مقالة منهجية

نموذج قائم على خلية المشيمية الضفيرة طلائي من الجدار السائل الإنسان الدم النخاعي لدراسة العدوى البكتيرية من الجانب Basolateral

DOI:

10.3791/54061

⸱

مايو 6, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of NDU Life Sciences, Nippon Dental University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'>تشكل الخلايا الظهارية للضفيرة المشيمية (CP) حاجز السائل الدموي النخاعي (BCSFB). يستخدم نموذج المختبر ل BCSFB خلايا الورم الحليمي المشيمي البشري (HIBCPP). توضح هذه المقالة الاستزراع والعدوى القاعدية لخلايا HIBCPP باستخدام نظام إدخال مرشح ثقافة الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكل الخلايا الظهارية للضفيرة المشيمية (CP) ، الموجودة في الجهاز البطيني للدماغ ، حاجز السائل الدموي النخاعي (BCSFB). يعمل BCSFB في فصل السائل الدماغي النخاعي (CSF) عن الدم وتقييد التبادل الجزيئي إلى الحد الأدنى. يعتمد النموذج المختبري ل BCSFB على الخلايا المشتقة من الورم الحليمي المشيمي البشري (HIBCPP). تعرض خلايا HIBCPP وظائف حاجز نموذجية بما في ذلك تكوين الوصلات الضيقة (TJs) ، وتطوير المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) ، بالإضافة إلى نفاذية طفيفة للجزيئات الكبيرة. هناك العديد من مسببات الأمراض التي يمكن أن تدخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) عبر BCSFB وبالتالي تسبب مرضا شديدا مثل التهاب السحايا. أحد هذه مسببات الأمراض هو النيسرية السحائية (N. meningitidis) ، وهي بكتيريا خاصة بالإنسان. يتيح استخدام خلايا HIBCPP في نظام إدخال مرشح ثقافة الخلايا المقلوب دراسة تفاعلات مسببات الأمراض مع خلايا BCSFB من جانب الخلية القاعدية الجانبية ، وهو أمر مناسب في الجسم الحي. في هذه المقالة ، نصف بذر واستزراع خلايا HIBCPP على إدخالات زراعة الخلايا. علاوة على ذلك ، يتم إثبات إصابة الخلايا ب N. meningitidis جنبا إلى جنب مع تحليل البكتيريا الغازية والملتصقة عن طريق التألق المناعي المزدوج. نظرا لأن خلايا الشلل الدماغي متورطة أيضا في أمراض أخرى ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر والتصلب المتعدد ، وكذلك أثناء ورم خبيث في الدماغ للخلايا السرطانية ، يمكن أيضا تطبيق النظام النموذجي في مجالات البحث الأخرى. يوفر القدرة على فك رموز الآليات الجزيئية وتحديد الأهداف العلاجية الجديدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حاجز السوائل الدم النخاعي (BCSFB) هي واحدة من المواقع حاجز الثلاثة بين الدم والدماغ 1. في المضاهاة الصرفي هي الخلايا الظهارية في الضفيرة المشيمية (CP) 2،3، وهو ملفوف-البطانية الظهارية، وهي أوعية دموية بشدة وتقع في بطينات الدماغ. يقدم CP لإنتاج السائل النخاعي (CSF)، وكذلك لفصل الأخير من الدم. من أجل تحقيق وظيفة الحاجز، تظهر الخلايا الظهارية CP نشاط احتسائية منخفضة، وتعبر عن النقل محددة، وترتبط كثيفة من قبل شبكة مستمرة من منعطفات ضيقة (TJS) 2،3.

البشري الورم الحليمي المشيمية الضفيرة (HIBCPP) الخلايا، مستمدة من خبيث الورم الحليمي المشيمية الضفيرة من امرأة يابانية 4 استخدمت لبناء وظيفي في نموذج المختبر من BCSFB. تظهر خلايا HIBCPP بضع خصائص BCSFB ظيفية وتشكيل TJجدائل، وتطوير إمكانات غشاء بطريق الظهارة العالية التي يمكن تحديدها على النحو المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير)، والنفاذية طفيفة عن الجزيئات. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا HIBCPP تعبر عن النقل المميزة، والتي قد تساعد على تنظيم المكروية الأيونية، وتبين قمي / basolateral 5،6،7 القطبية.

وقد تبين أن BCSFB للعمل كموقع لدخول مسببات الأمراض (البكتيريا والفيروسات والفطريات) في الجهاز العصبي المركزي (CNS) 8. غزو ​​الجراثيم، بما في ذلك النيسرية السحائية (السحائية ن)، وهي بكتيريا سالبة الجرام، يمكن أن يسبب الأمراض الحادة مثل الالتهاب السحائي. دليل على أنه يتغلب على حاجز الظهارية واقية من CP معتمد من قبل الملاحظات التشريحية المرضية في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب السحايا اظهار زيادة كميات المكورات السحائية في الأوعية والخلايا الظهارية CP 9،10. للدخول إلى الخلايا المضيفة باcteria في كثير من الأحيان اختطاف آليات endocytotic، التي تتوسط أو الناجمة عن مستقبلات سطح محددة تقع على الخلايا المضيفة. منذ التفاعلات مسببات الأمراض مع هذه المستقبلات يمكن أن يكون نوعا نماذج محددة 11، الحيوان لا يمكن إلا أن يتم التشاور إلى حد المقيد. يوفر خط الخلية HIBCPP الفرصة لدراسة عملية الغزو، فضلا عن الآليات الجزيئية الكامنة في نظام نموذجي البشري. توظيف إدراج خلية ثقافة تمكننا من تحليل التفاعلات من مسببات الأمراض مع الخلايا المضيفة من الجانبين خلية متميزة. العديد من أنواع البكتيريا، بما في ذلك N. السحائية، تخضع بقوة لتأثير الجاذبية خلال فحوصات العدوى. للتفاعل الأمثل من مسببات الأمراض مع الخلايا HIBCPP خلال فحوصات، تضاف البكتيريا في البداية في المقصورة العليا من نظام إدراج مرشح زراعة الخلايا. لتمكين العدوى من قمية أو الجانب خلية basolateral، على التوالي، وكان شكلان للنظام في المختبر تهتblished: في نظام موحد هي المصنفة خلايا HIBCPP في المقصورة العليا من إدراج مرشح، ومحاكاة الوضع عندما تقع الكائنات الحية الدقيقة على الجانب CSF والحصول على اتصال مع الجانب قمية من الخلايا (الشكل 1A، C). في المقابل، وذلك باستخدام خلايا HIBCPP في ثقافة خلية نظام إدراج مرشح مقلوب يعكس الظروف عندما البكتيريا دخلت مجرى الدم. الكائنات الحية الدقيقة تنشر في الدم وCP قاء الخلايا الظهارية من الجانب basolateral (الشكل 1B، D). الجدير بالذكر، في هذا النظام النموذجي فقد تبين أن البكتيريا تغزو خلايا HIBCPP بطريقة القطبي تحديدا من 5،7 الجانب خلية basolateral.

في وقت لاحق للإصابة من حزب المحافظين، ومسببات الأمراض غزت يمكن التعرف عليه بواسطة النظام الفطري المناعي من خلال ربط لمستقبلات التعرف على نمط (PRRs). أعضاء موصوفة وصفا جيدا للPRRs تنتمي إلى عائلة تول مثل مستقبلات (TLR). يمكن TLRs بند الهياكل مميزة من الكائنات الحية الدقيقة المعدية، التي توصف بأنها أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs). ربط من المستقبلات يؤدي إلى تنشيط الخلية المضيفة مما يشير إلى الشلالات التي تؤدي تعبير عن السيتوكينات و chemokines 12، والتي بدورها تحفز هجرة الخلايا المناعية عبر BCSFB 13،14. ولقد ثبت أن الخلايا HIBCPP تعبر عن عدة TLRs على مستوى مرنا وأن الإصابة بفيروس N. ينتج التهاب السحايا في إفراز السيتوكينات عدة و chemokines، بما في ذلك CXCL1-3، IL6، IL8 وTNFα 15،16.

هنا، نحن تصف زراعة وإصابة خط الخلية البشرية HIBCPP في نظام إدراج الثقافة خلية المقلوب الذي يحاكي BCSFB. ويتيح هذا النظام النموذجي لدراسة التفاعلات من مسببات الأمراض مع الجانب خلية في الجسم الحي basolateral ذات الصلة فضلا عن الاستجابة الخلوية لاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد خلية ثقافة تصفية إدراجات للخلايا البذر HIBCPP في نظام معكوس نموذج

  1. قبل الدافئة DMEM / F12 (هام) تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل الانسولين، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 10٪ مصل العجل الجنين (FCS).
  2. استخدام ملقط معقم لوضع 0.33 سم ² منطقة النمو تصفية خلية ثقافة إدراج مع حجم المسام من 3 ميكرون رأسا على عقب في لوحة ال 12 أيضا (الشكل 1E).
  3. ملء المتوسطة في حجرة الأدنى من الثقافة خلية مرشح إدراج (حوالي 3 مل) و 100 ميكرولتر على رأس إدراج مرشح. إغراق لوحة وكذلك انخفاض مقصورة مع المتوسط. نضح المتوسطة المفرط في مثل هذه الطريقة التي حجرة أقل من إدراج مرشح يبقى شغل (الشكل 1E).
    ملاحظة: من المستحسن استخدام ماصة المصلية لهذه الخطوة.
  4. تغطية لوحة 12-جيدا مع غطاء ونقل إدراج استعداد مرشح زراعة الخلايا إلى الحاضنة، 37 درجة مئوية،5٪ CO 2 حتى إضافة الخلايا.

2. زراعة والركض من خلايا HIBCPP

  1. إعداد DMEM / F12 (هام) تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل، 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 10٪ FCS.
  2. المتوسطة قبل الدافئة وبرنامج تلفزيوني في 37 ° C حمام الماء. نضح المتوسطة من القارورة. إضافة 10 مل PBS إلى قارورة ودوامة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  3. إضافة 3 مل 0.25٪ التربسين-EDTA إلى القارورة ودوامة. وضع في الحاضنة، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  4. بعد ما يقرب من 20 دقيقة إزالة قارورة من الحاضنة. تأكد من أن الخلايا يتم فصل من الجزء السفلي من القارورة وعرض شكل دائري عند شملهم الاستطلاع مع المجهر.
    ملاحظة: الخلايا لا تنفصل تماما عن بعضها البعض، وغالبا ما توجد في تكتلات. فمن المستحسن أن استخدام الخلايا حتى مرور 38.
  5. لوقف trypsinization بإضافة 17 مل المتوسطة. resuspend الخلايا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا، ونقل تعليقفي أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 50 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. resuspend الخلايا في حجم مناسب من المتوسط ​​وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
    ملاحظة: إن تركيز خلايا HIBCPP معلق يجب أن تكون 1 × 10 6 خلية / مل. للحفاظ على خلايا HIBCPP يقترح تحويل مبلغ من 1-6 × 10 6 خلايا في 10 مل المتوسطة إلى T75-قارورة. تغيير المتوسط ​​كل يوم الثاني على التوالي.

3. البذر خلية الثقافة مقلوب تصفية إدراجات مع خلايا HIBCPP

  1. على رأس كل إدراج مرشح المقلوب (أي الجانب السفلي من فلتر) إضافة 80 ميكرولتر من تعليق خلية (أي 8 × 10 4 خلايا) (الشكل 1E).
    ملاحظة: تأكد من أن الخلايا توزع بالتساوي في التعليق من قلب الأنبوب قبل البذر.
  2. تغطية إدراج مرشح الثقافة خلايا المصنف مع غطاء لوحة 12-جيدا ونقل إلى الحاضنة، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  3. في اليوم الأول، وملء 1 مل المتوسطة في الآبار من 24 لوحة جيدا. رفع مرشح إدراج ثقافة الخلية باستخدام ملقط للخروج من لوحة ال 12 أيضا، تجاهل المتوسطة داخل، وتحويل إدراج مرشح ووضعها في التوجه الى معيار مستعدة لوحة 24-جيدا (الشكل 1E).
  4. وضع الخلايا في متوسطة جديدة كل يوم الثاني على التوالي. إعداد 24 بئرا مع متوسطة جديدة ونقل إدراج مرشح لذلك. ملء إدراج مع 0.5 مل متوسطة جديدة. تحقق طير كل يوم كما هو موضح في قسم 4.
  5. عندما القيم طير من HIBCPP المصنف الخلايا على إدراج ثقافة خلية تتجاوز 70 Ω س سم مربع (حوالي 4 أيام بعد البذر)، ثم يستمر زراعة الخلايا في المتوسط ​​تحتوي على 1٪ FCS و 5 ميكروغرام / مل الانسولين. إعداد 24 لوحات جيدا مع 1 مل المتوسطة لكل بئر. نقل إدراج مرشح لالآبار المعدة وتبادل المتوسطة في المقصورة العليا.
    ملاحظة: انسحاب هذا المصل بعد confluency يؤدي إلى تشكيل لإمكانات غشاء أعلى.
  6. نضح المتوسطة من المقصورة مرشح، ونقل إلى معدة إعدادا جيدا وملء مع 500 ميكرولتر المتوسطة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. وضع الخلايا بين عشية وضحاها في الحاضنة، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.

4. قياس بطريق الظهارة المقاومة الكهربائية (طير)

  1. تزج نصائح الكهربائي من voltohmmeter الأنسجة الظهارية لمدة 15 دقيقة في 80٪ من الإيثانول. نقل voltohmmeter تحت غطاء محرك السيارة والسماح القطب الجافة لحظة. وضع القطب في مستنبت منها تستخدم للحصول على الخلايا لمدة 15 دقيقة أخرى للتوازن.
  2. إجراء قياسات عن طريق وضع ذراع أطول من القطب بحيث يلامس الجزء السفلي من المقصورة أقل في كل مرة، وضع الذراع أقصر في حجرة إدراج مرشح.
    ملاحظة: قيم المقاومة مرشح إدراج ثقافة الخلية دون الخلايا في المتوسط ​​يجب أن تستخدم القيم كما فارغة ((القيمة المقاسة (Ω) - قيمة فارغة (Ω)) س فلترالسطح (أي 0.33 سم مربع)).
  3. بعد قياس مكان القطب مرة أخرى إلى 80٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة. تخزين في أنبوب الجافة.

5. تحديد Paracellular النفاذية

  1. حل 1 غرام FITC-سكري في 200 مل المتوسطة ثقافة تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل الانسولين 1٪ FCS. تطبيق 50 ميكروغرام / مل من محلول داخل المقصورة مرشح العليا قبل إصابة الخلايا.
  2. بعد الإصابة جمع عينات المتوسطة من أسفل جيدا لتحديد كيفية تمرير الكثير سكري من المقصورة مرشح من خلال طبقة الخلايا.
  3. إعداد محلول قياسي FITC-سكري وأداء 1: 2 التخفيفات، 10 مرات (100٪، 50٪، 25٪، 12.5٪، 6.25٪، 3.13٪، 1.56٪، 0.78٪، 0.39٪، 0.2٪ و 0٪) . تحديد مضان بواسطة قياس جميع العينات في قارئ صفيحة.

6. إعداد البكتيريا لإصابة خلايا HIBCPP على زراعة الخلايا تصفية إدراجات

  1. يوم واحد قبل التجربة، كشط رانه N. المجمدة السحائية سلالات قبالة الجلسرين الأسهم ومسحة من على الشوكولاته آجار مع Vitox. تنمو بين عشية وضحاها في الحاضنة، عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2.
  2. استخراج 20-30 المستعمرات من الثقافة بين عشية وضحاها، ونقل إلى أنبوب يحتوي على 8 مل البروتيوز ببتون المتوسطة تستكمل مع 0.042٪ NaHCO 3، 0.01 M MgCl 2 و 1٪ Polyvitex.
  3. يهز البكتيريا مقابل 1.25 ساعة على 220 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 2684 ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف و resuspend بيليه البكتيرية مع 8 مل المصل خالية المتوسطة. دوامة لضمان حتى تعليق.
  4. لتحديد الكثافة والثقافة، وقياس التخفيف من 1:10 في كثافة بصرية (OD) من 600 نانومتر. ضبط تعليق البكتيرية إلى OD 600 من 0.1.
    ملاحظة: هذا تعليق يحتوي تقريبا. 1 × 10 8 كفو / مل.
  5. لتأكيد تركيز الخلية البكتيرية، تمييع تدريجي تعليق (01:10) تصل إلىتخفيف من 10 -5 ولوحة على لوحات الشوكولاته آغار.
    ملاحظة: التخفيفات المسلسل مماثلة تحتاج إلى القيام بها لحساب منحنيات النمو البكتيرية.

7. العدوى من خلايا HIBCPP على زراعة الخلايا تصفية إدراج وتحديد البكتيرية الغزو التي كتبها المناعي مزدوج

  1. بعد استمرار ثقافة خلية في المتوسط ​​تحتوي على 1٪ FCS و 5 ميكروغرام / مل الانسولين، وقياس خلايا كل يوم باستخدام voltohmmeter الأنسجة الظهارية. إذا كانت الخلايا قد وصلت إلى طير نحو 500 Ω س سم ²، تنفيذ العدوى.
  2. تصيب الخلايا مع تعليق البكتيرية مستعد في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 10. تخزين الخلايا المصابة في الحاضنة، عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 للفترة المشار إليها من الزمن.
    ملاحظة: يمكن حساب وزارة الداخلية من خلال مراعاة عدد من الخلايا في خلية ثقافة مرشح إدراج في ملتقى (1.21 × 10 6 خلية / سم 2).
  3. وقف تصيبأيون عن طريق غسل ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر المصل خالية المتوسطة (SFM) يحتوي على الزلال 1٪ المصل البقري (BSA) يطبق على المقصورة فلتر، 1 مل إلى المقصورة أقل.
  4. منع مع 500 ميكرولتر الإدارة المستدامة للغابات التي تحتوي على العازلة BSA 1٪ في المقصورة مرشح و1 مل في المقصورة أقل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع التصاق الأجسام المضادة لمواقع الربط غير محددة.
  5. احتضان مع 100 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية لمكافحة N. meningtidis α-المرصد المغربي للسجون (1: 200) في المقصورة فلتر و 500 ميكرولتر في المقصورة أقل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يحتاج تركيز الأجسام المضادة إلى أن معاير.
  6. غسل الخلايا عن طريق الشفط المتوسطة من المقصورة مرشح، ونقل إدراج مرشح لإعداد SFM جيدا مع 1 مل تحتوي على 1٪ BSA وملء المقصورة مرشح أفرغت مع الإدارة المستدامة للغابات 500 ميكرولتر تحتوي على 1٪ BSA. كرر هذه الخطوة مرتين.
  7. إصلاح الخلايا مع 500 ميكرولتر 4٪ الفورمالديهايد في المقارنة فلترrtment، 1 مل في المقصورة أقل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. غسل الخلايا عن طريق الشفط المتوسطة من المقصورة مرشح، ونقل إدراج مرشح لمعدة إعدادا جيدا مع 1 مل برنامج تلفزيوني وملء المقصورة مرشح أفرغت مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    ملاحظة: عينات يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
  9. خفض زراعة الخلايا الثابتة مرشحات من إدراج وأغسلها مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 250 الفلورسنت ميكرولتر المسمى (الطول الموجي الإثارة 594 نانومتر) الثانوية الضد الدجاج مكافحة الأرانب (1: 500) وصمة عار البكتيريا خارج الخلية.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يحتاج تركيز الأجسام المضادة إلى أن معاير.
  10. Permeabilize الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA و 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل خلايا ثلاث مرات مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA.
  11. احتضان مع 250 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية لمكافحة N. السحائية α-المرصد المغربي للسجون (1: 200) لمدة 30 دقيقة إلى وصمة عار البكتيريا من خارج وداخل الخلايا. غسل خلايا ثلاث مرات مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA.
  12. تطبيق 250 ميكرولتر من الفلورسنت المسمى (الطول الموجي الإثارة 488 نانومتر) الضد الثانوية (1: 500)، فلوري المسمى (الطول الموجي الإثارة 660 نانومتر) Phalloidin (1: 250) و4'، هيدروكلوريد 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) ( 1: 50،000) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لصبغ البكتيريا من خارج وداخل الخلايا، الهيكل الخلوي أكتين ونوى.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يحتاج تركيز الأجسام المضادة إلى أن معاير.
  13. غسل خلايا ثلاث مرات مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA. تضمين الخلايا في تصاعد المتوسطة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الفحص عن طريق المجهر.
  14. تحديد عدد من البكتيريا غزت لكل حقل محدد مسبقا. القيام بذلك عن طريق عد 20 حقلا في غشاء الترشيح. حساب النسبة المئوية للبكتيريا بغزو.
    ملاحظة: اضرب عدد البكتريا متوسط ​​من 20 حقلا المجهرية مع كوفيك منطقةient. نتيجة تعبر عن كمية من مجموع البكتيريا الموجودة في 0.33 سم ² زراعة الخلايا مرشح إدراج. تقسيم هذه القيمة بمقدار البكتيريا نما في وسائل الإعلام خلال مدة الإصابة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف زراعة وإصابة خلايا HIBCPP في نظام إدراج الثقافة خلية مقلوب. هذا النموذج يسمح لنا لدراسة آليات الغزو والكامنة مسارات الإشارات الجزيئية من الجانب خلية basolateral، استنساخ الوضع الفسيولوجي للبكتيريا نشر ودخول الخلايا الظهارية عبر مجرى الدم (الشكل 1).

الخلايا HIBCPP عرض وظائف معينة حاجز، التي تمكنها من تقييد صرف الجزيئي إل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الظهارية للCP تشكل BCSFB الذي يفصل بين السائل النخاعي من 2،3 الدم. أنشأنا مؤخرا خط الخلية HIBCPP كنموذج البشري الوظيفي للBCSFB. الخلايا عرض وظائف حاجز مهمة من BCSFB في المختبر، بما في ذلك تطوير إمكانات غشاء عالية، ونفاذية منخفضة عن الجزيئات، وكذلك وجود خيوط مستمرة من TJS 5. وتساهم البروتينات TJ إلى قطبية قمي / basolateral من الخلايا. الاستقطاب هو من أهمية كبيرة لتوطين موجهة من المستقبلات السطحية وكذلك البروتينات نقل محددة. لقد أظهرنا توطين ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور هارتويج وولبورغ على إجراء المجهر الإلكتروني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ Trypsin-EDTAGibco25200-056
4 حاد ؛ 6 دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI)Life TechnologiesD1306
12 بئر ألواحStarlabCC7682-7512
24 بئراStarlabCC7682-7524
مكافحة النيسرية السحائية &alpha ؛ -OMPكان هذا الجسم المضاد هدية من الدكتورين H. Claus و U. Vogel (University of Wü رزبورغ ، ألمانيا)
أليكسا فلور 488 (دجاج مضاد للأرانب)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (دجاج مضاد للأرانب)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
ألبومين مصل البقر (BSA)Calbiochem12659
أطباق أجار الشوكولاتةBiomerieux43109
السيتوكالاسين DSigmaC8273
DMEM / F12 + L-Glut + 15 ملي هيبسجيبكو31330-095
DMEM / F12 + L-Glut + 15 ملي مولار HEPES بدون فينولريدجيبكو11039-047
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجماD2650
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)لايف تكنولوجيز10270106
FITC-InulinسيجماF3272
الأنسولينسيجما19278
MgCl2< / sub>سيجما2393
NaHCO3< / sub>سيجما55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
البنسلين / الستربتومايسينMP الطب الحيوي1670049
PolyvitexBiomerieux55651
Proteose peptoneBD211684
متوسط خال من المصلGibco10902-096
إدراج ثقافة الخلايا الرقيقة لألواح 24 بئرا ، حجم المسام 3 وميكرو ؛ mGreiner662630
قارورة زراعة الأنسجة 75 سم & sup2 ؛ غطاء أحمر معقمGreiner658175
Triton X-100SigmaT8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 مع قطب كهربائي MERSSTX01MilliporeMERSSTX00
ألواح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
  2. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
  3. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
  4. Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
  5. Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069(2012).
  6. Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
  7. Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  8. Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80(2015).
  9. Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
  10. Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
  11. Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
  12. Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
  13. Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
  14. Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
  15. Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  16. Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30(2013).
  17. McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
  18. Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
  19. Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
  20. Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
  21. Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
  22. Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
  23. Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
  24. Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
  25. Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
  26. Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
  27. Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
  28. Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
  29. Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
  30. Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
  31. Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
  32. Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
  33. Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Choroid Plexus Epithelial CellsHuman Choroid Plexus Papilloma CellsTransepithelial Electrical Resistance MeasurementTight Junction Formation AnalysisBasolateral Bacterial Infection ModelNeisseria Meningitidis Invasion AssayFITC Inulin Permeability TestCell Culture Filter Insert SystemImmunofluorescent ZO 1 Occludin Claudin

مقالات ذات صلة