Method Article

تطوير وتوصيف في المختبر شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا 2+] ط والنيتريك إنتاج أكسيد

DOI:

10.3791/54014

⸱

May 19th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> نمت الخلايا البطانية الأولية للوريد السري البشري (HUVECs) إلى التقاء داخل جهاز شبكة الموائع الدقيقة. تم توضيح تقاطع الخلايا البطانية وتوزيعات F-actin وتم قياس التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وإنتاج أكسيد النيتريك استجابة للأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) في الوقت الفعلي على مستويات الخلايا الفردية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتعرض الخلايا البطانية (ECS) المبطنة لجدران الأوعية الدموية في الجسم الحي باستمرار في التدفق، ولكن غالبا ما تزرع ECS مثقف في ظل ظروف ثابتة ويحمل النمط الظاهري الموالية للالتهابات. على الرغم من أن تطوير أجهزة ميكروفلويديك وقد تبنت من قبل المهندسين أكثر من عقدين، لا تزال تطبيقاتها البيولوجية محدودة. (أ) في المختبر نموذج microvessel أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية التصديق عليها من قبل التطبيقات البيولوجية مهم للمضي قدما في الميدان، وردم الفجوات بين في الجسم الحي والدراسات في المختبر. هنا، نقدم الإجراءات التفصيلية لتطوير شبكة microvessel مثقف باستخدام جهاز ميكروفلويديك مع قدرة نضح على المدى الطويل. علينا أن نبرهن أيضا تطبيقاتها لقياس الكمية من التغيرات التي يسببها ناهض في المفوضية الأوروبية ط وأكسيد النيتريك (NO) إنتاج [2+ كا] في الوقت الحقيقي باستخدام متحد البؤر والفحص المجهري مضان التقليدية. الشبكة microvessel شكلتوأظهر العمل مع نضح المستمر تقاطعات متطورة بين ECS. VE كادهيرين التوزيع كان أقرب إلى تلك التي لوحظت في microvessels سليمة من الطبقات الوحيدة EC مثقف بشكل ثابت. ATP الناجم عن الزيادات العابرة في المفوضية الأوروبية [كا 2+] تم قياس ط وأي إنتاج الكمية في مستويات الخلايا الفردية، والذي صادق على وظيفة من microvessels مثقف. هذا الجهاز ميكروفلويديك يسمح ECS على النمو في ظل ذلك، تدفق ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي تسيطر عليها بشكل جيد، مما يجعل بيئة زراعة الخلايا أقرب إلى المجراة من ذلك في والثقافات 2D الثابتة التقليدية. تصميم شبكة متناهية أنها تتمتع بتنوع كبير، وعملية التصنيع بسيطة وقابلة للتكرار. الجهاز يمكن دمجها بسهولة إلى النظام المجهري متحد البؤر أو التقليدية تمكين ارتفاع القرار التصوير. الأهم من ذلك، لأن الشبكة microvessel مثقف يمكن تشكيلها من قبل ECS الإنسان الأساسية، وهذا النهج بمثابة أداة مفيدة لمعرفة كيفمرضي مكونات الدم غيرت من عينات المرضى تؤثر ECS الإنسان وتوفر نظرة ثاقبة القضايا السريرية. كما يمكن وضعها كمنصة لفحص المخدرات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتعرض الخلايا البطانية (ECS) المبطنة لجدران الأوعية الدموية في الجسم الحي باستمرار في التدفق، ولكن غالبا ما تزرع ECS مثقف في ظل ظروف ثابتة ويحمل النمط الظاهري الموالية للالتهابات 1،2. التكنولوجيا على microfluidics تمكن السائل تسيطر على وجه التحديد من خلال مقيدة هندسيا الميكروسكيل (جنوب ملم) قنوات 3، والذي يوفر فرصة للخلايا المستزرعة، وخاصة بالنسبة الأوعية الدموية ECS، لتنمو في ظل ظروف التدفق المطلوب. هذه الميزات تجعل من شروط الثقافة خلية أقرب إلى المجراة من، ثابتة مزارع الخلايا 2D التقليدية. أنها مهمة للغاية عند استخدام الأجهزة ميكروفلويديك لنموذج أنواع مختلفة من vasculatures ودراسة ردود ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع جهاز ميكروفلويديك

  1. تلفيق الطباعة التصويرية القياسية من SU-8 العفن 50 ماستر
    1. تنظيف رقاقة السيليكون قبل تدور طلاء. شطف عارية 2 بوصة رقاقة السيليكون مع الأسيتون لمدة 15 دقيقة تليها الإيزوبروبيل (IPA) لمدة 15 دقيقة. يذوى الرقاقة عن طريق وضعه على موقد في 150 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد الجفاف، تبريد رقاقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. تدور معطف رقاقة السيليكون مع SU-8 مقاومة للضوء. إضافة 2 مل SU-8 مقاومة للض....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرض هذا القسم بعض النتائج التي تم الحصول عليها مع شبكة microvessel مثقف وضعت لهذا البروتوكول. نمط متناهية هو عبارة عن شبكة المتفرعة ثلاثة مستويات (الشكل 1A). في هذا التصميم، وهو 159 ميكرون واسعة فروع قناة الام الى قسمين 126 ميكرون قنوات واسعة، وفروع أخرى إلى أربع 100 ميكرون قنوات ابنة واسعة. تم إجراء المحاكاة العددية 3D لتقدير توزيعات إجهاد القص تحت معدل تدفق 0.35 ميكرولتر / دقيقة (الشكل 1B)، مما يدل على ثلاثة مست.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتطوير شبكة microvessel مثقف، توصيف تقاطعات EC والهيكل الخلوي توزيع F-الأكتين، والقياسات الكمية من المفوضية الأوروبية [كا 2+] i و NO الإنتاج باستخدام جهاز ميكروفلويديك. ويوفر الجهاز ميكروفلويديك perfused نموذجا في المختبر أن يسمح للمحاكاة وثيقة من وهندستها الاوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي وظروف تدفق القص. منذ يمكن أن تتكون الشبكة microvessel مثقف من قبل ECS البشري الأساسي، وهذا النه.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة أو المصالح المتضاربة في الكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد يمنح HL56237، المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى معهد DK97391-03، ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF-1227359 وEPS-1003907).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-AldrichA2383
AcetoneFisher ScientificA929
خزعة لكمةMiltex33-31 AA
ألبومين البقرMP Biomedicals810014
مستخلص دماغ البقر (BBE)LonzaCC-4098
غطاء زلةفيشر Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
Dextran,Sigma-Aldrich31390
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) تقنيات حياة الأجسام المضادة الثانويةA-11055
DPBS, بدون كالسيوم, لا المغنيسيومGibco14190-250
DRAQ5 (تلطيخ النوى) تقنية إشارات الخلية4084
مكمل نمو الخلايا البطانية (ECGS)سيجما ألدريتشE2759-15MG
مصل الأبقار الجنينيجيبكو16000-044
فيبرونيكتينجيبكوPHE0023
فلو-4 AMLife تقنياتF-14201
الجيلاتين من جلد الخنازيرسيجما ألدريتشG1890-100G
Gentamicin (50 مجم / مل)Gibco15750-078
غطاء زجاجيFisher Scientific12-548B
زجاج ماصة باستورVWR14672
ملح الصوديوم الهيبارين من الغشاء المخاطي المعوي للخنازيرSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES محلول ملحيLonzaCC-5024
الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs)LonzaCC-2517
كحول الأيزوبروبيل (IPA)VWR89125
L-Glutamine (200 ملم)Gibco25030-081
مكون
كلوريد الصوديوم (132 ملم)فيشر ساينتفيكS671-3
KCl (4.6 ملليمتر)فيشر ScientificP217-500
CaCl 2< / sub > & middot ؛ 2H 2< / sub>O (2.0 mM) FisherScientificC79-500
MgSO4< / sub> & middot ؛ 7H2< / sub>O (1.2 ملم)فيشر ساينتفيكM63-500
جلوكوز (5.5 ملم)فيشر ساينتفيكBP350-1
NaHCO3< / sub> (5.0 ملم)فيشر ساينتفيكS233-500
ملح هيبس (9.1 مليمتر)الأبحاث6007H
حمض الهيبيس (10.9 ملليمتر)الأبحاث العضوية6003H
MCDB 131 تقنيات الثقافة متوسطةالعمر 10372-019
علوم المجهر الإلكترونيبارافورمالديهايد15710
فالويد (تلطيخ F-actin)Sigma-AldrichP1951
محلول ملحي مخزن بالفوسفات  تقنيات الحياة14040-133
بولي دي ميثيل سيلوكسان (PDMS) شركةداو كورنينجسيلجارد 184
مشرطإكسل إنت29552
شريط سكوتش3M34-8711-3070-3
رقاقة السيليكونVWR14672
SU-8 مقاومة للضوءMicroChemSU-8 2050 Y111072
مطور SU-8MicroChemY020100
قوارير زراعة الأنسجةSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Chemical BookT6878
محلول محايد التربسينGibcoR-002-100
Trypsin / EDTA Solution (TE)GibcoR-001-100
أنابيبCole-Parmerأنابيب التجويف الصغيرة PTFE, 0.012" معرف × 0.030" OD
VE-cadherinسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-6458
<قوي>اسم المعدات<قوي>الشركة<قوي>رقم الكتالوج<قوي>تعليقات / وصف
الحيوية غطاء محرك السيارةالصفحي NuAireNU-425 الفئة الثانية, النوع A2
كاميرا CCDHamamatsuORCA
مجهر متحد البؤرLeicaTCS SL
DesiccatorBel-ArtF42022
HotplateWenescoHP-1212
حاضنةفورما Scientific3110
فرن IsotempBarnstead3608-5
الطباعة الحجرية مقعدKarl SussMA6 الاتصال الطباعة
المجهر البصرينيكونL200 ND & مصراع Diaphod 300
لكاميرا CCDأداة SutterInstrument Lambda 10-2
منظف البلازماPVA TePla / Harrick plasmaM4L / PDC-32G
Spin CoaterBrewer ScienceCee 200X
نظام مضخة حقنةجهاز هارفارد703005
<قوي>اسم البرنامج< / strong> الشركة الكتالوج رقم < / strong> التعليقات / الوصف < / strong>
CAD softwareAutodeskAutoCAD 2015
CFD محاكاةالبرمجيات COMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
الحصول على الصور وتحليلها لعدم الإنتاج  ميتافلورالتصوير العالمي
مخزن محلول الرنجر للثدييات العضوية السلامة الحجرية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microvessel NetworkEndothelial CellsMicrofluidic DeviceShear FlowCalcium ImagingNitric Oxide ProductionConfocal MicroscopyFluorescence MicroscopyVE cadherin StainingATP Stimulation

Related Articles