Method Article

متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية

DOI:

10.3791/54059

⸱

August 8th, 2016

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology, Daejeon, South Korea

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا العمل طريقة للفحص عالي الإنتاجية باستخدام نظام فحص إنزيم جيني عالمي يمكن تطبيقه نظريا على أكثر من 200 إنزيم. هنا ، يحدد نظام الفحص الفردي ثلاثة إنزيمات مختلفة (الليباز ، السليلوز ، والفوسفاتيز القلوي) ببساطة عن طريق تغيير الركيزة المستخدمة (أسيتات p-nitrophenyl ، p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ، وفوسفات فينيل).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح التطوير الأخير لتقنية فحص الخلية المفردة عالية الإنتاجية فحص الإنزيمات الجديدة بناء على الأنشطة الوظيفية من مكتبة ميتاجينومية واسعة النطاق1. اقترحنا سابقا نظام فحص الإنزيم الجيني (GESS) الذي يستخدم منظم ثنائي ميثيل فينول الذي يتم تنشيطه بواسطة الفينول أو p-nitrophenol. نظرا لأن كمية هائلة من التفاعلات الأنزيمية الطبيعية تنتج هذه المركبات الفينولية من ركائز مشتقة من الفينول ، يمكن تطبيق نظام الفحص الجيني الفردي هذا نظريا لفحص أكثر من 200 إنزيم مختلف في قاعدة بيانات BRENDA. على الرغم من قابلية التطبيق العام ل GESS ، فإن تطبيق عملية الفحص يتطلب إجراء محددا للوصول إلى أقصى إشارات قياس التدفق الخلوي. هنا ، نقوم بتفصيل عملية الفحص المطورة ، والتي تتضمن المعالجة المسبقة للميتاجينوم باستخدام GESS وتشغيل فارز قياس التدفق الخلوي. تم استخدام ثلاث ركائز فينولية مختلفة (أسيتات p-nitrophenyl ، p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ، وفوسفات فينيل) مع GESS لفحص وتحديد ثلاثة إنزيمات مختلفة (الليباز ، السليلاز ، والفوسفاتيز القلوي) ، على التوالي. تم تأكيد أنشطة الإنزيم الميتاجينومي المختارة فقط من خلال قياس التدفق الخلوي ولكن يمكن استخدام تسلسل الحمض النووي والتحليل المختبري المتنوع لمزيد من تحديد الجينات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والإنتاجية العالية التقنية وحيدة الخلية فحص وضعت مؤخرا تسمح أنزيمات جديدة ليتم فرزهم من مكتبة الوراثية على نطاق واسع على أساس الأنشطة الوظيفية 1. على مستوى خلية واحدة، ويعمل البروتينات التي تنظم النسخ لتحريك التعبير الجيني مراسل بواسطة الاستشعار عن بعد الجزيئات الصغيرة التي تنتج نتيجة لنشاط إنزيم الهدف. تشارك نهج واحد في وقت مبكر من العزلة من الاوبرون الفينول مهينة من رالستونيا eutropha E2 باستخدام التعبير الجيني الناجم عن الركيزة فحص (SIGEX) الأسلوب، الذي الركيزة أن تتجسد في التعبير عن بروتين مراسل 2. وقد استخدم نهار الزائفة الكريهة لتحديد البنزالدهايد نازعة 3، وLysG من الوتدية glutamicum استخدمت لفحص عالية الإنتاجية من سلالة جديدة إنتاج L-يسين من المكتبات متحولة متنوعة (4).

سابقا، وهو screeni انزيم الوراثيةواقترح نظام نانوغرام (GESS) كمنبر الفحص المطبقة عموما 5. يستخدم هذا النظام dimethylphenol منظم-الاعتراف الفينول، دي إم بي آر، من P. الكريهة. دي إم بي آر (E135K)، ومتحولة من دي إم بي آر، ويمكن أيضا أن تستخدم في GESS (PNP-GESS) للكشف عن -nitrophenol ص (PNP). في وجود الانزيمات هدف إنتاج مركبات الفينول، GESS في E. خلايا القولونية تنبعث إشارة مضان، مما يتيح للعزلة السريع من الخلايا واحدة باستخدام فارز مضان تنشيط الخلايا (FACS). ولكن التعبير عن انزيم metagenomic يبدو أضعف من أن الإنزيمات المؤتلف التقليدية؛ وبالتالي، تم تصميم GESS للكشف عن المركبات الفينولية مع أقصى قدر من الحساسية من خلال التحقيق في مزيج من الموقع الريباسي ملزم (RBS) وتسلسل فاصل جنبا إلى جنب مع أفضل حالة التشغيل 5.

واحدة من المزايا الأساسية للGESS غير أن هذا الأسلوب واحد يسمح نظريا فحص اوفإيه من 200 أنواع مختلفة من الانزيمات في قاعدة البيانات بريندا (الجدول 1، HTTP: // www.brenda-enzymes.info، 2013،7) ببساطة عن طريق استخدام ركائز مختلفة. فقد تبين أن السيلولوز، والليباز، وباراثيون الميثيل هيدرولاز (ميلا في الساعة) ويمكن الكشف عن استخدام PNP-GESS مع ركائز المناسبة من ص الزبدات -nitrophenyl، ص -nitrophenyl-cellotrioside، وباراثيون الميثيل، على التوالي 5. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب)، التي تعد واحدة من الانزيمات الجديدة التي تم تحديدها باستخدام PNP-GESS، هو أول AP بالحرارة وجدت في metagenomes البحرية تكييفها بارد-6.

هنا، يتم تقديم تفاصيل عملية الفرز مع PNP-GESS الكشف عن أنشطة ثلاثة أنواع مختلفة من الليباز enzymes-، السيلولوز، والفوسفاتيز القلوية-وتحديد الانزيمات مرشح جديدة من مكتبة metagenomic 5،6 بسرعة. وتشمل عمليات تجهيزها metagenome مع PNP-GESS وتعمل على فلوريداآه الخلوي فارز. في حين أن الزيارات التي تم الحصول عليها سوف تحتاج إلى أن يكون متتابعا لمزيد من التحديد ويشمل هذا البروتوكول الإجراء وصولا إلى خطوات التأكيد نشاط انزيم باستخدام التدفق الخلوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد مكتبة Metagenomic مع PNP-GESS

  1. بناء مكتبة metagenomic في E. القولونية مع ناقل فوزميد باستخدام طقم إنتاج مكتبة فوزميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة 5.
  2. قسامة 100 ميكرولتر من مكتبة لتخزين في -70 درجة مئوية، وهو مصدر للخلايا مكتبة metagenomic.
    ملاحظة: الكثافة الضوئية لعينة تقاس بطول موجي 600 نانومتر (OD 600) من هذا المخزون مكتبة ما يقرب من 100.
  3. ذوبان الجليد 100 ميكرولتر من رصيد المكتبة metagenomic على الجليد وتطعيم في قارورة 500 مل تحتوي على 50 مل لوريا، Bertani (LB) و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول تليها 37 درجة مئوية الحضانة لمدة 2 ساعة.
  4. حصاد الخلايا في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. resuspend الكرية بسرعة في 50 مل من الماء الجليد الباردة المقطر (DW) وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية مرة أخرى.
  6. الدقةuspend بيليه في 50 ميكرولتر DW-الجليد الباردة مع 10٪ (ت / ت) الجلسرين. استخدام 50 ميكرولتر من هذه قسامة خلية ل electroporation.
  7. وضع خليط من خلايا electrocompetent 50 ميكرولتر وpGESS (E135K) 5 الحمض النووي (100ng) في كفيت Electroporation للالمثلج وelectroporate (1.8 كيلو فولت / سم، 25 μF) الخليط.
  8. بسرعة إضافة 1 مل سوبر مرق الأمثل مع مقيضة القمع (SOC) المتوسطة و resuspend الخلايا برفق.
  9. نقل الخلايا إلى أنبوب 14 مل جولة القاع باستخدام ماصة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  10. نشر 500 ميكرولتر من الخلايا تعافى على LB 20 × 20 سم لوحة مربعة تحتوي على 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول و 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
  11. تتخلص من المستعمرات باستخدام مكشطة الخلية وجمع الخلايا في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل باستخدام وسائط التخزين المحمولة الجليد الباردة.
  12. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. Resuspend وبيليه في 10 مل وسائط التخزين المحمولة المثلجمن أجل التوصل إلى OD 600 من 100.
  13. قسامة 20 ميكرولتر من الخلايا لتخزين في -70 درجة مئوية.

2. إزالة ايجابيات كاذبة من مكتبة Metagenomic

  1. ذوبان الجليد في الأوراق المالية خلايا مكتبة metagenomic (من الخطوة 1.13) التي تحتوي على metagenomic فوزميد الحمض النووي وpGESS (E135K) على الجليد.
  2. تطعيم 10 ميكرولتر من الخلايا في 2 مل LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 14 مل أنبوب جولة القاع. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة.
  3. وفي الوقت نفسه، بدوره على الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية وفتح البرنامج FACS الافتراضية. استخدام الإعدادات التالية: فوهة قطرها الحافة، 70 ميكرون. منطقة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) حساسية، 300 التضخيم الخامس لوغاريتمي. منطقة مبعثر الجانب (SSC-A) حساسية، 350 التضخيم الخامس لوغاريتمي. منطقة ثيوسيانات فلوريسئين (FITC-A) حساسية، 450 التضخيم الخامس لوغاريتمي. معلمة عتبة، FSC-A قيمة 5.
    ملاحظة: يتم إعطاء الإعدادات النموذجيةللجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية المذكورة في الجدول المواد. ضبط الإعدادات لأجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية الأخرى.
  4. تمييع الخلايا مكتبة metagenomic من الخطوة 2.2 عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من العينة لأنبوب أسفل مستديرة 5 مل تحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني.
  5. ضع عينة مكتبة المخفف على ميناء التحميل الصك FACS وانقر على زر تحميل على اقتناء لوحة من البرنامج نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  6. ضبط معدل الحدث 1000 - 1500 أحداث / ثانية عن طريق النقر والسيطرة على أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
  7. إنشاء سجل تحجيم FSC-A مقابل سجل تحجيم SSC-A مؤامرة مبعثر على ورقة عمل عالمية عن طريق النقر على زر مؤامرة نقطة في شريط الأدوات. ضبط بوابة مبعثر R1 لتشمل الأحداث القميص (السكان البكتيرية) باستخدام زر مضلع بوابة في شريط الأدوات.
  8. رسم بياني مع عدد خلايا مقابل سجل تحجيم FITC-A في ورقة العمل عن طريق النقر على زر الرسم البياني. ثم، وضبط الجهد FITC من Cytomeعلامة التبويب إعدادات ثالثا في إطار مراقبة المفتش بحيث ذروة التوزيع على شكل جرس أقل من 10 2 من FITC-A.
  9. إنشاء سجل تحجيم FSC-A مباراة. سجل FITC-A مؤامرة من خلال النقر على زر مؤامرة نقطة في ورقة العمل العالمية. تعيين بوابة R2 فرز على مؤامرة باستخدام زر مضلع بوابة على شريط الأدوات بحيث يقع البوابة بين + 5٪ و -5٪ الخلايا من مركز التوزيع (مجموع الخلايا 10٪ حول ذروة بيل- رئيس مؤسسة منحنى على شكل).
  10. وضع أنبوب جمع تحتوي على 1.2 مل LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول عند مخرج الصك FACS وفرز 10 6 خلايا إرضاء كل من R1 و R2 البوابات.
  11. إزالة أنبوب جمع، وكأب، وبلطف دوامة.

3. Metagenomic أنزيم فحص

  1. احتضان الخلايا مرتبة (من الخطوة 2.11) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة حتى OD 600 تصل إلى 0.5.
  2. إضافة 1 ميكرولتر نسخة الحل تحريض لتضخيم الخلايا في عدد النسخ فوزميد. احتضان الخلايا ل3 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
  3. لإعداد الخلايا للفرز وإضافة 0.5 مل من الخلايا المستزرعة والركيزة المناسبة (ص -nitrophenyl خلات، ص -nitrophenyl-β-D-cellobioside، أو الفوسفات فينيل) في أنبوب 14 مل جولة القاع بتركيز نهائي من 100 ميكرومتر.
    1. لعينة السيطرة، إضافة 0.5 مل من الخلايا المستزرعة من الخطوة 3.2 إلى 14 مل أنبوب جولة القاع. إضافة نفس الحجم من برنامج تلفزيوني، حيث بلغ حجم الركيزة في الخطوة 3.3.
  4. احتضان العينتين عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعة.
  5. وفي الوقت نفسه، وإعداد الجهاز FACS مع نفس تكوينات كما الخطوة 2.3.
  6. إضافة 5 ميكرولتر من الخلايا (للفرز) والخلايا السيطرة لمدة 5 مل أنابيب جولة القاع التي تحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني، على التوالي.
  7. وضع أنبوب يحتوي على خلايا السيطرة على ركان ميناء التحميل من نظام مراقبة الأصول الميدانية وانقر على زر تحميل على اقتناء لوحة من البرنامج نظام مراقبة الأصول الميدانية. ضبط معدل الحدث 1000 - 3000 أحداث / ثانية عن طريق التحكم أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
  8. تحجيم إنشاء سجل FSC-A مقابل سجل تحجيم SSC-A مؤامرة مبعثر من خلال النقر على زر مؤامرة نقطة في ورقة العمل العالمية للبرمجيات وضبط بوابة مبعثر R1 لتشمل الأحداث القميص (السكان البكتيرية) باستخدام زر مضلع بوابة على شريط الأدوات.
  9. تحجيم إنشاء سجل FSC-A مقابل سجل تحجيم FITC-A مؤامرة مبعثر من خلال النقر على زر مؤامرة نقطة في ورقة العمل ووضع بوابة R2 فرز على مؤامرة باستخدام زر مضلع بوابة على شريط الأدوات بحيث أقل من 0.1٪ من تم الكشف عن خلايا السلبية داخل بوابة R2.
  10. استبدال أنبوب عينة التحكم مع أنبوب عينة الفرز، وضبط معدل الحدث 1000 - 3000 أحداث / ثانية عن طريق التحكم في أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
  11. وضع أنبوب جمع تحتوي على 0.5مل LB عند مخرج الصك FACS وفرز 10 4 خلايا إرضاء كل من بوابات R1 و R2.
    ملاحظة: معيار الفرز يمكن أن تتراوح من أعلى بنسبة 0.1٪ إلى 5٪ من FITC-A في بوابة R2. في هذا البروتوكول، جمعت أعلى خلايا 1٪ كما ايجابيات.
  12. إزالة أنبوب جمع، وكأب، وبلطف دوامة.
  13. نشر 0.5 مل العينات التي تم جمعها على اثنين من لوحات أجار (90 ملم أطباق بتري) التي تحتوي على LB، 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين، 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
  14. إذا لزم الأمر، نفذ جولات إضافية من الفرز لFITC-A تخصيب بتكرار الخطوات 3،1-3،14.

4. هيت تأكيد اختيار ونشاط انزيم

  1. تحليل التدفق الخلوي
    1. من لوحة المحتضنة في الخطوة 3.14، حدد مستعمرة تظهر أي مضان باستخدام منتقي مستعمرة تحت المراقبة من 488 نانومتر الطول الموجي لإضاءة LED.
    2. تطعيم مستعمرة المحدد في 14 مل ريال عمانيالقاع اوند أنبوب يحتوي على 2 مل LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة حتى OD في 600 تصل إلى 0.5.
    3. إضافة 2 ميكرولتر نسخة الحل تحريض لتضخيم الخلايا في عدد النسخ فوزميد. احتضان الخلايا ل3 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
    4. إعداد 14 مل أنبوب جولة القاع وإضافة 1 مل من الخلايا المستزرعة (الخطوة 4.1.3). إضافة الركيزة المناسبة (ص -nitrophenyl خلات، ص -nitrophenyl- β-D-cellobioside، أو الفوسفات فينيل) بتركيز نهائي من 100 ميكرومتر.
      1. لعنصر تحكم، إضافة 1 مل الخلايا المستزرعة من الخطوة 4.1.3 إلى 14 مل أنبوب جولة القاع وإضافة نفس الحجم من برنامج تلفزيوني، حيث بلغ حجم الركيزة في الخطوة 4.1.4.
    5. احتضان العينتين عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعة.
    6. وفي الوقت نفسه، وإعداد الجهاز FACS مع نفس تكوينات كما الخطوة 2.3.
    7. إضافة 5 ميكرولتر من الخلايا السيطرة والركيزة المعالجة إلى 5 مل أنابيب جولة القاع التي تحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني، على التوالي.
    8. وضع أنبوب يحتوي على خلايا السيطرة على ميناء التحميل من الجهاز FACS وانقر على زر تحميل على اقتناء لوحة من البرنامج نظام مراقبة الأصول الميدانية. ضبط معدل الحدث 1000 - 3000 أحداث / ثانية باستخدام أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
    9. انقر على زر شراء لقياس FITC-A.
    10. استبدال أنبوب العينة الضابطة مع الركيزة تعامل أنبوب العينة. ضبط معدل الحدث 1000 - 3000 أحداث / ثانية باستخدام أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
    11. انقر على زر شراء لقياس FITC-A.
    12. مقارنة مضان من مجموعتي الخلايا عن طريق التآمر رسم بياني لعدد خلايا مقابل سجل تحجيم FITC-A.
  2. فحوصات أخرى لتأكيد نشاط انزيم
    1. لمزيد من التعرف على المرشحين الإنزيم المحدد، استخراج الحمض النووي فوزميد باستخدام معيار استخراج المواليةcedures من مجموعات استخراج التجارية وتحليل تسلسل النوكليوتيدات، أو اختبار في المختبر نشاط انزيم 6،7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم فحص ركائز الفينولية ثلاثة لتحديد الانزيمات metagenomic جديدة من مكتبة metagenome من رواسب مسطحة المحيط المد والجزر في تيآن، كوريا الجنوبية باتباع البروتوكول المقترح. لبناء مكتبة، ومتوسط ​​30 - تم إدراج تسلسل metagenome 40 كيلوبايت في fosmids، والتي تقوم على E. القولونية F عامل ريبليكون وكما عرضت نسخة واحدة في الخلية. لاحظ أن fosmids وقد استخدمت على نطاق واسع لبناء مكتبات الجينوم معقدة بسبب انتشار مستقر لها 8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

زيادة كفاءة إنتاج البيولوجية الحفازة هو المفتاح لنجاح الحيوية والكيميائية القائمة على الصناعة 9 و metagenome يعتبر واحدا من أفضل مصدر الانزيم الطبيعي. في هذا المعنى، لا بد من فحص أنزيمات جديدة من metagenome حيث لم تستكشف أغلبية الموارد الوراثية 10. وقد وضعت عدة طرق الفحص الذي كشف عن مباشرة انزيم المنتجات باستخدام منشطات النسخ 11 و 12 ولكن هذه التقنيات تتطلب نظام النسخي-الأيض استجابة محددة. من ناحية أخرى، GESS ينطبق على نطاق واسع اعتمادا على استخدام...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من خلال منح من مركز البيولوجيا التركيبية الذكية لمشروع Global Frontier (2011-0031944) ، وبرنامج الجيل التالي Biogreen 21 (PJ009524) ، و NRF-2015M3D3A1A01064875 وبرنامج مبادرة أبحاث KRIBB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CopyControlEpicenterCCFOS110Fosmid Library Production Kit 
حل الحث CopyControlمركزCCIS125Fosmid محلول تحريض نسخ
EPI300خلية الكفاءةEC300110 الكهربائية
pCC1FOSمركزCCFOS110Fosmid ناقلات
الناقل الجيني MxcellBio-Radكوفيت كهربائي ونظام التثقيب الكهربائي
FACSAria IIIBecton Dickinsonالتدفق الخلوي (آلة FACS)مجهر
نيكونAZ100M 
UltraSlim مايستروجينLED المضيء
50 مل أنبوب مخروطيBD Falcon
14 مل أنبوب دائري القاع  BD Falcon
أنبوب دائري القاع سعة 5 ملBD Falcon
p < / em > -nitrophenyl phosphateSigma-AldrichN7653Substrate
< em > p < / em > nitrophenyl & beta ؛ -D-cellobiosideSigma-AldrichN5759Substrate
p< / em>-nitrophenyl butylateSigma-AldrichN9876 & نب سب.الركيزه
لوريا بيرتاني (LB)BD Difco244620التربتون 10 جم / لتر ، مستخلص الخميرة 5 جم / لتر ، كلوريد الصوديوم 10 جم / لتر
مرق سوبر أوتمال (SOB) BDDifco244310التربتون 20 جم / لتر ، مستخلص الخميرة 5 جم / لتر ، كلوريد الصوديوم 0.5 جم / لتر ، كبريتات المغنيسيوم 2.4 جم / لتر ، كلوريد البوتاسيوم 186 مجم / لتر
مرق فائق الأمثل مع قمع الكاتابوليت (SOC)SOB ، 0.4٪ جلوكوز
2x مستخلص الخميرة التربتون (2xYT)BD Difco244020هضم البنكرياس للكازين 16 جم / لتر ، مستخلص الخميرة 10 جم / لتر ، مستخلص الخميرة 5 جم / لتر
وسائط2x مرق YT ، 15٪ جلسرين ، 2٪ جلوكوز
pGESS (E135K)ناقل الحمض النووي يحتوي على dmpR ، جينات egfp مع محفزاتها المناسبة ، RBS ، و terminator.
انظر المرجع 5 في المخطوطة ل المزيد من التفاصيل.
ChloramphenicolSigmaC0378
AmpicillinSigmaA9518
BD FACSبرنامجBecton Dickinsonالإصدار 7.0
PBSGibco70011-0440.8٪ كلوريد الصوديوم ، 0.02٪ KCl ، 0.0144٪ Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، 0.024٪ KH2< / sub>OP4 ، < / sub> pH 7.4
قياس تخزين الخلايا قياس التدفق الخلوي Diva

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
  2. Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
  3. Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
  4. Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40(2012).
  5. Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
  6. Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
  7. Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
  8. Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
  9. Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
  10. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
  11. Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
  12. Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
  13. Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
  14. Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetic Enzyme Screening SystemHigh throughput ScreeningFlow Cytometry SorterMetagenomic LibraryPhenolic SubstratesEnzyme Activity ScreeningFACS SortingGFP Reporter ExpressionSubstrate InductionEnzyme Identification

Related Articles