يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العلاج الجيني الفيروسة الغدانية لمرضى السكري اعتلال القرنية: التأثيرات على شفاء الجروح ووقف علامة الخلية التعبير في الإنسان القرنيات الجهاز مثقف والخلايا الظهارية الحوفي

8.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54058

⸱

أبريل 7, 2016

 ,  , 
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم مثال على العلاج الجيني للفيروسات الغدية في القرنيات البشرية المزروعة بالأعضاء المصابة بالسكري نحو تطبيع التئام الجروح المتأخر وتقليل تعبير علامات الخلايا الجذعية الظهارية بشكل ملحوظ في هذه القرنيات. كما يصف تحسين هذه العملية في الثقافات الظهارية القزحية المخصبة بالخلايا الجذعية.

الملخص

والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف التعديلات الجزيئية في القرنيات لمرضى السكري الإنسان وإظهار كيف يمكن تخفيفها عن طريق العلاج الجيني الفيروسة الغدانية في قرنية العين-الجهاز مثقف. مرض القرنية السكري هو من مضاعفات مرض السكري مع تشوهات المتكررة للأعصاب القرنية والتئام الجروح الظهارية. لقد وثقت أيضا التعبير تغيير كبير العديد من علامات الخلايا الجذعية الظهارية المفترضة في القرنيات لمرضى السكري الإنسان. للتخفيف من حدة هذه التغييرات، تم تنفيذ العلاج الجيني الفيروسة الغدانية بنجاح باستخدام upregulation للتعبير عن بروتو الجين الورمي-التقى ج و / أو downregulation من proteinases مصفوفة الفلزي 10 (MMP-10) وكاثبسين واو هذا العلاج تسارع التئام الجروح في القرنيات لمرضى السكري حتى عندما كان transduced مقصورة الخلايا الجذعية الحوفي فقط. تم الحصول على أفضل النتائج مع العلاج جنبا إلى جنب. لاحتمال زرع المريض من الخلايا الجذعية طبيعية، ويقدم مثالا أيضا من optimizatiعلى تنبيغ الجينات في الثقافات التخصيب الخلايا الجذعية باستخدام القدرة polycationic. قد يكون هذا النهج مفيدا ليس فقط للجينات منتقاة ولكن أيضا لغيرها من الوسطاء من القرنية التئام الجروح الظهارية وتنبع وظيفة الخلية.

المقدمة

مرض القرنية السكري النتائج بشكل رئيسي في الظهارية التنكسية (القرنية) وعصب التغييرات (الاعتلال العصبي). وغالبا ما يتجلى ذلك من تشوهات التئام الجروح الظهارية والحد من العصبية القرنية 1-4. ما يقدر ب 60-70٪ مرضى السكري لديهم مختلف مشاكل القرنية 1،3. وقد حددت الدراسات لدينا العديد من البروتينات علامة مع التعبير تغير في القرنيات لمرضى السكري الإنسان بما في ذلك downregulation من-التقى ج بروتو الجين الورمي (نمو خلايا الكبد مستقبلات عامل) وupregulation من مصفوفة الفلزي 10 (MMP-10) وكاثبسين F 5، 6. لقد وثقت بشكل ملحوظ انخفض تعبير عن العديد من علامات الخلايا الجذعية الظهارية المفترضة في القرنيات لمرضى السكري الإنسان.

في الدراسات السابقة قمنا بتطوير العلاج الجيني المعتمد الفيروسة الغدانية لتطبيع مستويات من علامات المعدلة والسكري باستخدام السكري نظام الجهاز ثقافة القرنية البشرية، مما يدل على بطء التئام الجروح، السكريالتغييرات علامة، والخلايا الجذعية علامة تخفيض تعبير مشابه إلى خارج الجسم الحي القرنيات 7،8. ويبدو أن هذا استمرار التغييرات أن ذلك يعود إلى وجود ذاكرة الأيض جينية 9. وكان هذا النظام الثقافة اكثر ما يستخدم للعلاج بالجينات. وقد تم اختيار الأهداف لهذا العلاج من علامات مع أي انخفاض التعبير في القرنيات السكري (ج التقى بروتو الجين الورمي)، أو زيادة التعبير (MMP-10 و F كاثبسين).

تم استخدام الفيروسة الغدانية (AV) العلاج في قرنية العين-الجهاز مثقف كلها أو مقصورة الحوفي الطرفية القرنية والصلبة فقط. هذه المقصورة تؤوي الخلايا الجذعية الظهارية أن تجديد ظهارة القرنية والمشاركة بنشاط في التئام الجروح 4،10-15. هنا، يتم توفير بروتوكولات للثقافة الطبيعية لمرضى السكري البشرية القرنية الجهاز، التئام الجروح الظهارية، والعزلة وتوصيف الجذعية مزارع الخلايا الحوفي التخصيب خلية، والخلية الفيروسة الغدانية والتنبيغ القرنية. لناوأظهرت النتائج جدوى هذا العلاج لتطبيع التعبير علامة والتئام الجروح في القرنيات لمرضى السكري لزرع محتمل في المستقبل. كما أنها تشير إلى أن الجمع بين العلاج هو الوسيلة الأكثر فاعلية لاستعادة نمط علامة الطبيعي والشفاء الظهارية في القرنية لمرضى السكري 16-18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

مرض الوطنية تبادل البحوث (ندري، فيلادلفيا، PA) المرفق وافق بعد الوفاة صحية لمرضى السكري والعين البشرية والقرنيات. الموافقة بروتوكول جمع الأنسجة البشرية ندري من قبل لجنة إدارية وتخضع لالمعاهد الوطنية للرقابة الصحية. وقد أجريت هذه الدراسة في إطار المركز الطبي مجلس المراجعة المعتمدة سيناي المؤسسية (IRB) بروتوكول إعفاء EX-1055. التعاون الجراحين القرنية، د. E. Maguen وY. رابينوفيتش، زودت الحافات القرنية والصلبة عن تجاهل لعزل الجذعية الثقافات الظهارية القرنية التخصيب الخلية. وقد أجريت هذه الدراسة في إطار البروتوكول العائد المحلي وافق Pro00019393.

1. الإنسان القرنية ثقافة الجهاز

ملاحظة: يتم استلام القرنيات الطبيعية لمرضى السكري أو العينين كلها في وسائط تخزين القرنية المبردة (على سبيل المثال، Optisol ع) في غضون 48 ساعة بعد الموت من المورد الوطني ندري.

  1. إزالة القرنيات من حاوية تخزين مع ملقط وغسلها مرتين طن (ابام) خليط من المضادات الحيوية مضاد فطري. في حالة من العيون كلها، وقطع القرنيات الخروج من الكرات مع مقص منحني. ترك ما لا يقل عن حافة الملتحمة 5 ملم وأيضا غسل القرنيات في ابام.
  2. إعداد هذا المزيج على وضعها في تقعر القرنية. وهو يتألف من المصل خالية الأساسية الدنيا والمتوسطة (MEM) التي تحتوي على ابام، 1 ملغ / مل العجل الجلد الكولاجين (مصنوعة من محلول المخزون من 10 ملغ / مل في حمض 0.1 N الخليك)، 1٪ أجار، والانسولين ترانسفيرين-سيلينات تكملة 7.
  3. الميكروويف هذا الخليط ليغلي لمدة التعقيم وحل أجار. قد يستغرق ما يصل إلى 1 دقيقة في كل شيء إلى حل. ترك غطاء أنبوب مفتوحة جزئيا لأن خليط تجاوزات بسهولة عندما يغلي. لهذا السبب، قد تكون هناك حاجة إلى عدة دورات المغلي، كل لمدة 10-15 ثانية. يبرد الخليط إلى 37-39 درجة مئوية.
  4. وضع القرنيات الجانب الظهارية عليها في العقيمة 60 ملم الأطباق. ملء تقعر القرنية مع ما يقرب من 0.5 مل من الخليط وصفها في 1.2. الخليط يتصلب على القرنيات داخل 2 دقيقة.
  5. وضع القرنيات الجانب آغار أسفل في أطباق العقيمة 60 ملم وإضافة المتوسطة كامل يحتوي على MEM مع ابام، والانسولين ترانسفيرين-سيلينات ملحق 7 (37 ° C) للحفاظ على مستواه تقريبا في حوف للثقافة واجهة الهواء السائل. حجم المتوسط ​​هو 7-8 مل لكل طبق.
  6. ضع الأطباق مع القرنيات إلى 5٪ CO 2 حاضنة مرطب مع وعاء الماء (بهذه الطريقة، يتم الاحتفاظ مستوى الرطوبة عند أو فوق 95٪) عند 35 درجة مئوية (درجة الحرارة العادية القرنية). إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة (نقطتين) يوميا على البشرة لترطيب القرنية.
  7. مراقبة التشكل القرنية وبقاء الخلية الظهارية مجهريا تحت الضوء المرسل باستخدام المجهر معيار مع الهدف 4X. القيام بذلك مرة واحدة في اليوم.
  8. تغيير المتوسط ​​كل ثلاثة أيام. يمكن القرنيات يكون مثقف لمدة ثلاثة أسابيع على الأقل. للتجارب العلاج الجيني، والثقافة القرنيات لمدة 3-5 أيام، ثم transducه مع جينات الفائدة (4،1-4،4)، يترك لمدة 3-5 أيام آخر اعتمادا على التحوير وتخضع لبروتوكول التئام الجروح (2،1-2،4).

2. شفاء الجروح طلائي

ملاحظة: في القرنيات لمرضى السكري، والتنضير الظهارية عن طريق كشط لالميكانيكي ليس ممكنا لأن فصل الغشاء القاعدي الظهارية الهش في هذه العملية، وهو ما لا يحدث في القرنيات الطبيعية. وبالتالي، للحفاظ على القرنيات الطبيعية لمرضى السكري في ظل ظروف مماثلة من التئام الجروح، ويستخدم لإزالة الكيميائي للظهارة مع ن heptanol 19. هذا الإجراء يزيل الظهارة ولكن يترك خلف الغشاء القاعدي سليمة في كل من القرنيات الطبيعية لمرضى السكري.

  1. لأداء المركزي الظهارية التنضير 20، وضع 5 مم القرص ورق الترشيح غارقة في ن heptanol على السطح الأمامي القرنية المركزي لمدة 75 ثانية.
  2. إزالة عامل التصفية وغسل القرنيات في المتوسط ​​الكامل. ملء التقعر مع 0.5 مل أجار الكولاجينخليط والثقافة كما في 1.4. بعد التنضير، والخلايا الظهارية عادة ما تموت وتنصل من مخلفين وراءهم الغشاء القاعدي سليمة مجهريا 7.
  3. استخدام 8.5 مم أقراص لخلق الجروح الظهارية أكبر في التجارب مع العلاج الجيني الحوفي الوحيد. وهذا يضمن إشراك الخلايا الجذعية الحوفي في عملية الشفاء.
  4. مراقبة شفاء القرنية مجهريا. جعل الصور في 4X و10X كل يوم حتى تشفى الخلل الظهارية تماما. عملية الشفاء يمكن أن يستغرق 2-15 يوما حسب الدولة (عادي أو السكري) وحجم الجرح.
    ملاحظة: أثناء عملية الشفاء، ويلاحظ السوداء خلايا تشبه العنكبوت في طائرة التنسيق العليا. هذه الخلايا هي keratocytes انسجة أفكارك الذي مات بعد إزالة الظهارية 4. يتم تحديد الشفاء لتكون كاملة عندما تكون هذه الخلايا الميتة هي متضخمة من ظهارة الشفاء ولم تعد مرئية (الشكل 2، الشكل).
  5. بعد الشفاءالانتهاء، وقطع القرنيات في النصف تضمينها في أكتوبر مركب وعملية المناعي غير المباشر على أقسام ناظم البرد أو البقع الغربية 16،21.

3. عزل الخلايا الحوفي وصيانة الجذعية الثقافات التخصيب خلية

ملاحظة: إعداد الحوفي الخلية الأولية الظهارية الجذعية (LESC) الثقافات -enriched من الحافات القرنية والصلبة. الحافات القادمة من المتبرعين الأصحاء والتخلص منها بعد تلقي عمليات زرع القرنية من الجراحين التعاون في وسائط تخزين القرنية القياسية (على سبيل المثال، Optisol). خلاف ذلك، يمكن الحصول على الثقافات التخصيب LESC من الحافات رفعه من القرنيات كلها الطبيعية لمرضى السكري أو الكرات التي وردت من ندري في وسائط تخزين القرنية.

  1. إذا تم استخدام القرنيات كلها أو الكرات، أولا عزل المناطق الحوفي. للقيام بذلك، ضع القرنية على طبق من البلاستيك العقيمة مع الجانب الظهارية صعودا وإزالة المنطقة الوسطى مع منقب 9 ملم (التعميم سكين القرنية).تجاهل هذا الجزء المركزي. ثم استئصال منطقة الحوفي باستخدام منقب 13 مم وتجاهل الجزء الملتحمة الخارجي. لعزل الخلايا تستخدم حافة الحوفي مثل الخبز. قبل عزل الخلايا، وإزالة الخلايا البطانية والالتزام بقايا القزحية من الجانب الداخلي للقرنية مقابل ظهارة السطح مع مسحة القطن المعقم.
  2. عزل أوراق خلية الحوفي باستخدام العلاج dispase. احتضان كل حافة القرنية والصلبة مع 2.4 U / dispase مل الثاني في 1.5 مل القرنية المصل خالية المتوسطة (KSFM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة 22.
  3. تخفيف بلطف ورقة الحوفي الخلايا الظهارية قبالة حافة تشريح تحت المجهر ستيريو مع ملقط وفصل الخلايا في 1 مل من 0.25٪ التربسين - 0.02٪ محلول EDTA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسل الخلايا في 10 مل من المتوسط ​​(على سبيل المثال، Epilife) وبيليه لهم في 300 x ج في أعلى الجدول أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. عشر و resuspendخلايا الإلكترونية في مستنبت: متوسطة مع N2، B27 والمكملات نمو الخلايا الكيراتينية الإنسان، و 10 عاملا نانوغرام / مل نمو البشرة (EGF).
  6. البذور الخلايا في 3،000-5،000 خلية / مل في قوارير أو 60 ملم أطباق المغلفة مع خليط من البروتينات الغشاء القاعدي البشري بما في ذلك فبرونيكتين، النوع الرابع الكولاجين، و laminin (FCL)، في 0.5-1 ميكروغرام / سم 2، في KSFM متوسط.
  7. ثقافة الخلايا في ترطيب (95٪ أو أعلى نسبة الرطوبة) CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية حتى أنها تشكل الطبقات الوحيدة متموجة بشكل كامل. وهذا قد يستغرق 1-2 أسابيع.
    ملاحظة: تأكيد بانتظام هوية الخلية تلطيخ immunocytochemical إيجابي لعلامات LESC المفترضة بما في ذلك PAX6، الكيراتين (K) 14، K15، K17، وΔNp63α. وقد نشرت تفاصيل تلطيخ بما في ذلك الأجسام المضادة الأولية 8،16-18،22.
  8. لمرور الخلايا متموجة، تعاملهم مع حل 1 مل 0.05٪ التربسين (1: 5 التخفيف من الحل 0.25٪) لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 5 مل فول الصويا آرحل ypsin المانع (10 ملغ / مل) المخفف 1: 4 في المتوسط، وأجهزة الطرد المركزي الخلايا كما في 3.5.
  9. يغسل بيليه خلية في 3 مل من فول الصويا المخفف حل مثبط التربسين. لوحة الخلايا على FCL المغلفة (انظر 3.7) أطباق أو الشرائح غرفة زجاجية في 2 × 10 4 خلية / مل.

4. تنبيغ الفيروسة الغدانية من القرنيات-الجهاز مثقف

ملاحظة: الغدية المؤتلف (AV) وتشمل AV-ناقلات (أي الجينات إدخال)، AV-cmet (مع جين فتح إطار القراءة التقى ج)، AV-shM10 (مع shRNA إلى MMP-10)، و AV-shCF ( مع shRNA إلى كاثبسين F). هم حذف E3-E1 / 5 نوع AV التعبير عن الجينات تحت سيطرة المروج الفيروس المضخم للخلايا في وقت مبكر كبير على الفور. يتم إنشاء فيروسات-AV cmet باستخدام ناقل AV الوسادة / CMV / V5-DEST 16. يتم إنشاء الفيروسات AV-shRNA مخصصة عن طريق استنساخ فرعي من تسلسل shRNA جنبا إلى جنب مع HH1 المروج وGFP العلامة تسلسل من ناقلات iLenti-EGFP إلى هوما النسخ المتماثل غير كفء (-E1 / -E3)ن نوع AV 5 الجينوم باستخدام الغدة-4 نظام التعبير 17.

  1. تنبيغ واحد القرنية-عضو مثقف من كل زوج مع AV-النواقل والقرنية آخر، مع AV الجين التعبير عن تحوير. استخدام AV-cmet في ،8-1،25 × 10 8 وحدات تشكيل لوحة (PFU) في القرنية في مستنبت لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية حفظ القرنيات تحت سطح المتوسط ​​في كل بئر من صحن 24 أيضا. استخدام الفيروسات AV-shRNA في 1-2 × 10 8 PFU في القرنية.
  2. استخدام الفيروسات لالتنبيغ في المتوسط ​​الكامل تستكمل مع 75 ميكروغرام / مل سترات السيلدينافيل. هذا كاشف ينشط النقل caveolin تسهيل امتصاص الفيروسي من الخلايا الظهارية 21. نظرا لنصف عمر قصير من فياغرا في المحاليل المائية، وإعادة إضافة نفس المبلغ إلى متوسطة 5/4 ساعة في وقت لاحق. العلاج القياسي هو لمدة 48 ساعة.
  3. نقل القرنيات لأطباق جديدة مع نهاية ملعقة العقيمة المستديرة والثقافة في وسيط وبدون AV الحفاظ على مستوى متوسط ​​في حوف. بعد الوظيفةitional 4-8 أيام في واجهة السائل الهواء، عملية القرنيات المعالجة AV لتحليلات مختلفة أو اختبار لالتئام الجروح الظهارية (انظر أعلاه). بشكل روتيني ترطيب القرنية خلال ثقافة بإضافة 100 ميكرولتر المتوسطة (نقطتين) على الجزء العلوي من القرنية.
  4. لتنبيغ من الخلايا الحوفي فقط، واحتضان الفيروسات مع القرنيات في واجهة الهواء السائل مع مستوى متوسط ​​في حوف، لتجنب تنبيغ ظهارة المركزية.

5. تنبيغ الفيروسة الغدانية من الخلايا مثقف الحوفي

  1. الحفاظ على الثقافات المخصب LESC في المتوسط ​​مع 10 نانوغرام / مل EGF (انظر 3.5) على الأطباق البلاستيكية المغلفة مع الخليط FCL عند 0.5 ميكروغرام / سم 2.
  2. تنبيغ الخلايا المستزرعة التي وصلت إلى 70-80٪ confluency مع AV إيواء الأخضر الفلورسنت جين البروتين (AV-GFP) أو shRNA-GFP في مجموعة من تعدد العدوى سارعت AV (وزارة الداخلية: 1-300 PFU / خلية) في المتوسط ​​مع 2 نانوغرام / مل EGF. أداء transductioن لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية في حجم الحد الأدنى (0.2 مل)، يليه 20 ساعة في 0.5 مل المتوسطة. ليست هناك حاجة للcaveolin فياغرا المنشط النقل لتنبيغ ثقافة الخلية.
  3. استخدام واحدة من الكواشف التالية التي تسهل AV ملزمة لسطح الخلية لتعزيز كفاءة AV التنبيغ: إما polycations (1 ميكروغرام / مل بولي-L-يسين أو 5 ميكروغرام / polybrene مل)، أو 6 ميكرولتر / مل التنبيغ الكاشف ( على سبيل المثال، ViraDuctin)، أو 20 ميكرولتر / مل محسن التنبيغ (على سبيل المثال، ibiBoost).
  4. بعد استبدال المتوسطة لواحد من دون مركبات، واحتضان الخلايا المزروعة لمدة 4 أيام، في ترطيب CO 2 الحاضنة وتقييم مستوى التعبير GFP باستخدام المجهر الفلورسنت المقلوب.
  5. استخدام الصفر التئام الجروح فحص لتقييم هجرة الخلايا في الثقافات transduced AV. تنمو الخلايا في الشرائح غرفة multiwell. جعل الجروح في أحادي الطبقة التي كتبها خدش الخلايا في الحركة الخطية على التوالي مع بي 200 ميكرولترpette طرف. بعد اصابة، تغيير المتوسطة للحصول على واحدة جديدة لإزالة خلايا منفصلة.
  6. تصوير الجروح كل يوم مع كاميرا رقمية تعلق على مجهر مقلوب في التكبير 4X. تسجيل الوقت الذي يكون فيه الشفاء الكامل (حواف الجرح تتلامس على طول الجرح بأكمله).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لقد أظهرنا سابقا أن في الثقافات الجهاز القرنية، والحفاظ على الاختلافات في التعبير عن علامات السكري (على سبيل المثال، بروتينات الغشاء القاعدي وα3β1 إنتغرين) والتئام الجروح بين القرنيات الطبيعية لمرضى السكري. تعرض هذا النظام الثقافة إلى العلاج الجيني التي تهدف إلى تطبيع مستويات من علامات المعدلة ومرض السكري، ج-MET، MMP-10، وكاثبسين F.

عندما ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تظهر القرنية لتكون الأنسجة مثالية للعلاج الجيني نظرا لموقعها سطحه حيث توصيل الجينات، وكذلك تقييم فعالية والآثار الجانبية، من السهل. ومع ذلك، فإن الترجمة السريرية لهذا النهج قوية لا تزال بطيئة بسبب المعلومات الشحيحة على الأسباب الوراثية لأمراض القرنية وأهداف العلاج الجيني 24. مضاعفات السكري بما في ذلك التعديلات القرنية قد تكون جينية إلى حد كبير في الطبيعة، وهو ما يترجم إلى ذاكرة التمثيل الغذائي 9. لهذا السبب، فإن الأنسجة السكري والخلايا الحفاظ على تشوهات من

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية.

شكر وتقدير

نعرب عن امتناننا للدعم المالي من قبل NIH / NEI R01 EY13431 (AVL) ، ومنحة CTSI UL 1RR033176 (AVL) ، والمنح المقدمة من معهد الطب التجديدي ، مركز Cedars-Cedars الطبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الحد الأدنى من الوسط الأساسيThermo Fisher Scientific11095-080
Optisol-GS   ؛Bausch & أمبير Lomb50006-OPT
ABAM خليط المضادات الحيوية والمضادة للفطرياتThermo Fisher Scientific15240062
كولاجين جلد العجل  سيجما ألدريتش C9791
أجار ، درجة زراعة الأنسجةSigma-Aldrich   ؛A1296
n-heptanolSigma-Aldrich 72954-5ML-F
O.C.T. مركب VWR الدولية25608-930
Dispase II روش للعلوم التطبيقية4942078001
وسيط خال من مصل الخلايا الكيراتينية (KSFM)  Thermo Fisher Scientific17005042
EpiLife الوسط مع الكالسيومThermo Fisher ScientificMEPI500CA
N2 مكمل متوسط ، 100xThermo Fisher Scientific17502-048
B27 مكمل متوسط ، 50xThermo Fisher Scientific17504-044
مكمل نمو الخلايا الكيراتينية البشرية ، 100xThermo Fisher ScientificS-001-5
التربسين 0.25٪ - EDTA 0.02٪ مع الفينول الأحمرثيرمو فيشر العلمي25200056
التربسين 0.25٪ مع الفينول الأحمرثيرمو فيشر العلمي15050065
مثبط التربسين فول الصويا سيجما ألدريتش T6414
مصل الأبقار الجنينThermo Fisher Scientific26140079
مكمل الأنسولين ترانسفيرين السيلينيت (ITS)سيجما ألدريتش   ؛I3146-5ML
الجسم المضاد للكيراتين 14سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-53253
الجسم المضاد للكيراتين 15سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-47697
الجسم المضاد للكيراتين 17سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-58726
الجسم المضاد ل & دلتا; Np63 &alpha ؛سانتا كروز بيوتكنولوجيSC-8609
الجسم المضاد ل PAX6BioLegendPRB-278P-100
للنيدوجين-1R & D أنظمةMAB2570
الجسم المضاد للإنتجرين & ألفا; 3 وبيتا. 1EMD MilliporeMAB1992
فيبرونيكتين البشريBD Biosciences354008
لامينين بشريسيجما ألدريتش & nbsp ؛L4445
النوع البشري IV الكولاجينSigma-Aldrich  C6745-1ML
الفيروس الغدي الذي يعبر عن MMP-10 shRNACapital BioSciences
من الفيروس الغدي الذي يعبر عن القسطرة F shRNACapital BioSciencesالمصنوع خصيصا
عن الفيروس الغدي المصنوع خصيصا الذي يعبر عن shRNA المخفوق و GFPCapital BioSciencesالمصنوع
من الفيروس الغدي الذي يعبر عن c-metOriGene (البلازميد)SC323278
الفيروس الغدي الذي يعبر عن GFPKeraFASTFVQ002
سيترات السيلدينافيل ، 25 مجمفايزرالصيدلاني
  ؛PHG0311Thermo Fisher Scientific
Poly-L-lysineSigma-Aldrich  P4707
بوليبرينسيجما ألدريتش   ؛107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoostibidi ، ألمانيا50301
محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) ThermoFisher Scientific10010049
Corning ملعقة نهاية مستديرة   ؛داو كورنينج3005
60 مم أطباق بتريThermo Fisher Scientific174888
Nunc Lab-Tek II شرائح غرفة متعددة الآبار  سيجما ألدريتشC6807
200 & ل نصائح الماصةBioexpressP-1233-200الموردين الآخرين المتاحة
المجهر المقلوب   ؛نيكونديافوتالموردين/النماذج الأخرى المتاحة
CO2 حاضنة  ثيرمو فيشر العلمية370 (Steri-Cycle)الموردين / النماذج الأخرى المتاحة
المجهر الفلوريأوليمبوس, اليابانBX-40الموردين / نماذج الأخرى المتاحة
تشريح مجهر ستيريولايكا ، ألمانياS4 Eالموردين / النماذج الأخرى المتاحة
المصنوع خصيصا خصيصا من عامل نمو البشرة

المراجع

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425(2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الجين الورمي الأولي c-metتثبيط MMP-10تثبيط كاتيبسين Fالمعززات متعددة الكاتيونات
العلاج الجيني الفيروسة الغدانية لمرضى السكري اعتلال القرنية: التأثيرات على شفاء الجروح ووقف علامة الخلية التعبير في الإنسان القرنيات الجهاز مثقف والخلايا الظهارية الحوفي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.