هنا، نقدم بروتوكول لتجميع جزيئات تشبه الفيروس باستخدام الفيروسة العصوية أو الأنظمة التعبير الثدييات، وتنقية تنبيذ فائق. يستخدم هذا النهج عالية للتخصيص لتحديد المضادات الفيروسية كأهداف لقاح بطريقة آمنة ومرنة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) والجسيمات subviral (SVPs) هي مقاربة بديلة لتصميم لقاح فيروسي التي توفر مزايا زيادة السلامة الأحيائية والاستقرار على استخدام مسببات الأمراض الحية. غير المعدية وتجميع الذات، وتستخدم VLPs لتقديم البروتينات الهيكلية كما immunogens، تجاوز الحاجة لمسببات الأمراض حية أو ناقلات فيروسية المؤتلف للتسليم المستضد. في هذه المقالة، ونحن لشرح مراحل مختلفة من التصميم فلب والتنمية للتطبيقات المستقبلية في التجارب على الحيوانات قبل السريرية. ويشمل الإجراء المراحل التالية: مجموعة مختارة من مستضد والتعبير عن مستضد في خط الخلية في الاختيار، وتنقية VLPs / SVPs، وتقدير للمستضد الجرعات. ونحن لشرح استخدام كل من خطوط خلايا الثدييات والحشرات للتعبير عن المستضدات لدينا وإظهار كيف تختلف المنهجيات في العائد. قد يتم تطبيق منهجية عرضها على مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ويمكن أن يتحقق عن طريق استبدال مولدات المضادات مع شارع مناعةالبروتينات uctural من الكائنات الحية الدقيقة المستخدم من الفائدة. VLPs وSVPs تساعد مع توصيف مستضد واختيار أفضل المرشحين لقاح.
المقدمة
جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) هي تكنولوجيا معتمدة للتطعيم البشري. في الواقع، بعض اللقاحات المرخصة أكثر معاصرون، بما في ذلك فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) وΒ التهاب الكبد (HepΒ) اللقاحات تستخدم هذا النهج. تتشكل VLPs من البروتينات الهيكلية قادرة على التجميع الذاتي. الجسيمات تجميعها تحاكي الأشكال التضاريسية الفيروسية، ولكن لا يمكن أن تصيب أو تكرار لأنها تفتقر إلى الجينوم الفيروسي. VLPs يمكن التعبير عن وتنقيته من عدد من أنظمة بدائية النواة وحقيقية النواة. كشفت مراجعة للأدبيات التي نظم التعبير المختلفة ويعمل على أساس المعدلات التالية: البكتيريا - 28٪، الخميرة - 20٪، والنبات - 9٪، الحشرات - 28٪، والثدييات - 15٪ 1. من المذك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. نظام التعبير الثدييات لتوليد الأنفلونزا H3N2 فلب
- Subclone الفيروسي الهيكلي بروتين هيماغلوتينين (HA)، النورامينيداز (NA)، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) الكمامة P55 في ناقلات التعبير حقيقية النواة، مثل pTR600 سبق وصفها 7.
- تضخيم الحمض النووي في القولونية المختصة كيميائيا (على سبيل المثال، DH5α) وعزل ترنسفكأيشن الصف البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. كمية من الحمض النووي يعتمد على المحصول واحتياجات المستخدم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وكانت غلة فلب المتغيرة التي كتبها الفيروسي تصميم مستضد بناء. في هذا البروتوكول، ونحن أثبتنا استخدام خلايا الحشرات والثدييات لإنتاج SVP أو VLPs في طاف وتنقية من قبل تنبيذ فائق. تم استخدام أربعة أنواع فرعية من DENV PRM / E الجينات الهيكلي أشرطة التعبير لبناء إصدارات DENV SVPs (ترسيمها كما 1-4) في الجدول 1 ويبرهن على وجود تتراوح ما بين 1،1-2،6 ملغ من البروتين الكلي في 0.6 مل وحدات التخزين. لVLPs التي تتطلب ثلاث بنيات الجينات، وجدنا ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استخدمنا الأساليب المذكورة أعلاه للتعبير عن بنجاح وتنقية SVPs وVLPs تتكون من البروتينات الهيكلية المتعددة لمختلف مسببات الأمراض. بشكل عام، ونحن نستخدم أنظمة التعبير الثدييات لتوليد VLPs لدينا. ومع ذلك، في أيدينا، المستمدة من الثدييات خلية كانت تشيك عوائد فلب منخفضة. وكان تشيك العائد فلب أكثر قوة عند استخدام نظام خلية الفيروسة العصوية الحشرات المؤتلف. بشكل عام، الفيروسة العصوية الحشرات نظم خلايا تسفر عن كميات أكبر من البروتينات المؤتلف، التي قد تنجم عن كثافة الخلية العليا التي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ونود أن ننوه أعضاء مسبق من مختبر روس الذين ساهموا في تحسين بروتوكول للكفاءة القصوى والعوائد.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجموعة البلازميد ماكسي | كياجين | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| تقنيات الحياة الليبوفيكتامين | L3000075 | ليبوفيكتامين 2000 ، ليبوفيكتامين 3000 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| التعبير عن الفيروسات العصبية Bac-to-Bac | تقنيات الحياة | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 لوحة نمام متعددة | النقاط ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| أنابيب الطرد المركزي الفائق Polyclear | Seton | 7025 | تأكيد الأنابيب المناسبة لأجهزة الطرد المركزي الفائقة وحجم الجرافة |
| Protein Assay | Kit ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| عازلة سترات الفوسفات | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine ثنائي هيدروكلوريد | سيجما | P8287 | |
| 0.22 & م أعلى مرشح فراغ (500 مل) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2< / sub>SO4< / sub> | Sigma | 339741 | |
| SF-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
المراجع
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug De....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
