أربع 100 ميكرون قنوات ابنة واسعة. تم إجراء المحاكاة العددية 3D لتقدير توزيعات إجهاد القص تحت معدل تدفق 0.35 ميكرولتر / دقيقة (الشكل 1B)، مما يدل على ثلاثة مست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه المقالة، نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتطوير شبكة microvessel مثقف، توصيف تقاطعات EC والهيكل الخلوي توزيع F-الأكتين، والقياسات الكمية من المفوضية الأوروبية [كا 2+] i و NO الإنتاج باستخدام جهاز ميكروفلويديك. ويوفر الجهاز ميكروفلويديك perfused نموذجا في المختبر أن يسمح للمحاكاة وثيقة من وهندستها الاوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي وظروف تدفق القص. منذ يمكن أن تتكون الشبكة microvessel مثقف من قبل ECS البشري الأساسي، وهذا النه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة أو المصالح المتضاربة في الكشف عنها.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد يمنح HL56237، المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى معهد DK97391-03، ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF-1227359 وEPS-1003907).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ATPSigma-AldrichA2383
AcetoneFisher ScientificA929
خزعة لكمةMiltex33-31 AA
ألبومين البقرMP Biomedicals810014
مستخلص دماغ البقر (BBE)LonzaCC-4098
غطاء زلةفيشر Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
Dextran,Sigma-Aldrich31390
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) تقنيات حياة الأجسام المضادة الثانويةA-11055
DPBS, بدون كالسيوم, لا المغنيسيومGibco14190-250
DRAQ5 (تلطيخ النوى) تقنية إشارات الخلية4084
مكمل نمو الخلايا البطانية (ECGS)سيجما ألدريتشE2759-15MG
مصل الأبقار الجنينيجيبكو16000-044
فيبرونيكتينجيبكوPHE0023
فلو-4 AMLife تقنياتF-14201
الجيلاتين من جلد الخنازيرسيجما ألدريتشG1890-100G
Gentamicin (50 مجم / مل)Gibco15750-078
غطاء زجاجيFisher Scientific12-548B
زجاج ماصة باستورVWR14672
ملح الصوديوم الهيبارين من الغشاء المخاطي المعوي للخنازيرSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES محلول ملحيLonzaCC-5024
الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs)LonzaCC-2517
كحول الأيزوبروبيل (IPA)VWR89125
L-Glutamine (200 ملم)Gibco25030-081
مكون
كلوريد الصوديوم (132 ملم)فيشر ساينتفيكS671-3
KCl (4.6 ملليمتر)فيشر ScientificP217-500
CaCl 2< / sub > & middot ؛ 2H 2< / sub>O (2.0 mM) FisherScientificC79-500
MgSO4< / sub> & middot ؛ 7H2< / sub>O (1.2 ملم)فيشر ساينتفيكM63-500
جلوكوز (5.5 ملم)فيشر ساينتفيكBP350-1
NaHCO3< / sub> (5.0 ملم)فيشر ساينتفيكS233-500
ملح هيبس (9.1 مليمتر)الأبحاث6007H
حمض الهيبيس (10.9 ملليمتر)الأبحاث العضوية6003H
MCDB 131 تقنيات الثقافة متوسطةالعمر 10372-019
علوم المجهر الإلكترونيبارافورمالديهايد15710
فالويد (تلطيخ F-actin)Sigma-AldrichP1951
محلول ملحي مخزن بالفوسفات  تقنيات الحياة14040-133
بولي دي ميثيل سيلوكسان (PDMS) شركةداو كورنينجسيلجارد 184
مشرطإكسل إنت29552
شريط سكوتش3M34-8711-3070-3
رقاقة السيليكونVWR14672
SU-8 مقاومة للضوءMicroChemSU-8 2050 Y111072
مطور SU-8MicroChemY020100
قوارير زراعة الأنسجةSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Chemical BookT6878
محلول محايد التربسينGibcoR-002-100
Trypsin / EDTA Solution (TE)GibcoR-001-100
أنابيبCole-Parmerأنابيب التجويف الصغيرة PTFE, 0.012" معرف × 0.030" OD
VE-cadherinسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-6458
<قوي>اسم المعدات<قوي>الشركة<قوي>رقم الكتالوج<قوي>تعليقات / وصف
الحيوية غطاء محرك السيارةالصفحي NuAireNU-425 الفئة الثانية, النوع A2
كاميرا CCDHamamatsuORCA
مجهر متحد البؤرLeicaTCS SL
DesiccatorBel-ArtF42022
HotplateWenescoHP-1212
حاضنةفورما Scientific3110
فرن IsotempBarnstead3608-5
الطباعة الحجرية مقعدKarl SussMA6 الاتصال الطباعة
المجهر البصرينيكونL200 ND & مصراع Diaphod 300
لكاميرا CCDأداة SutterInstrument Lambda 10-2
منظف البلازماPVA TePla / Harrick plasmaM4L / PDC-32G
Spin CoaterBrewer ScienceCee 200X
نظام مضخة حقنةجهاز هارفارد703005
<قوي>اسم البرنامج< / strong> الشركة الكتالوج رقم < / strong> التعليقات / الوصف < / strong>
CAD softwareAutodeskAutoCAD 2015
CFD محاكاةالبرمجيات COMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
الحصول على الصور وتحليلها لعدم الإنتاج  ميتافلورالتصوير العالمي
مخزن محلول الرنجر للثدييات العضوية السلامة الحجرية

المراجع

  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
  3. Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
  4. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
  5. Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797(2015).
  6. He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
  7. Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
  8. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  9. He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
  10. Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
  11. Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
  12. He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
  13. He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
  14. Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
  15. Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
  16. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
  17. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
  18. D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
  19. Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
  20. Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
  21. Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
  22. Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
  23. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
  24. McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
  25. Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
  26. Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
  27. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  28. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
  29. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
  30. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025(2014).
  31. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
  32. Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  33. Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
  34. Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
  35. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
  36. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا البطانيةجهاز الموائع الدقيقةتدفق القصتصوير الكالسيومالمجهر البؤريمجهر الفلورسنتصبغ VE-cadherinتحفيز ATP
تطوير وتوصيف
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.