مقالة منهجية

الجلدي إزالة التعصيب الجراحي: هناك طريقة لاختبار شرط لالأعصاب في نماذج الماوس من الأمراض الجلدية

DOI:

10.3791/54050

⸱

يونيو 26, 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتضمن هذه المقالة بروتوكولات مفصلة للوسم الجيني لجلد الفأر ، وإزالة التعصيب الجراحي ، وخزعة الجلد ، وتصور الظهارة المصنفة عن طريق تلطيخ β-galactosidase بالكامل. يمكن استخدام هذه الطرق لاختبار متطلبات الأعصاب في نماذج الفئران ذات الجلد الطبيعي والمرضي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعمل الأعصاب الحسية الجسدية الجلدية على اكتشاف المحفزات المتنوعة التي تعمل على الجلد. بالإضافة إلى أدوارها الحسية الراسخة ، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن الأعصاب قد تعدل أيضا اضطرابات الجلد بما في ذلك التهاب الجلد التأتبي والصدفية والسرطان. هنا ، نصف بروتوكولات اختبار متطلبات الأعصاب في الحفاظ على العضو الحسي الميكانيكي الجلدي ، قبة اللمس (TD). على وجه التحديد ، نناقش طرق وضع العلامات الوراثية والحصاد وتصور TDs عن طريق تلطيخ التثبيت بالكامل ، ولإجراء إزالة التعصيب الجراحي من جانب واحد على جلد ظهر الفأر الظهري. معا ، يمكن استخدام هذه الأساليب لمقارنة مورفولوجيا TD والتعبير الجيني مباشرة في الجلد منزوع التعصيب وكذلك الجلد الذي يتم تشغيله بواسطة الزيمة من نفس. يمكن أيضا تكييف هذه الطرق بسهولة لفحص متطلبات الأعصاب في نماذج الفئران لأمراض الجلد. أخيرا ، توفر القدرة على أخذ عينات من الجلد بشكل متكرر فرصة لمراقبة تطور المرض في مراحل وأوقات مختلفة بعد البدء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى السنوات القليلة الماضية ، كان هناك تقدير متزايد لتأثير الأعصاب على الأمراض التي لا ينظر إليها عادة على أنها اعتلالات عصبيةكلاسيكية 1-4. في الجلد ، أشارت الأدلة التجريبية الحديثة إلى أن الأعصاب الحسية يمكن أن تعدل أمراض متنوعة تتراوح من الصدفية إلى السرطان5-9. وقد ثبت ذلك باستخدام تقنيات مثل إزالة التعصيب الجراحية والتثبيط الدوائي للوظيفة العصبية في القوارض. في حالة الصدفية ، قدمت هذه الدراسات إطارا ميكانيكيا لفهم سبب تراجع لويحات الصدفية البشرية بعد فقدان الوظيفة العصبية7،10-12.

يمكن أن تؤثر الأعصاب الجلدية أيضا على التعبير الجيني13،14 وهي ضرورية للاستشعار الميكانيكي في الجلدالطبيعي 15. على وجه الخصوص ، تتكون ظهارة القبة التي تعمل باللمس (TD) من رقعة من خلايا البشرة العمودية جنبا إلى جنب مع خلايا ميركل العصبية الصم العصبية التي يتم تعصيبها عن طريق التكيف البطيء مع الألياف العصبية من النوع 1 (SA1)16-18. تتوسط TDs الإحساس باللمس الخفيف وقد ثبت أنها تعرض نشاط مسار القنفذ5،19. تعتمد صيانة TD على التعصيب20،21 ، حيث تفرز الأعصاب روابط القنفذ للحفاظ على TDs الطبيعية وخلايا ميركل المرتبطةبها 19. بالإضافة إلى ذلك ، يعزز التعصيب تكوين الورم المعتمد على القنفذ من ظهارة TD5. تعزز هذه الدراسات معا فكرة أن التفاعلات الجزيئية المعقدة التي تحدث بين الأعصاب والخلايا المحيطة بها في مكانتها ضرورية لفسيولوجيا TD الطبيعية وكذلك المرض.

للاستجواب في طبيعة هذه التفاعلات ، نصف هنا سلسلة من تقنيات in vivo لمعالجة التعبير الجيني في TD ، وكذلك لحصاد خزعات الجلد لتصور TD بعد تتبع النسب. أخيرا ، نصف إجراءات إجراء إزالة التعصيب الجراحي من جانب واحد ، حيث تتم إزالة الأعصاب من جانب واحد من الجلد الظهري للفأر ، مع ترك الجانب المقابل سليما كتحكم داخلي زائف. بعد عدة أسابيع من الجراحة ، تتم مقارنة الجلد منزوع التعصيب والزائف لتقييم التغييرات التي تحدث عند استئصال الأعصاب. على الرغم من أن هذه التقنيات موصوفة في سياق TDs الطبيعية ، فقد تم استخدام إجراء إزالة التعصيب لفحص متطلبات الأعصاب في نماذج الفئران من الصدفية6 والتئام الجروح13 وتكوين الأورام5. أخيرا ، نظرا لأن الجلد عرضة للخزعات المتكررة ، فإن هذا يوفر فرصة لمراقبة مصير الخلايا المصنفة على المدى الطويل أو لتقييم تطور المرض على مدى نقاط زمنية متعددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للوائح التي تضعها جامعة ميشيغان وحدة لمختبر الطب الحيواني.

1. الحث على إعادة التركيب الجيني في الفئران

ملاحظة: Gli1 TM3 (لجنة المساواة العرقية / ERT2) العلج / J الماوس سلالة (Gli1-CreERT2) 13 تمكن تستهدف إعادة التركيب الجيني تاموكسيفين التي يسببها لTD ظهائر. عبور هذه السلالة مع B6.129S4-GT (ROSA) 26Sor tm1Sor / J الفئران مراسل (LacZ) 22 لتوليد Gli1، الحيوانات LacZ لتصور خلايا TD التي كتبها كامل جبل تلطيخ أدناه.

  1. يعد حل تاموكسيفين إلى تركيز 12.5 ملغ / مل في زيت الذرة.
    1. في أنبوب 1.5 مل، تضيف ما يصل إلى 20 ملغ من عقار تاموكسيفين البلورية، ثم 1 مل من زيت الذرة. الشريط بحزم أنبوب لخلاط دوامة، ودوامة مستمرة على أعلى الإعداد في RT حتى تاموكسيفين قد حلت بالكامل (2-4 ساعة)، كماأكدت دراسة أنبوب تحت المجهر تشريح لعدم وجود الجسيمات تاموكسيفين.
    2. نقل الحل إلى أنبوب 15 مل ويخفف من عقار تاموكسيفين لتركيز النهائي من 12.5 ملغ / مل مع زيت الذرة إضافية. خلط قبل vortexing الحل لزج لمدة 30 ثانية إضافية. تخزين هذا الحل لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع في 4 درجات مئوية في الظلام.
  2. حقن محلول تاموكسيفين البريتونى إلى Gli1، الفئران LacZ، في حجم 200 ميكرولتر لكل 20 غرام من وزن جسم الفأر، لجرعة تاموكسيفين فعالة من 2.5 ملغ لكل 20 غرام من وزن الفأر.

2. حصاد خزعات الجلد

ملاحظة: اعتمادا على التجربة، خزعات الجلد الحصاد عدة أيام إلى أسابيع بعد تحريض تاموكسيفين. لجميع العمليات الجراحية، اتبع بروتوكولات موحدة لجراحة القوارض، بما في ذلك استخدام القفازات المعقمة، وارتداء قناع الشعر أو العمليات الجراحية الشبكة، والتي تغطي حيوان مع ثنى الجراحية المعقمة أثناء العملية.

  1. إعداد 10X حل سهم مخدر عن طريق خلط 90 ملغ / مل الكيتامين و 6.5 ملغ / مل زيلازين في الماء. تمييع هذا المحلول 01:10 في برنامج تلفزيوني العقيمة فقط قبل استخدامها، وتخزينها في RT في الظلام لمدة تصل إلى 8 أشهر.
    1. بدلا من ذلك، تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلورين، بدءا من تركيز الغاز من 4٪ مع الأكسجين لتخدير الكامل للحيوان، ثم بعد ذلك خفض هذا إلى 1-2٪ لمدة الإجراء.
  2. حقن محلول مخدر داخل الصفاق بجرعة 200 ميكرولتر لكل 20 غرام من وزن الجسم الماوس. تأكد من أن الحيوان قد وصل إلى الطائرة المناسبة للتخدير عن طريق فحص قرصة أخمص قدميه، وتؤكد أن القلب والجهاز التنفسي معدلات طبيعية (حوالي 600 نبضة و 160 نفسا في الدقيقة، على التوالي).
  3. استخدام المقص الكهربائي لإزالة الشعر من موقع خزعة على الجلد ظهري إلى الوراء، والحرص على عدم شق أو تلف الجلد الكامنة وراءها.
  4. إعداد الموقع الجراحي عن طريق المسح حلاقةمنطقة د في الاتجاه الأمامي إلى الخلفي باستخدام Betadine والكحول مناديل. ضمان تتم إزالة كافة قصاصات الشعر من الموقع.
  5. مخطط الموقع الخزعة باستخدام علامة سوداء، ووضع الحيوان على وسادة الاحترار في المنطقة الجراحية العقيم، وتغطي مع ثنى الجراحية المعقمة (لأغراض العرض التوضيحي، تم حذف ثنى العقيمة لزيادة وضوح).
    ملاحظة: للحصول على المقاطع الطولية من بصيلات الشعر، وعلى حافة أطول من خزعة (حافة أن يكون مقطوع لالأنسجة، ~ 1 سم) يجب أن تعمل في اتجاه الأمامي الخلفي (موازية لاتجاه من بصيلات الشعر)، parasagital ل خط الوسط الظهرية (الشكل 1A).
  6. استخدام معقم # 11 مشرط لجعل الختان سمك الكامل على طول منطقة ملحوظة دون الإضرار اللفافة العضلية الأساسية.
    ملاحظة: تتضمن أنسجة الجلد رفعه البشرة، الأدمة، والدهون تحت الجلد والعضلية السبلة. النزيف عادة ما يكون الحد الأدنى.
  7. تتسطح رانه رفعه عينة من الجلد على منشفة ورقية جافة، جنبا الأدمة أسفل، تقليم بعيدا منشفة ورقية الزائدة، وتخزين العينة في برنامج تلفزيوني الباردة لمدة تصل إلى 1 ساعة إذا لا بد من جمع عينات أخرى. عندما تصبح جاهزة، والمضي قدما في خطوات 3.1 أو 3.2 لمعالجة عينات للأنسجة، أو الخطوة 4 لبيتا غالاكتوزيداز (LacZ) تلطيخ كله جبل.
  8. خياطة إغلاق الموقع الخزعة باستخدام 6-0 خيوط النايلون، في نمط توقف بسيط متباعدة تقريبا 3 ملم بعيدا.
  9. لا عودة الفئران التي خضعت لعملية جراحية في نفس القفص كما غيرها من الحيوانات حتى بعد الشفاء التام.
  10. مراقبة الحيوانات مباشرة بعد عملية جراحية حتى يستعيد وعيه، وأيضا يوميا حتى تلتئم منطقة العمليات الجراحية، عادة في حدود 1 في الاسبوع. استخدام المسكنات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية المعينة إذا الفئران تبدي علامات الألم أو الضيق. إزالة الغرز في غضون 7-10 أيام بعد الجراحة.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، وإعداد حل مسكن عن طريق تمييع كاربروفين (50 ملغ / مل الأسهم solutأيون) 1: 100 في الماء المعقم. حقن تحت الجلد حل بين لوحي الكتف بالقرب من القفا من الرقبة، وبجرعة 200 ميكرولتر لكل 20 غرام من وزن الجسم (5 ملغ / كغ الماوس وزن الجسم).

3. عينات العملية لعلم الأنسجة

ملاحظة: لإصلاح ومعالجة الأنسجة رفعه، استخدم الأسلوب أدناه اعتمادا على التطبيق.

  1. لتوليد العينات النسيجية جزءا لا يتجزأ من البارافين، إصلاح الجلد في 3.7٪ من الفورمالين في برنامج تلفزيوني O / N في RT وتخزينها في الايثانول 70٪ لتصل إلى 2 أسابيع. إزالة منشفة ورقية قبل التضمين في البارافين.
  2. لتوليد عينات نسيجية المجمدة، غمر النسيج في البرد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني ويهز بلطف لمدة 1 ساعة. إزالة الحل وغسل العينة مع 3 تغييرات في برنامج تلفزيوني، ما يقرب من 5 دقائق لكل منهما. بعد ذلك، غمر العينة في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني لcryoprotect النسيج ( "غرق السكروز").
  3. احتضان مع طيف تهز O / N عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، وإزالة ورقة سحبايل وتقليم بعيدا النسيج الزائد الدهنية من الجانب الجلد من الجلد. تضمين الأنسجة مباشرة في أكتوبر وتخزين كتلة المجمدة في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: بعد باجتزاء، إما البارافين أو العينات المجمدة يمكن أن تكون ملطخة بواسطة المناعية للتعرف على المواد الصلبة الذائبة، وخلايا ميركل والأعصاب باستخدام أجسام مضادة ضد كيراتين 17، القرتين 8 و خيط عصبي، على التوالي، كما هو موضح سابقا 5،19.

4. عينات تصور كتبها جبل لالجامع LacZ تلطيخ

  1. إعداد X-غال حل تلطيخ.
    1. الجمع بين 0.94 غ فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة، و 2.6 جم فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة في 250 مل من الماء المعقم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3. إلى ذلك، إضافة 0.5 مل من 1 M كلوريد المغنيسيوم، 0.528 غرام من فيرو سيانيد البوتاسيوم، و0.412 غرام من فيري سيانيد البوتاسيوم. إضافة 250 ميكرولتر من جلايكول octylphenyl البولي اثيلين و 125 ملغ من deoxycholate. الحل قاعدة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر في الظلام.
    2. إعداد 50X الأسهم soluti X-غالعلى طريق إضافة ثنائي ميثيل الفورماميد إلى الزجاجة الأسهم X-غال لتوليد 50 ملغ / مل حل. تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية في الظلام.
    3. فقط قبل استخدامها، وتمييع الحل الأسهم X-غال 1:50 إلى حل قاعدة X-غال لتوليد حل تلطيخ. لخزعات أصغر (<1 سم 2)، قسامة 1-2 مل من محلول تلطيخ كل عينة.
  2. إصلاح عينة من الجلد التي تم جمعها في الخطوة 2.7 في محلول يحتوي على 2٪ امتصاص العرق / 0.2٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني الباردة لمدة 30 دقيقة، والهز برفق على الجليد. لخزعات أصغر (<1 سم 2)، استخدم 1-2 مل من محلول تثبيتي في العينة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، وتحديد العينات في 2-4٪ امتصاص العرق فقط، أو في 0.5٪ غلوتارالدهيد فقط. تعتمد شروط التثبيت الأمثل على النسيج، ودرجة التعبير LacZ والتطبيق.
  3. إزالة الحل تثبيتي، وشطف عينات مع 3 تغييرات في برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل منهما، على شاكر في RT.
  4. إزالة منشفة ورقية تحت العينة وقطع excesق الأنسجة الدهنية من الجانب الجلد من الجلد عن طريق تجتاح الدهون مع ملقط كليلة وتقليم مع مقص تشريح.
  5. غمر العينة في X-غال حل تلطيخ، واحتضان عند 37 درجة CO / N. سوف LacZ التعبير تكون واضحة كما وصمة عار الزرقاء تحت المجهر تشريح (الشكل 1B).
    ملاحظة: إذا كانت كثافة إشارة ضعيفة، يستعاض عن حل تلطيخ في اليوم التالي وكرر O / N الحضانة. إذا كان تلوين الخلفية مكثفة جدا، والحد من الوقت للتلطيخ، أو احتضان العينة في RT بدلا من 37 درجة مئوية.
  6. إزالة حل تلطيخ وغسل العينات في 3 تغييرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 3٪ DMSO لحوالي 5 دقائق، هز بلطف على RT.
  7. غسل العينات في 2-3 التغيرات في الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما. تخزين العينات في 70٪ من الإيثانول.

5. إزالة التعصيب الجراحي

  1. تخدير الحيوان كما في الخطوة 2.2 وحلق جلد ظهري بأكمله.
  2. اعداد منطقة الجراحية سو الجلد مرة أخرى باستخدام Betadine ومناديل الكحول، وتغطية حيوان مع ثنى الجراحية المعقمة (لأغراض العرض التوضيحي، تم حذف ثنى العقيمة لزيادة وضوح). إبقاء الحارة الحيوان باستخدام وسادة التدفئة في حين تعمل في منطقة العمليات الجراحية العقيم.
  3. إجراء شق باستخدام معقم # 11 مشرط على طول خط الوسط الظهرية من قاعدة العنق إلى ما يقرب من 0.5 سم فوق الذيل.
  4. باستخدام الملقط حادة، تعكس بلطف الجلد على الجهة اليسرى من الجهة تصور الأنسجة الكامنة من منصات كتفي الدهون بالقرب من العنق إلى ما فوق أطرافه الخلفية.
    ملاحظة: الأعصاب الجلدية ظهري تظهر خيوط كما البيضاء التي يسافر caudally خلال لفافة شفافة الجدار جذع قبل اتخاذ الانحناءات الحادة ودخول النسيج الضام فضفاضة تحت الجلد (الشكل 2).
  5. باستخدام ملقط غاية في الدقة تحت المجهر تشريح ضوء، وإزالة الأعصاب حصرا من الجانب الأيسر من أنيمال تقع في مواقع تشريحية T3-12 به يقطف من حيث منعطف قطاعات في الجدار الجذع إلى مواقع دخولها في الجلد (الشكل 2).
    1. ملقط توجيه عموديا وإزالة الأعصاب من خلال استيعاب حوالي 0.5 سم تحت مواقع ينحني وسحب صعودا، مما تسبب في العصب على التمدد ومنفصلة عن الأنسجة المحيطة بها (الشكل 2C - E). كن حذرا لتجنب تمزق الأوعية الدموية المجاورة.
    2. تستمر حتى تتم إزالة كافة الأعصاب التي تمتد من الجدار جذع على الجلد. لا تعطيل الأعصاب داخل لفافة كثيفة من الجدار الجذع. الحفاظ على الأنسجة الرطبة في جميع أنحاء الداخلي من خلال تطبيق دوري قطرات من معقم 0.9٪ محلول ملحي.
    3. بدلا من ذلك، إزالة الأعصاب عن طريق الامساك غاياتهم القريبة بالقرب من الجدار الجذع مع ملقط والقص بالمقص الجميلة. بعد ذلك، قطع الاطراف البعيده بالقرب من الجلد (أرقام 2F - H). وأخيرا، وإزالة كثافة العملياتشرائح العصبية ervening (الشكل 2I).
  6. إزالة أي الأعصاب من رفرف الجلد المكشوف في الخطوة 5.4. تتكون هذه الألياف الفروع البعيدة للالأعصاب الجلدية ظهري ويبدو من مسارات المتفرعة الأبيض الموجود بشكل متقطع داخل النسيج الضام في الجانب الجلد رفرف الجلد (أرقام 2J - K).
    1. لإزالة هذه الفروع الجميلة، وضع ملقط غرامة توازي تقريبا على سطح الجلد، فهم الأعصاب ونتف صعودا إلى تجنب تعطيل الأوعية الدموية وثقب الجلد. يستمر إلى أن يتم نقل جميع الأعصاب واضحة.
  7. عن طريق تشريح حادة، يعكس الجلد في الجانب الأيمن من خط الوسط شق ظهري، ولكن لا تقم بإزالة الأعصاب. وهذا سيكون بمثابة سيطرة الشام التي تديرها المقابل.
  8. خياطة على طول خط الوسط الظهرية في نمط توقف بسيط لإغلاق الجرح. مراقبة الحيوان خلال فترة الانتعاش وبعد أوبراatively كما هو موضح سابقا (خطوات 2،8 حتي 10). إزالة الغرز في غضون 7-10 أيام بعد الجراحة.
  9. لتقييم وظيفيا مستقر إزالة التعصيب تصل إلى عدة أسابيع بعد الجراحة، وإزالة الشعر من الجلد الظهرية باستخدام المقص الكهربائي.
  10. وخز بلطف منطقة الجلد مزالة العصب باستخدام إبرة تحت الجلد، وملاحظة ما إذا كان الحيوان يستجيب، عادة عن طريق فزعا أو تحول رأسا على عقب. إذا كانت المنطقة الجلد وقد مزالة العصب مستقر، وسوف الحيوان تظهر استجابة ضئيلة أو معدومة.
  11. باستخدام علامة سوداء، الخطوط العريضة للمنطقة أي رد، فضلا عن مساحة مشابهة من حيث الحجم والموقع على الجانب المقابل صورية.
  12. جمع عينات من هذه المواقع كما في خطوات 2،1-2،9 لتحليلها.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، الظهرية الخلفي بأكمله الجلد، بما في ذلك المناطق مزالة العصب والشام التي تديرها، يمكن إزالة مثل ورقة واحدة لكامل جبل تلطيخ، على غرار كما هو موضح في الخطوة 4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عن طريق توليد الفئران معربا-تاموكسيفين محرض Gli1-CreERT2 وأليل مراسل LacZ، فمن الممكن تصور TD ظهائر وتتبع مصائر هذه الخلايا مع مرور الوقت. وعادة ما يمكن أن تكتمل إجراءات إزالة التعصيب كامل حدود 1 ساعة في الماوس، وينبغي أن يسبب الحد الأدنى من الضيق للحيوان.

وأشارت دراساتنا السابقة أن الأعصاب أساسية للمحافظة على كل من المواد الصلبة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأعصاب تخدم وظائف حاسمة ليس فقط في الإحساس، ولكن أيضا في تطوير الجهاز الثدييات، وصيانة وتجديد 13،24-27. كما تم مؤخرا تورط الأعصاب في الأمراض الجلدية المختلفة، والأساليب المذكورة هنا يمكن أن تستخدم لدراسة متطلبات تعصيب في مجموعة متنوعة من نماذج الأمراض الحيوانية. وفي الواقع، فإن تقنية إزالة التعصيب من جانب واحد يسمح للمقارنة مباشرة من الجلد مع أي أعصاب سليمة أو تعطلت من نفس الماوس. وهذا يوفر الرقابة الداخلية المثالية للتعويض عن الاختلافات الحيوان إلى الحيوان، مع تحليل ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا الخريف بيترسون على المساعدة في تصوير الفئران ، ودانيال ثورسن للمساعدة في الفئران ، والدكتورين نيكول وارد وعبد المجيد بلقاضي للمساعدة في إزالة التعصيب الجراحي. تم دعم هذه الدراسات بتمويل من المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد (منح R00AR059796 و R01AR065409). قسم الأمراض الجلدية بجامعة ميشيغان. برنامج علماء العلوم البيولوجية. مركز تكوين الأعضاء. مركز السرطان الشامل بجامعة ميشيغان. وصندوق جون إس وسوزان سي مون للسرطان. تم دعم SCP بتمويل من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (منحة T32 GM007315). تم دعم هذا العمل أيضا من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، ومركز أبحاث السرطان ، والمعهد الوطني للسرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ضمادات تحضير الكحولPDIB339
AnaSed (Xylazine)LloydNADA 139-236
الجسم المضاد ، المضاد للكيراتين 8دراسات تنموية بنك الورم الهجينTROMA-Iالجسم المضاد للفئران ، استخدم بتركيز 1: 500
الجسم المضاد ، المضاد للكيراتين 17إشارة الخلية# 4543الجسم المضاد للأرانب ، استخدم بتركيز 1: 1،000
الجسم المضاد ، المضادة للخيوط العصبيةإشاراتC28E10أجسام مضادة للأرانب ، استخدم بتركيز 1: 500
وسادات إعداد البيتادينميدلاينMDS093917
كاربروفين (ريماديل)Zoetis
ماكينة تشذيب لاسلكية قابلة لإعادة الشحنWahlموديل 8900
زيت الذرةSigma-AldrichC8267
CryostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306يستخدم بتركيز 1: 1،000
DeoxycholateSigma-AldrichD6750
كريم مزيل الشعرNairN / A
ثنائي ميثيل فوراميدسيجما ألدريتش319937
ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418
جلوتارالديهايدسيجما ألدريتشG5882
مختبرات ناقلاتالقلم ImmEdgeH-4000
الكيتامين هيدروكلوريكHospiraNDC 0409-2051-05
كلوريد المغنيسيومSigmaM8266
زجاج الغطاء الصغيرVWR48404-454
الشرائح الدقيقةVWR48311-703
10٪ خيوط نايلون فورمالين مخزنةمحايدة BDH0502-4LP
6-0 خيوط نايلونDemeTECHNL166012F4P
أوكتيل فينيل بولي إيثيلين جلايكولسيجما ألدريتشI8896
OCT مركبساكورا الأنسجة - تيك4583
بارافورمالديهايدسيجما ألدريتش158127
بوتاسيوم فيروسيانيدسيجما ألدريتشP9387
بوتاسيوم فيريسيانيدسيجما ألدريتش702587
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشP9791
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشS5136
السكروزسيجما ألدريتش84097
تاموكسيفينسيجما ألدريتشT5648-1G
ملقط فائق الدقةDumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001يذوب في ثنائي ميثيل فوراميد لإنشاء مخزون 50x قبل الاستخدام
الخلية ثنائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361(2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115(2014).
  3. Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
  4. Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
  5. Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
  6. Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
  7. Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
  8. Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
  9. Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
  10. Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
  11. Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
  12. Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
  13. Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
  14. Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
  15. Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
  16. Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
  17. Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
  18. Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
  19. Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
  20. English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
  21. Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
  22. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
  23. Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
  24. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
  25. Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
  26. Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
  27. Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
  28. Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
  29. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cutaneous Surgical DenervationMouse Skin DiseaseTouch Dome MorphologyDorsal Cutaneous NerveWhole Mount StainingGenetic LabelingSham Operated ControlHistological Section AnalysisHedgehog SignalingMerkel Cells

مقالات ذات صلة