متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية

ملخص

يقدم هذا العمل طريقة للفحص عالي الإنتاجية باستخدام نظام فحص إنزيم جيني عالمي يمكن تطبيقه نظريا على أكثر من 200 إنزيم. هنا ، يحدد نظام الفحص الفردي ثلاثة إنزيمات مختلفة (الليباز ، السليلوز ، والفوسفاتيز القلوي) ببساطة عن طريق تغيير الركيزة المستخدمة (أسيتات p-nitrophenyl ، p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ، وفوسفات فينيل).

الملخص

يتيح التطوير الأخير لتقنية فحص الخلية المفردة عالية الإنتاجية فحص الإنزيمات الجديدة بناء على الأنشطة الوظيفية من مكتبة ميتاجينومية واسعة النطاق¹. اقترحنا سابقا نظام فحص الإنزيم الجيني (GESS) الذي يستخدم منظم ثنائي ميثيل فينول الذي يتم تنشيطه بواسطة الفينول أو p-nitrophenol. نظرا لأن كمية هائلة من التفاعلات الأنزيمية الطبيعية تنتج هذه المركبات الفينولية من ركائز مشتقة من الفينول ، يمكن تطبيق نظام الفحص الجيني الفردي هذا نظريا لفحص أكثر من 200 إنزيم مختلف في قاعدة بيانات BRENDA. على الرغم من قابلية التطبيق العام ل GESS ، فإن تطبيق عملية الفحص يتطلب إجراء محددا للوصول إلى أقصى إشارات قياس التدفق الخلوي. هنا ، نقوم بتفصيل عملية الفحص المطورة ، والتي تتضمن المعالجة المسبقة للميتاجينوم باستخدام GESS وتشغيل فارز قياس التدفق الخلوي. تم استخدام ثلاث ركائز فينولية مختلفة (أسيتات p-nitrophenyl ، p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ، وفوسفات فينيل) مع GESS لفحص وتحديد ثلاثة إنزيمات مختلفة (الليباز ، السليلاز ، والفوسفاتيز القلوي) ، على التوالي. تم تأكيد أنشطة الإنزيم الميتاجينومي المختارة فقط من خلال قياس التدفق الخلوي ولكن يمكن استخدام تسلسل الحمض النووي والتحليل المختبري المتنوع لمزيد من تحديد الجينات.

المقدمة

والإنتاجية العالية التقنية وحيدة الخلية فحص وضعت مؤخرا تسمح أنزيمات جديدة ليتم فرزهم من مكتبة الوراثية على نطاق واسع على أساس الأنشطة الوظيفية ^1. على مستوى خلية واحدة، ويعمل البروتينات التي تنظم النسخ لتحريك التعبير الجيني مراسل بواسطة الاستشعار عن بعد الجزيئات الصغيرة التي تنتج نتيجة لنشاط إنزيم الهدف. تشارك نهج واحد في وقت مبكر من العزلة من الاوبرون الفينول مهينة من رالستونيا eutropha E2 باستخدام التعبير الجيني الناجم عن الركيزة فحص (SIGEX) الأسلوب، الذي الركيزة أن تتجسد في التعبير عن بروتين مراسل ^2. وقد استخدم نهار الزائفة الكريهة لتحديد البنزالدهايد نازعة ^3، وLysG من ال....

البروتوكول

1. إعداد مكتبة Metagenomic مع PNP-GESS

1. بناء مكتبة metagenomic في E. القولونية مع ناقل فوزميد باستخدام طقم إنتاج مكتبة فوزميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ^5.
2. قسامة 100 ميكرولتر من مكتبة لتخزين في -70 درجة مئوية، وهو مصدر للخلايا مكتبة metagenomic.
   ملاحظة: الكثافة الضوئية لعينة تقاس بطول موجي 600 نانومتر (OD ₆₀₀₎ من هذا المخزون مكتبة ما يقرب من 100.
3. ذوبان الجليد 100 ميكرولتر من رصيد المكتبة metagenomic ع....

النتائج

تم فحص ركائز الفينولية ثلاثة لتحديد الانزيمات metagenomic جديدة من مكتبة metagenome من رواسب مسطحة المحيط المد والجزر في تيآن، كوريا الجنوبية باتباع البروتوكول المقترح. لبناء مكتبة، ومتوسط ​​30 - تم إدراج تسلسل metagenome 40 كيلوبايت في fosmids، والتي تقوم على E. القولونية F عامل ريبليكون وكما عرضت نسخة واحدة في الخلية. لاحظ أن fosmids وقد استخدمت على نطاق واسع لبناء مكتبات الجينوم معقدة بسبب انتشار مستقر لها ^8.

المناقشة

زيادة كفاءة إنتاج البيولوجية الحفازة هو المفتاح لنجاح الحيوية والكيميائية القائمة على الصناعة ⁹ و metagenome يعتبر واحدا من أفضل مصدر الانزيم الطبيعي. في هذا المعنى، لا بد من فحص أنزيمات جديدة من metagenome حيث لم تستكشف أغلبية الموارد الوراثية ^10. وقد وضعت عدة طرق الفحص الذي كشف عن مباشرة انزيم المنتجات باستخدام منشطات النسخ ^{11 و 12} ولكن هذه التقنيات تتطلب نظام النسخي-الأيض استجابة محددة. من ناحية أخرى، GESS ينطبق على نطاق واسع اعتمادا على استخدام.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
CopyControl	Epicenter	CCFOS110	Fosmid Library Production Kit
حل الحث CopyControl	مركز	CCIS125	Fosmid محلول تحريض نسخ
EPI300	خلية الكفاءة	EC300110 الكهربائية
pCC1FOS	مركز	CCFOS110	Fosmid ناقلات
الناقل الجيني Mxcell	Bio-Rad		كوفيت كهربائي ونظام التثقيب الكهربائي
FACSAria III	Becton Dickinson		التدفق الخلوي (آلة FACS)مجهر
نيكون		AZ100M
UltraSlim	مايستروجين		LED المضيء
50 مل أنبوب مخروطي	BD Falcon
14 مل أنبوب دائري القاع	BD Falcon
أنبوب دائري القاع سعة 5 مل	BD Falcon
p < / em > -nitrophenyl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
< em > p < / em > nitrophenyl & beta ؛ -D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p< / em>-nitrophenyl butylate	Sigma-Aldrich	N9876 & نب سب.	الركيزه
لوريا بيرتاني (LB)	BD Difco	244620	التربتون 10 جم / لتر ، مستخلص الخميرة 5 جم / لتر ، كلوريد الصوديوم 10 جم / لتر
مرق سوبر أوتمال (SOB) BD	Difco	244310	التربتون 20 جم / لتر ، مستخلص الخميرة 5 جم / لتر ، كلوريد الصوديوم 0.5 جم / لتر ، كبريتات المغنيسيوم 2.4 جم / لتر ، كلوريد البوتاسيوم 186 مجم / لتر
مرق فائق الأمثل مع قمع الكاتابوليت (SOC)		SOB ، 0.4٪ جلوكوز
2x مستخلص الخميرة التربتون (2xYT)	BD Difco	244020	هضم البنكرياس للكازين 16 جم / لتر ، مستخلص الخميرة 10 جم / لتر ، مستخلص الخميرة 5 جم / لتر
وسائط			2x مرق YT ، 15٪ جلسرين ، 2٪ جلوكوز
pGESS (E135K)			ناقل الحمض النووي يحتوي على dmpR ، جينات egfp مع محفزاتها المناسبة ، RBS ، و terminator. انظر المرجع 5 في المخطوطة ل المزيد من التفاصيل.
Chloramphenicol	Sigma	C0378
Ampicillin	Sigma	A9518
BD FACSبرنامج	Becton Dickinson		الإصدار 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8٪ كلوريد الصوديوم ، 0.02٪ KCl ، 0.0144٪ Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، 0.024٪ KH2< / sub>OP4 ، < / sub> pH 7.4

قياس تخزين الخلايا قياس التدفق الخلوي Diva