يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل من وسائل الإعلام وتطبيقات مكيفة الجهاز لدراسة التأثيرات-الجهاز بشكل خاص على سرطان الثدي النقيلي السلوك

8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54037

⸱

يونيو 13, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 3Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 4Department of Oncology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 5Lawson Health Research Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المخطوطة نظاما نموذجيا خارج الجسم الحي يتكون من وسائط مكيفة بالأعضاء مشتقة من العقدة الليمفاوية والعظام والرئة ودماغ الفئران. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتحديد ودراسة العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الأعضاء وتأثيراتها على استحاء الأعضاء والسلوك النقيلي للخلايا السرطانية.

الملخص

ينتقل سرطان الثدي بشكل تفضيلي إلى العقدة الليمفاوية والعظام والرئة والدماغ والكبد لدى مرضى سرطان الثدي. ركزت الجهود البحثية السابقة على تحديد العوامل المتأصلة في خلايا سرطان الثدي المسؤولة عن هذا النمط النقيلي المرصود (يسمى استحاء الأعضاء) ، ولكن لا يعرف الكثير عن العوامل الموجودة داخل أعضاء معينة تساهم في هذه العملية. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود أنظمة نماذج في المختبر تلخص بدقة البيئة المكروية للأعضاء. لمعالجة هذا الأمر ، تم إنشاء نظام نموذج خارج الجسم الحي يسمح بدراسة العوامل القابلة للذوبان الموجودة في البيئات الدقيقة المختلفة للأعضاء. يتكون هذا النموذج من توليد وسائط مكيفة من الأعضاء (العقدة الليمفاوية والعظام والرئة والدماغ) المعزولة عن الفئران العارية الرياضية العادية. تم التحقق من صحة نظام النموذج من خلال إثبات أن خطوط خلايا سرطان الثدي المختلفة تعرض سلوكا خبيثا خاصا بخط الخلية والخاص بالأعضاء استجابة للوسائط المكيفة بالأعضاء التي تتوافق مع إمكاناتها النقيلية في الجسم الحي. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتحديد وتقييم عوامل قابلة للذوبان مشتقة من الأعضاء قد تلعب دورا في السلوك النقيلي للثدي وأنواع أخرى من الخلايا السرطانية ، بما في ذلك التأثيرات على النمو والهجرة والسلوك الشبيه بالجذع والتعبير الجيني ، بالإضافة إلى تحديد الأهداف العلاجية الجديدة المحتملة للسرطان. هذا هو أول نظام نموذجي خارج الجسم الحي يمكن استخدامه لدراسة السلوك النقيلي الخاص بالأعضاء بالتفصيل وتقييم دور العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الأعضاء في قيادة عملية ورم خبيث سرطاني.

المقدمة

سرطان الثدي هو الأكثر تشخيص كثير من الأحيان السرطان في النساء والسبب الرئيسي الثاني لوفيات المرتبطة بالسرطان 1. ويرجع ذلك أساسا إلى فشل العلاج التقليدي لتخفيف والقضاء على المرض المنتشر ارتفاع معدل الوفيات بسرطان الثدي؛ و ومن المقرر أن الانبثاث 2 ما يقرب من 90٪ من الوفيات الناجمة عن السرطان. فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء سلسلة النقيلي أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة في كل من سرطان الثدي في وقت متأخر من مرحلة مبكرة و.

وقد ساعدت الأبحاث السابقة توضيح طبيعة متعددة الخطوات الانبثاث سرطان الثدي والافتراض بأن نتائج كل تطور السرطان والانبثاث تعتمد إلى حد كبير على التفاعل بين الخلايا السرطانية والبيئة المضيفة 3. وتشير الملاحظات السريرية أن العديد من أنواع السرطان عرض مع الأجسام الجهاز، أي، الميل إلى metastasize تفضيلي محددة organs.In في الاكاديمية(ه) من سرطان الثدي، مرض المريض ينتشر عادة أو مستطير إلى 5 المواقع الرئيسية، بما في ذلك العظام والرئتين والعقد اللمفاوية والكبد والدماغ 4-6. وقد وضعت العديد من النظريات لتفسير هذه العملية، ولكن فقط عدد قليل صمدت أمام اختبار الزمن. افترضت نظرية يوينغ من ورم خبيث، واقترح في 1920s، وكان يدفع الكروب توزيع ورم خبيث المناسب بدقة العوامل الميكانيكية. يتم بموجبها الخلايا السرطانية في جميع أنحاء الجسم عن طريق أنماط تدفق الدم الفسيولوجي محددة العادية وببساطة اعتقال في السرير الشعرية الأولى التي تصادف 7. في المقابل، اقترح ستيفن باجيت 1889 "البذور والتربة" فرضية أن التفاعلات الجزيئية إضافية هي المسؤولة عن بقاء ونمو الانبثاث، حيث الخلايا السرطانية ( "بذور") يمكن تأسيس أنفسهم فقط وmicroenvironments الجهاز proliferatein التي تنتج عوامل الجزيئية المناسبة ( "التربة ") 8. بعد قرن تقريبا، ليونارد فايس تحتأخذ التحليل التلوي من البيانات التشريح نشرت سابقا، وأكد التنبؤ يوينغ أن العديد من الأورام النقيلي الكشف في وقت تشريح الجثة وجدت في نسب المتوقع أن يتوقع إذا تم تحديد النقيلي مع الأجسام الجهاز من أنماط تدفق الدم وحدها. ومع ذلك، في manyinstances كان هناك عدد أقل أو أكثر الانبثاث شكلت في بعض المواقع ثم يتوقع من العوامل الميكانيكية المقترحة يوينغ 9. هذه الحسابات والنظريات تشير إلى أن microenvironments الجهاز معينة تلعب دورا حاسما في أنماط نشر والنمو اللاحق وبقاء العديد من أنواع السرطان بما فيها سرطان الثدي.

فقد ركزت جهود الأبحاث السابقة أساسا على عوامل مستمدة ورم خلايا ومساهمتها في الجهاز مع الأجسام التي لوحظت في سرطان الثدي النقيلي 10-12، والعوامل ولكن القليل من البحث واستكشاف المستمدة من المكروية الجهاز الذي يمكن أن يوفر مكانة مواتية لإنشاءالانبثاث سرطان الثدي. ويعزى هذا إلى حد كبير إلى التحديات التقنية لدراسة مكونات المكروية الجهاز في المختبر.

توضح هذه المقالة الحالية المجراة سابقا نظام نموذج شامل لدراسة تأثير مكونات قابلة للذوبان من العقدة الليمفاوية والعظام والرئة، والمخ على السلوك المنتشر من خلايا سرطان الثدي البشرية. والتحقق من صحة دراسات سابقة هذا النظام النموذج من قبل مما يدل على أن مختلف خطوط خلايا سرطان الثدي تعرض سلوك الخلية خط محددة وهيئة محددة الخبيث ردا على وسائل الإعلام مكيفة الجهاز الذي يتوافق مع في الجسم الحي النقيلي المحتملة 13. هذا النظام النموذجي يمكن استخدامها لتحديد وتقييم العوامل القابلة للذوبان المستمدة من الجهاز المحددة التي قد تلعب دورا في سلوك النقيلي سرطان الثدي وأنواع أخرى من الخلايا السرطانية، بما في ذلك التأثيرات على النمو والهجرة ووقف مثل السلوك، والتعبير الجيني، فضلا عن تحديدالأهداف العلاجية الجديدة المحتملة لمرض السرطان. وهذا هو أول فيفو السابقين نموذج النظام التي يمكن استخدامها لدراسة سلوك جهاز معين المنتشر في التفاصيل، وتقييم دور العوامل القابلة للذوبان المستمدة من الجهاز في دفع عملية الانبثاث سرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا لتوصيات المجلس الكندي للرعاية الحيوان، تحت البروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ويسترن الحيوان استخدام الفرعية.

1. الجهاز عزل (الرئة، المخ، العظام، العقدة الليمفاوية)

  1. إعداد أربعة العقيمة 50 مل أنابيب مخروطية (واحد لكل عضو أن تكون معزولة) التي تحتوي على حوالي 30 مل من العقيمة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS). قبل تزن كل أنبوب من برنامج تلفزيوني باستخدام ميزان الكتروني.
  2. الموت ببطء 6-12 أسبوع الماوس القديم CO 2 الاستنشاق. يجب ترك الفئران في غرفة CO 2 لحوالي 1-2 دقائق أو حتى يتوقف الماوس المتحركة والتنفس. القتل الرحيم ناجحة يمكن وأكد كذلك بسبب عدم وجود ضربات القلب عند فحصها يدويا مع إصبع. تجنب التفكك عنق الرحم لأن هذا الأسلوب قد تمزق الأوعية الدموية في الرقبة مما يؤدي إلى صعوبة إزالة الغدد الليمفاوية الإبطية.
    ملاحظة: استخدمت العمل السابق على وجه التحديدصحية الفئران عارية الإناث، HSD: Athymic Nude- Foxn1 نو 13.
  3. في نسيج الثقافة هود العقيمة، ضع الماوس على ظهرها على وسادة رغوة البوليسترين، ونشر أطرافه واستخدام الدبابيس لإبقائها في مكانها.
  4. باستخدام ملقط معقم والمقص، وقطع الجلد في منطقة البطن في خط الوسط على الأعضاء التناسلية وقطع صعودا نحو الفم. برفق إلى الخلف جلد البطن من عضلات البطن ويعلقون في مكان على لوحة البوليسترين رغوة.
  5. تحديد موقع إبطي، العضدية، والغدد الليمفاوية الأربية.
    ملاحظة: محاصرون العقد الليمفاوية عادة الأنسجة الدهنية. الغدد الليمفاوية الأربية هي أسهل لتحديد مكان كما هي موجودة بشكل سطحي عند تقاطع اثنين من الأوعية الدموية على انسحبت جلد البطن. تقع الإبطين والليمفاوية العضدية العقد أعمق داخل النسيج، وتتطلب المناورة لطيف من الأنسجة.
    1. بعد أن كنت قد تقع الغدد الليمفاوية، استخدم مقص لقطع بلطف وعناية الليمفاوية لاقصر بعيدا عن الجلد والدهون والسفن وإزالتها من الماوس. لتأكيد تشريح السليم، ولفة ملقط على الأنسجة التي تمت إزالتها. في حالة وجود ورم الثابت عند المتداول ملقط على الأنسجة، ثم تمت على الأرجح تم إزالة العقدة الليمفاوية بنجاح.
    2. وضع الغدد الليمفاوية إزالة الجليد الباردة في برنامج تلفزيوني.
  6. باستخدام ملقط ومقص، وفتح تجويف البطن من خلال قطع جدار البطن كشفها في حركة تصاعدية نحو الصدر. قطع بعناية من خلال القص، وفضح التجويف الصدري.
  7. موقع الحجاب الحاجز تحت الرئتين وقطع الحجاب الحاجز. يجب أن سحب نحو الأضلاع بسبب التوتر.
  8. رفع الرئتين من تحت وقطع الأنسجة الكامنة نحو القصبة الهوائية. وهذا يسمح للرئتين لإزالتها بحرية من التجويف الصدري. إزالة القلب والرئتين ككتلة ومكان في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. يمكن إزالة القلب من الرئتين هنا أو قبل وزنها في الخطوة 2.
  9. مسح الدبابيس، والحفاظ على الماوس في مكان على لوحة البوليسترين رغوة. تحويل الماوس فوق وقطع الجلد من أسفل الظهر على طول الطريق عبر من الجناح إلى الجناح.
  10. باستخدام قطعة معقمة من الشاش لعقد الجذع من الفأرة، قشر الجلد الخلفي من الماوس فوق الساقين والقدمين من الفأرة.
  11. باستخدام نفس قطعة من الشاش المعقم، عقد الجزء الأسفل من الساق في المكان، بعناية كسر مفصل الكاحل للقدم الماوس وقشر الجلد فوق المفصل قريب نحو مفصل الركبة.
  12. باستخدام مقص، وإزالة الساق خالية من مفصل الركبة ومكان في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
  13. كرر الخطوات من 1.11) إلى 1.12) مع الطرف الآخر.
  14. باستخدام ملقط، مع الاستمرار على عظم الفخذ في مكان، وقطع بعيدا المحيطة الأنسجة العضلية باستخدام مقص وإزالة عظم الفخذ، ووضعها في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
  15. كرر الخطوة 1.14) مع الطرف الآخر.
  16. باستخدام قطعة جديدة من الشاش المعقم، عقد رئيس الماوس في المكان. باستخدام ملقط ومقص، وإزالة بلطف الجلد لفضح الصورةكول. باستخدام مقص، وقطع بعناية الجمجمة القفوية من مركز أعلى في خط مستقيم والهبوط لفضح الدماغ الخلفي.
  17. باستخدام ملقط، مغرفة تحت الدماغ نحو الجزء الأمامي وإزالة الدماغ كله. وضع الدماغ في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
  18. كرر 1.1) إلى 1.17) خطوات للا يقل عن أربعة الفئران.

2. الجهاز يزن

  1. بعد العزلة الجهاز، تزن كل أنبوب برنامج تلفزيوني يحتوي على أنسجة الرئة والدماغ باستخدام ميزان الكتروني.
  2. حساب الفرق الوزن عن طريق طرح الوزن قبل العزل (PBS فقط) من وزن أنبوب برنامج تلفزيوني + أجهزة (الرئة والدماغ).
  3. تحديد كمية وسائل اللازمة ل resuspend شظايا الأنسجة من الفرق الوزن المحسوب.
    ملاحظة: الرئة وأنسجة المخ هي الوزن تطبيع قبل إعادة تعليق في 4: 1 وسائل الإعلام: نسبة الأنسجة (المجلد / وزن).

3. الجيل من وسائل الإعلام Lung- والعقول مكيفة

  1. في تي معقمقضية الثقافة غطاء محرك السيارة، عكس أنابيب تحتوي على برنامج تلفزيوني الرئة أو الدماغ ثلاث مرات لإزالة الدم المتبقي من الأجهزة ونضح برنامج تلفزيوني يحتوي على الدم. كرر مع برنامج تلفزيوني الباردة العذبة حتى يظهر حل واضح مع عدم وجود دليل على الدم.
  2. وضع الرئتين والعقول في 60 ملم 2 أطباق بتري زجاجي منفصلة. باستخدام اثنين شفرات المشرط المعقم والرئتين اللحم المفروم أو العقول التي كتبها تشريح مرارا ذهابا وإيابا حتى شظايا الأنسجة ما يقرب من ~ 1 مم 3 في حجم.
  3. شظايا الأنسجة resuspend في حجم مناسب (التي سبق تحديدها في الخطوة 2.3) من Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM): وسائل الإعلام F12 تستكمل مع 1X تتركز ملحق mitogen والبنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل).
  4. إضافة معلق الرئة أو أنسجة المخ شظايا في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا.
  5. احتضان شظايا الأنسجة في وسائل الإعلام لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد الحضانة، وجمع مكيفة وسائل الإعلام لكل الأنسجة ووurther يخفف بإضافة ثلاثة مجلدات معادلة من وسائل الإعلام الجديد في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج في وسائل الإعلام مكيفة المخفف لكل جهاز في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة الحطام الأنسجة كبير. جمع طاف وسائل الإعلام وتصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون.
  7. تجمع مشروطة وسائل الإعلام من كل جهاز (أي والرئة مع الرئة والدماغ مع الدماغ) من الفئران متعددة لحساب التباين الماوس إلى ماوس. قسامة ومخزن واشترطت وسائل الإعلام في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. الجيل من وسائل الإعلام مكيفة نخاع العظام

  1. في العقيمة هود زراعة الأنسجة، وتقليم الأنسجة الزائدة من العظام وإزالة المشاش (نهاية القطع) من العظام مع مقص.
  2. باستخدام 27 ½ G إبرة، تجويف النخاع دافق من العظام عن طريق دفع 1 مل من برنامج تلفزيوني من خلال مركز كل العظام. وهذا سوف يسمح لك لجمع خلايا نخاع العظام اللحمية (BMSC) في أنبوب الطازجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وغسل BMSC مرتين مع برنامج تلفزيوني. و resuspend نخاع العظم خلايا انسجة في 20 مل من وسائل الاعلام نمو الخلايا اللحمية العظام (DMEM: وسائل الإعلام F12 تستكمل مع 1X تتركز mitogen ملحق، البنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل) و 10٪ بوفن الجنين المصل (FBS) ).
  4. لوحة 10 مل من خلايا انسجة نخاع العظم معلق في قارورة T75 واحد.
    ملاحظة: الجمع بين والخلايا لوحة من كل الفئران 2 في كل قارورة T75. لمدة أربعة الفئران، وهناك حاجة إلى اثنين من قوارير T75 (حوالي 1 × 10 7 خلايا / قارورة).
  5. احتضان العظام خلايا نخاع اللحمية في انسجة العظام وسائل الاعلام نمو الخلايا لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد الحضانة، وإزالة وسائل الإعلام من كل من قوارير T75 ووضعها في قارورة T75 الجديدة، تسمية هذه القارورة ب "العوام قارورة". إضافة انسجة العظام وسائل الاعلام نمو الخلايا جديدة لقوارير السابقة 2 واحتضان جميع القوارير 3 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  6. بعد خلايا تصل إلى ما يقرب من 70٪ confluency (حوالي 5-7أيام) خلايا مرور. للقيام بذلك، وإزالة المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني (3 مل كل غسل). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من محلول التربسين / EDTA، وضمان أن التربسين يغطي كامل سطح القارورة. بعد خلايا رفع قبالة قارورة (~ 2-3 دقيقة)، ووقف trypsinization رد فعل بإضافة 3 مل العظام انسجة وسائل الاعلام نمو الخلايا). الطرد المركزي 900 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونبذ وسائل الإعلام، والخلايا resuspend في 10 مل من انسجة العظام وسائل الاعلام نمو الخلايا جديدة.
  7. خلايا تجمع من كل قوارير والمرور 1: 5 إلى ثلاث قوارير T75 الجديدة واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد خلايا مرة واحدة تصل مرة أخرى 70٪، كرر الخطوة 4.6 وبركة ومرور جميع الخلايا الملتصقة مرة ثانية. إعادة لوحة كافة الخلايا أربع قوارير T75 واحتضان 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. وينبغي استخدام وسائل الإعلام العظام نمو الخلايا اللحمية لجميع الخطوات.
  8. وسائل الاعلام F12 + 1X تتركز mitogen سو: تسمح للخلايا للوصول إلى نقطة التقاء، وغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة العظام انسجة وسائل الاعلام جمع الخلية (DMEMpplement + البنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل). 10 مل / T75)، والتأكد من أن هذا الإعلام هو خال من FBS. جمع العظام وسائل الإعلام مكيفة نخاع بعد 72 ساعة، من خلال تصفية 0.22 ميكرون فلتر، حوض سباحة، قسامة، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  9. إذا رغبت في ذلك، تأكيد النمط الظاهري للخلايا نخاع العظام انسجة معزولة (BMSC) باستخدام أجسام مضادة ضد الماوس هيئة السلع التموينية-1، CD105، CD29، CD73 و، CD44، وذلك باستخدام تدفق قياسي الخلوي التقنيات كما هو موضح سابقا (13).

5. الجيل من وسائل الإعلام مكيفة عقدة الليمفاوية

  1. في نسيج الثقافة هود العقيمة، عكس أنبوب برنامج تلفزيوني يحتوي على الغدد الليمفاوية ثلاث مرات لإزالة الدم المتبقي من العقد الليمفاوية ونضح الدموي برنامج تلفزيوني. كرر مع برنامج تلفزيوني الباردة العذبة حتى يظهر حل واضح مع عدم وجود دليل على الدم.
  2. وضع الغدد الليمفاوية في أطباق بتري 60 مم 2 الزجاج. باستخدام اثنين شفرات المشرط العقيمة، والعقد الليمفاوية اللحم المفروم التي كتبها تشريح مرارا ذهابا وإيابا حتى TISSUشظايا ه ما يقرب من 1 مم 3 في حجم.
  3. في أنبوب مخروطي الشكل، شظايا الأنسجة resuspend في 10 مل من روزويل معهد الحديقة التذكارية 1640 (RPMI1640) وسائل الإعلام تستكمل مع البنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل)، 5 × 10 -5 M العقيمة β-المركابتويثانول ( 1.75 ميكرولتر / 500 مل وسائل الاعلام) و 10٪ FBS.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend جميع الخلايا في 30 مل سائل الإعلام. إضافة 5 مل وسائل الاعلام / بشكل جيد في لوحة 6 جيدا واحتضان لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. بعد الحضانة مدة 7 أيام، تجاهل وسائل الإعلام، وغسل الخلايا الملتصقة مع 5 مل PBS الحار وإضافة 5 مل وسائل الإعلام الجديدة إلى كل بئر. تسمح للخلايا أن تنمو إلى confluency (حوالي 5-7 أيام)، ويعرض للتريبسين، تجمع كل الخلايا، والمرور كما هو موضح في الخطوة 4.6. خلايا إعادة لوحة لوحة 6 جيدا. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  6. بعد ثلاثة مقاطع، تسمح للخلايا أن تنمو إلى confluency، وغسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل / بئر DMEM: F12 + 1Xملحق المركز mitogen والبنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل)، وضمان أن هذا الإعلام هو خال من FBS. جمع الليمفاوية وسائل الإعلام مكيفة عقدة بعد 72 ساعة وحمام سباحة وقسامة، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  7. إذا رغبت في ذلك، تأكيد النمط الظاهري للخلايا العقدة الليمفاوية انسجة معزولة (LNSC) باستخدام أجسام مضادة ضد CD45 الماوس وgp38، وذلك باستخدام تدفق قياسي الخلوي التقنيات كما هو موضح سابقا (13).

6. استخدام وسائل الإعلام مكيفة الجهاز لفحوصات المصب فيما يتعلق بالسلوك النقيلي من خلايا السرطان

  1. وبمجرد أن وسائل الإعلام مكيفة الجهاز قد ولدت كما هو موضح في الخطوات 1-5، واستخدامها لتنفيذ مختلف خلية المصب والمقايسات البيولوجيا الجزيئية من أجل تحديد تأثير العوامل المشتقة من الجهاز القابلة للذوبان على السلوك المنتشر من الخلايا السرطانية. وتشمل الأمثلة على فحوصات القياسية (موضح في مكان آخر في الأدب) صفائف البروتين 13، فحوصات النمو الخلوية <سوب> 13، والهجرة الخلوية فحوصات 13، tumorsphere تشكيل 14، وRT-PCR 15. استخدمت وسائل الإعلام القاعدة الأصلية لتوليد وسائل الإعلام مكيفة الجهاز (أي غير المشروط DMEM: وسائل الإعلام F12 تستكمل مع 1X تتركز ملحق mitogen والبنسلين (50 ميكروغرام / مل) / الستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل) يجب أن تستخدم لمراقبة سلبية .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

جيل الإعلام مكيفة الجهاز

يتم تقديم مخطط الشامل / التخطيطي لعملية عزل الجهاز وتوليد وسائل الإعلام مشروط في الشكل رقم 1، مع الصور الفوتوغرافية تمثيلية من الإجراء هو موضح في الشكل (2). وتجدر الإشارة إلى أنه عندما كان هذا البروتوكول الأول قيد التطوير، أدرج الكبد في تحليلنا لأنه هو موقع مشترك للال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الانبثاث هي عملية معقدة التي يتم من خلالها سلسلة من الأحداث الخلوية هي المسؤولة في النهاية عن غزو الأنسجة وورم بعيد إنشاء 4،30،31. ويمكن الاستفادة من نظام نموذجي خارج الجسم الحي المقدمة هنا لدراسة جانبين مهمين من التقدم النقيلي: سرطان الخلايا صاروخ موجه أو الهجرة إلى جهاز معين ( "للوصول إلى هناك") والنمو في هذا الجهاز ( "المتزايد هناك"). والعديد من الدراسات التي تركز سابقا على تحديد الخصائص الجزيئية الرئيسية المرتبطة الخلايا السرطانية نفسها ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الكندية لسرطان الثدي - منطقة أونتاريو ، والمؤسسة الكندية للابتكار (رقم 13199) ، ودعم المانحين من جون ودونا بريستول من خلال مؤسسة لندن للعلوم الصحية (إلى ALA). تم توفير دعم المنح الدراسية والزمالة من خلال برنامج المنح الدراسية للخريجين في أونتاريو (مقاطعة أونتاريو ، إلى GMP و JEC) ، وبرنامج المنح الدراسية الكندية للدراسات العليا - الماجستير (إلى M.M.P) ، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) - برنامج التدريب الاستراتيجي (إلى M.M.P. و GMP و JEC) ووحدة باميلا غريناواي كولماير لأبحاث سرطان الثدي الانتقالي في برنامج لندن الإقليمي للسرطان (إلى M.M.P. ، GMP و JEC و Y.X.). يتم دعم A.L.A. بجائزة CIHR للباحث الجديد وجائزة الباحث المبكر من وزارة البحث والابتكار في أونتاريو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
50 مل أنابيب مخروطيةThermo Scientific (Nunc)339652حافظ على معقم
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفاتThermoFisher Scientific10010-023حافظ على
الفئران العاريةHarlan LaboratoriesHsd: Athymic Nude-Foxn1nuاستخدم في عمر 6-12 أسبوعا
وسادة رغوة البوليسترينN / AN / Aيمكن استخدام الغطاء المهمل (~ 4 × 8 بوصات أو أكبر) لحاوية شحن رغوة البوليسترين لهذا الغرض. تعقيم بالمسح بالإيثانول.
العلوم الدقيقة الملقط11050-10حافظ على
مقصأدوات العلوم الدقيقة14058-11حافظ على
وسادات شاشفيشر Scientific22-246069حافظ على معقمة
60 مم < sup > 2 < / sup> أطباق بتري زجاجيةSigma-AldrichCLS7016560حافظ على
شفرات مشرطفيشر S95937Aحافظ على معقم
DMEM: F12Life Technologies21331-020دافئ في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام ، حافظ على معقمة   ؛
يشار إلى 1x Mito + Serum ExtenderBD Biosciences355006باسم "مكمل الميتوجين المركز" في المخطوطة. حافظ على معقم
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)Life Technologies15140-122حافظ على معقم
معهد روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI 1640) LifeTechnologies11875-093دافئ في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام ، حافظ على معقمة   ؛
مصل الأبقار الجنينيسيجما-ألدريتشF1051-500MLالحفاظ على
محلول التربسين / EDTAThermoFisher ScientificR-001-100دافئ في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام ، حافظ على معقمة   ؛
6 ألواح ثقافة الأنسجةالآبار الحرارية العلمية (Nunc)140675حافظ على معقمة
0.22 مو ؛ مرشحات المحقنةm Sigma-AldrichZ359904الحفاظ على
قوارير ثقافة الأنسجة T75Thermo Scientific (Nunc)178905حافظ على معقمة
TranswellsSigma-AldrichCLS3464حافظ على التعقيم ، واستخدمه لمقايسات الهجرة
مكافحة الفئران Sca-1R & أنظمة FAB1226Pاستخدامها في 10 & micro; l / 106< / sup> الخلايا
المضادة للفأر CD105R & FAB1320P تستخدم D Systemsعند 10 & micro; l / 106< / sup> الخلايا
المضادة للفأر CD29R & D SystemsFAB2405P-025تستخدم عند 10 & micro ؛ L / 106< / sup> الخلايا
المضادة للفأر CD73R & Systems FAB4488Pاستخدامها عند 10 & micro; L / 106< / sup> الخلايا
المضادة للفأر CD44R & تستخدم DSystems MAB6127-SPعند 0.25 & micro; g / 106< / sup> الخلايا
المضادة للفأر CD45eBioscience11-0451-81استخدام في 5 & micro ؛ L / 106< / sup> خلايا
مضادة للفأر gp38eBioscience12-5381-80تستخدم في 10 & micro ؛ L / 106< / sup> الخلايا
&بيتا;-mercaptoethanol سيجما ألدريتشM6250 حافظ على معقمة
مصفوفات البروتينRayBiotech Inc.AAM-BLM-1-2استخدم مصفوفة واحدة لكل حالة وسائط (بما في ذلك التحكم السلبي)، بثلاث نسخ
المعقمة أدوات معقم معقمة معقمة العلمي المعقم المعقمة D D

المراجع

  1. Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  3. Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
  4. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  5. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  6. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  7. Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278(1928).
  8. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
  9. Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
  10. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
  11. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
  12. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
  13. Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
  14. Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
  15. Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
  16. Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
  19. Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
  20. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
  21. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
  22. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
  23. Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
  24. Zlotnik, A. Chemokines and cancer. Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).
  25. Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
  26. Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
  27. Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805(2014).
  28. Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
  29. Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
  30. Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
  31. Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).
  32. Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
  33. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
  34. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
  35. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
  36. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  37. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
  38. Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RT qPCR
جيل من وسائل الإعلام وتطبيقات مكيفة الجهاز لدراسة التأثيرات-الجهاز بشكل خاص على سرطان الثدي النقيلي السلوك
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.