يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تعزيز 3-D تجميع الخلايا FACS تنقية التوتة طلائي مع EAK 16-II / EAKIIH6 الذاتي تجميع هيدروجيل

5.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54062

⸱

يونيو 27, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cellular Therapeutics, Allegheny Health Network, 2Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University, 3Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لإثراء الخلايا الظهارية الصعترية (TECs) بتدرج الكثافة لعزل FACS. كما يوضح استخدام ببتيدات EAK16-II / EAKIIH6 لتعزيز تكوين ركام TEC. توفر البيئات الدقيقة ل EAK16-II / EAKIIH6 hydrogel التكوين ثلاثي الأبعاد اللازم للحفاظ على بقاء ووظيفة TECs.

الملخص

انتفاخ الغدة الصعترية ، المرتبط بالشيخوخة أو الإهانات المرضية ، يؤدي إلى انخفاض إنتاج الخلايا التائية الناضجة. تعد استعادة وظيفة الغدة الصعترية الفاشلة أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على الاستجابة المناعية المكتسبة الفعالة بوساطة الخلايا التائية ضد مسببات الأمراض الغازية. ومع ذلك ، أثبت تجديد الغدة الصعترية وتنشيطه أنه يمثل تحديا ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى صعوبات إعادة إنتاج البيئة المكروية ثلاثية الأبعاد الفريدة لسدى الغدة الصعترية وهو أمر بالغ الأهمية لبقاء ووظيفة الخلايا الظهارية الصعترية (TECs). قمنا بتطوير نظام هيدروجيل جديد لتعزيز تكوين مجاميع TEC ، بناء على خاصية التجميع الذاتي لقليل الببتيدات البرمائية EAK16-II ونظيرها EAKIIH6 المنسج. تم إثراء TECs من الخلايا الصعترية المعزولة بتدرج الكثافة ، وفرزها باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، وتم تصنيفها بالأجسام المضادة لجزيء التصاق الخلايا الظهارية (EpCAM) التي تم تثبيتها ، جنبا إلى جنب مع مضاد His IgGs ، على مجمعات محول البروتين A / G. تم تعزيز تكوين مجاميع الخلايا عن طريق احتضان الخلايا القابلة للزراعة باستخدام قليل الببتيدات EAKIIH6 و EAK16-II ، ثم عن طريق زيادة التركيز الأيوني للوسط لبدء التبلور. يمكن أن تعزز مجاميع TEC المضمنة في هيدروجيل EAK بشكل فعال تطوير الخلايا التائية الوظيفية في الجسم الحي عند زرعها في الفئران العارية الرياضية.

المقدمة

الغدة الصعترية هي الجهاز الليمفاوي الرئيسية المسؤولة عن توليد مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا T-متسامح الذاتي الممرض رد الفعل التي لا غنى عنها لوظيفة نظام المناعة المكتسبة. وإنما هي جهاز ديناميكي حيث thymocytes النامية، هاجر من نخاع العظام والخلايا اللمفاوية السلف، الهجرة من خلال ثلاثي الأبعاد (3-D) مصفوفة تشبه الاسفنج للسدى الغدة الصعترية، والخضوع النسب المطابقة للمواصفات والتمايز، والهجرة في نهاية المطاف كما ناضجة الخلايا التائية. نجاح هذه العملية مبرمجة بشكل جيد يعتمد إلى حد كبير على الحديث المتبادل بين وthymocytes المهاجرة والخلايا الظهارية السكنية الغدة الصعترية (TECS)، فإن عدد سكان السائد للسدى الغدة الصعترية التي هي ضرورية لإنشاء والحفاظ على سلامة المكروية الغدة الصعترية.

واستنادا إلى موقعها التشريحي وظيفة فريدة من نوعها، TECS يمكن تقسيمها إلى مجموعتين فرعيتين: وTECS في القشرة (cTECs) التي هي responsible لاختيار-MHC النفس (كبير مجمع التوافق النسيجي) يقتصر خلايا تي (اختيار إيجابية)، وTECS في النخاع (mTECs) التي هي ضرورية للقضاء على autoreactive خلايا تي (اختيار السلبية) 1،2. العديد من العوامل (على سبيل المثال، والشيخوخة، والعدوى، أشعة، علاج المخدرات) يمكن أن يسبب الأضرار التي لا رجعة فيها لظهارة الغدة الصعترية، مما أدى إلى حصانة التكيفية للخطر. وعلى الرغم من المحاولات العديدة، لم استعادة وظيفة الغدة الصعترية صعبة نظرا لصعوبة إعادة إنشاء المكروية الغدة الصعترية. والجدير بالذكر أن الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد (3-D) التكوين أمر بالغ الأهمية لبقاء وظيفة TECS، في حين TECS مثقف في بيئة 2-D تقلل بسرعة التعبير عن الجينات الهامة لthymopoiesis 3،4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) و C-محطة نظائره histidinylated EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) ومنخفضة الوزن الجزيئي، oligopeptides محبة للجهتين القابلة للذوبان في توفير المياه منزوع الأيوناتص، ولكن الخضوع دبق من تشكيل الألياف بيتا عندما تتعرض لقوة الأيونية أعلى من 20 ملي كلوريد الصوديوم (ملح الطعام العادي تركيز في السوائل في الجسم البشري هو 154 ملم). هذا العقار استجابة البيئية يجعلها اللبنات تنوعا لتشكيل هياكل 3D. وصاحب العلامة على EAKII-H6 توفر آلية لرسو السفن، التي معاداة صاحب الجماعات الحكومية الدولية / FC-ملزمة المؤتلف بروتين A / G (αH6: السلطة الفلسطينية / G) يمكن المجمعات بمثابة محول لترسيخ المخدرات البروتين والجزيئات الحيوية الأخرى ( على سبيل المثال، والأجسام المضادة) على مركب هيدروجيل 5-8.

لقد أثبتنا سابقا أن جزيئات مفتش الفلورسنت المسمى ترسو على هيدروجيل يمكن الاحتفاظ بها في مكان الحقن لمدة تصل إلى 13 أيام 9. وعلاوة على ذلك، عندما αH6: تم إضافة محولات السلطة الفلسطينية / G الراسية مع مكافحة CD4 الجماعات الحكومية الدولية هيدروجيل EAK16-II / EAKIIH6 (EAK)، تم القبض على خلايا CD4 + T تحديدا 10. باستخدام تقنية مشابهة، لقد أثبتنا مؤخرا أن 3-D تجميع TECS جولد تعزيزه في EAK هيدروجيل مع المجمعات محول تحمل-TEC محدد أضداد EpCAM (αH6: السلطة الفلسطينية / G: αEpCAM). عندما زرعها تحت كبسولات الكلى من الفئران عارية، ويمكن للمجموعات TEC جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل EAK تدعم بشكل فعال في تطوير خلايا T وظيفية في الجسم الحي 11،12.

نحن هنا توضيح لدينا وسيلة لتنقية بسرعة وفعالية TECS مع الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) وتوليد 3-D المجاميع TEC مع نظام EAK هيدروجيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتم إيواء جميع الحيوانات المستخدمة في التجارب في منشأة الحيوان في معهد بحوث ألغني-المغني تحت مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي لل/ معهد بحوث المغني أليغني شبكة الصحة أليغني البروتوكول.

1. هضم الغدة الصعترية مع كولاجيناز

  1. حصاد الغدد الغدة الصعترية.
    1. الموت ببطء الفئران القديمة أسابيع 3-5 C57BL6 / J في ثاني أكسيد الكربون (CO 2) غرفة لجني الغدد الصعترية. في التفاصيل، وضع الفئران في الغرفة تحت CO 2 تحريض لمدة 3-5 دقيقة وتأكيد وفاة خلال التحقق من السكتة القلبية أو الجهاز التنفسي.
    2. وضع الجثة على ظهرها والرطب الجسم مع الايثانول 70٪. جعل شق أفقي صغير مع حادة، ومقص تشريح التوالي على البطن من خلال الجلد. سحب الجلد على طرفي (الرأس والساقين) بحيث يتم تشغيله الداخل الى الخارج.
    3. اجراء خفض الأفقي مع مقص تشريح فقط تحتأدنى ضلع وقطع طريق الحجاب الحاجز جانبية. عقد عملية الخنجري مع ملقط وقطع منتصف الأضلاع المضي على كلا الجانبين. سحب ما يصل الأضلاع / القص بحيث الغدة الصعترية واضحة للعيان.
      ملاحظة: الغدة الصعترية تقع مباشرة على الجزء العلوي من القلب، تتكون من 2 فصوص وهي ذات لون شفاف أبيض.
    4. باستخدام ملقط المنحنية، حلج القطن بلطف وسحب فصوص الغدة الصعترية الخروج من النسيج الضام، ونقل في حل غسل (انظر قائمة من المواد).
  2. يعد حل الهضم عن طريق خلط 9 مل RPMI-1640 (روزويل معهد الحديقة التذكارية المتوسطة 1640)، 0.025 ملغ / مل كولاجيناز النقاء، 10 ملي HEPES [4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic]، و 0.2 ملغ / مل الدناز أنا في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. حافظ على حل الهضم في 37 ° C حمام الماء حتى الاستخدام.
    ملاحظة: مقدار من الحل الهضم إعداد كافية لالتوتة الماوس ما يصل إلى خمسة الكبار، والتي يمكن المحتضنة معا في واحد 5 مل البوليسترين المستديرةأنبوب أسفل.
  3. نقل الغدة الصعترية إلى 60 مم طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 5-6 مل RPMI-1640.
  4. تشريح الغدة الصعترية مع 28 G حقنة الانسولين إبرة إلى قطع صغيرة (حوالي 1 ملم 3 مربع) للسماح للالخلايا الليمفاوية تتدفق.
  5. شطف القطع الغدة الصعترية مع RPMI-1640 التي هي في طبق بتري مع الزجاج ماصة باستير. إمالة الطبق والسماح للشظايا الغدة الصعترية تترسب في القاع. ببطء ونضح وتجاهل طاف RPMI-1640 باستخدام ماصة الزجاج. كرر هذه الخطوة الشطف مع 5-6 مل RPMI-1640 لمدة 4-5 مرات مع ماصة الزجاج حتى الحل هو أقل مبهمة.
    ملاحظة: ينصح الماصات الزجاجية في هذه الخطوة، لأن شظايا الغدة الصعترية تميل إلى التمسك البلاستيك، مما أدى إلى خسائر فادحة في أنسجة الغدة الصعترية. بالنسبة لبقية الإجراء، استخدام الماصات البلاستيكية.
  6. بعد شطف النهائي، تجاهل طاف كما هو موضح في الخطوة 1.5. إضافة 3 مل من محلول الهضم ونقل القطع الغدة الصعترية والحل في 5 مل جولة القاع صأنبوب olystyrene.
  7. وضع أنبوب على محور دوار أنبوب واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6 دقائق في سرعة دوران 12 دورة في الدقيقة.
  8. بعد مرور فترة الحضانة، والسماح للشظايا الغدة الصعترية تترسب في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية. جمع طاف مع ماصة باستير ونقل في أنبوب 50 مل الطرد المركزي مع 10 مل من محلول الغسيل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل وطاف resuspend الخلايا في محلول الغسيل 10 مل. الحفاظ على الجليد.
  9. كرر الخطوات من 1،6-1،8 مرتين على أجزاء الغدة الصعترية في 5 مل أنبوب البوليسترين جولة القاع. تجمع طاف في نفس أنبوب 50 مل.
    ملاحظة: الطرد المركزي ليست ضرورية للمرة الثانية وغسل الثالث.
  10. بعد الهضم النهائي، الماصة صعودا وهبوطا مع ماصة المصلية 2 مل من البلاستيك لكسر أي شظايا المتبقية في الأنبوب، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
  11. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 50 مل بسعر 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف، resuspend في 10 مل من غسل العازلهص ومرشح من خلال 100 مصفاة ميكرومتر الخلية. الحفاظ على الجليد.

2. إثراء TECS مع التدرج الكثافة متقطع

  1. إعداد 21٪ من محلول كثافة التدرج عن طريق خلط 2.4 مل كثافة متوسطة الانحدار (60٪ ث / ت من iodixanol في الماء) و 9.6 مل من محلول الغسيل.
  2. الطرد المركزي الخلايا الغدة الصعترية فصلها في أنبوب 50 مل مجموعة من الخطوة 1.11 في 300 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend العازلة في 2.5 مل الغسيل.
  3. إضافة المتوسطة 20 مل RPMI-1640 لتعليق الخلية.
  4. ملء 12 مل من 21٪ محلول التدرج الكثافة في 10 مل الماصة المصلية مع pipettor الإلكترونية. وضع غيض من الماصة المصلية في الجزء السفلي من 50 مل خلايا أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على، والسماح للحل كثافة التدرج لاستنزاف إلى أسفل الأنبوب عبر الجاذبية.
    1. طرد بلطف الحل كثافة التدرج من الماصة لإنهاء توليد طبقتين من كثافات مختلفة.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج فوص 20 دقيقة في RT في الدوار يتأرجح دلو. تعيين معدل التباطؤ في أبطأ مستوى.
  6. نقل الطبقة العليا واجهة لأنبوب 50 مل الجديد.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ معظم TECS في الواجهة. والخلايا الليمفاوية يعجل إلى أسفل الأنبوب بعد الطرد المركزي. إذا هذه الخلايا لاستخدامها لأغراض أخرى، وشطف بيليه مع 20 مل من محلول الغسيل ثلاث مرات. resuspend الخلايا في 10 مل من غسل العازلة.
  7. إضافة محلول الغسيل إلى 40 مل إلى أنبوب في الخطوة 2.6 وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. لإزالة طاف، نضح مع الماصة.
  8. تكرار غسل والطموح 2 مرات أكثر كما هو موضح في الخطوة 2.7.
  9. resuspend في 2 مل من محلول الغسيل وتعول الخلايا مع عدادة الكريات.

3. TECS عزل مع نظام مراقبة الأصول الميدانية

  1. ضبط الخلايا من الخطوة 2.9 في تركيز الخلايا 1x10 6/100 ميكرولتر مع الحل غسل ونقلالخلايا إلى 5 مل أنبوب جولة القاع (البولي بروبلين أو البوليسترين، على النحو الموصى به من قبل تعليمات فارز التدفق).
  2. إضافة 2 ميكرولتر مكافحة التيسير مستقبلات مفتش في الخلايا 1x10 6 واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. إضافة مكافحة CD45 (1: 150 التخفيف، 10 ميكرولتر لكل عينة) ومكافحة EpCAM (1: 100 التخفيف، 10 ميكرولتر لكل عينة) الأجسام المضادة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة أكثر من 20 دقيقة.
  4. غسل الخلايا بمحلول غسيل 2 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح طاف مع ماصة.
  5. Resuspend الخلايا في 1 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  6. تصفية من خلال 100 مصفاة ميكرون.
  7. تطبيق الخلايا إلى أداة الفرز. حدد الخلايا اللمفاوية والسكان TEC باستثناء أصغر الخلايا على ضوء متناثرة الجانب (SSC) / الضوء المتناثرة إلى الأمام (FSC) لوحة (الخلايا الميتة)، ثم بوابة على السكان تم اختيارها لCD45- EpCAM + لفرز 13.

4. Generation من TEC / EAK المجاميع

ملاحظة: إجراء إعداد كاشف والخطوات التي تنطوي على خلية خلط تحت غطاء محرك السيارة الصفحي.

  1. إعداد المجمعات محول السلطة الفلسطينية / G عن طريق خلط 4 ميكرولتر من مكافحة صاحب العلامة مفتش، 8 ميكرولتر من مكافحة EpCAM مفتش و 2.6 ميكرولتر من السلطة الفلسطينية / G في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق.
  2. ضبط TECS مرتبة من الخطوة 3.7 إلى 5X10 4 خلية / مل مع حل الغسيل، والماصة 100 ميكرولتر من بئر واحدة من التبخر منخفض، 96-جيدا جولة القاع لوحة زراعة الأنسجة. إضافة 14.6 المجمعات محول السلطة الفلسطينية / G ميكرولتر إلى الخلايا. وضع لوحة على منصة هزاز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. يغسل مرة واحدة مع 200 حل غسل ميكرولتر. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 400 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف مع micropipette.
  4. يغسل مرة واحدة مع محلول السكروز 200 ميكرولتر 10٪. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف مع micropipette.
  5. Resuspend الخلايا في 30 ميكرولتر 10٪ الصورةمحلول السكروز terile لكل بئر.
  6. إضافة 10 ميكرولتر من EAKIIH6 (7.5 ملغ / مل)، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
  7. إضافة 20 ميكرولتر من EAK16-II (10 ملغ / مل) إلى الخليط TEC.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة لنظام لبدء دبق. وضع لوحة على شاكر منصة لمدة 15-20 دقيقة في RT.
  9. وضع لوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد 2-4 ساعة، إضافة 100 ميكرولتر آخر من المتوسط ​​كاملة.
  10. تغيير المتوسط ​​كل يوم حتى الاستخدام.
    1. نضح 100 ميكرولتر من المتوسط ​​من على سطح الأرض دون إزعاج جل باستخدام micropipette وإضافة بلطف 100 ميكرولتر من المتوسط ​​قبل تحسنت عن طريق وضع طرف ماصة لجدار البئر.

5. توصيف TEC / EAK المجاميع

  1. لدراسة وظيفة المجاميع TEC / EAK في الجسم الحي، وجمع TEC / EAK هيدروجيل بعد O / N الثقافة وزرع تحت كبسولة الكلى من عارية athymicالماوس، وذلك باستخدام وصفه سابقا إجراء 11،14.
  2. مراقبة تطور خلايا T في محيط من حصاد 50-100 عينات الدم ميكرولتر في أنبوب جمع الدم التي تحتوي على EDTA من الفئران عارية 4-6 أسابيع بعد زرع وصمة عار مع مزيج من مكافحة CD4، -CD8، -CD45 و-CD3 الأجسام المضادة 12.
  3. تحليل نسب الخلايا اللمفاوية التائية في الكريات البيض في الدم الطرفية مع التدفق الخلوي (FCM)، وذلك باستخدام خلية واحدة تحليل البرامج 12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لدراسة فعالية استخدام كثافة بروتوكول الفصل الانحدار إلى إثراء خلايا انسجة CD45-، تم صبغ الخلايا التي تحصد من كل من واجهة والكريات اللمفاوية عجلت مع anti-CD45 وأضداد EpCAM. كلا، الجولق مكافحة Europaeus الملزن 1 (UEA1) والأجسام المضادة لمكافحة MHC الدرجة الثانية أدرجت أيضا في كوكتيل تلطيخ لمزيد من التعرف على مجموعات فرعية CTEC وMTEC. كما هو مبين في الشكل رقم 1، كنا قادرين على تحقيق روتيني بالقرب من 15-20 مرة إثراء TECS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في حين TECS هي السكان السائد للسدى الغدة الصعترية وتلعب أدوارا أساسية للهيكل وظيفة من وظائف الغدد الغدة الصعترية، أنهم لا يمثلون سوى حوالي 0.1-0.5٪ من إجمالي الخلوية الغدة الصعترية. بل هي أيضا الخلايا الهشة كما هي لاحظت ارتفاع نسبة موت الخلايا في بعض الأحيان بعد الهضم كولاجيناز، أي معالجة لفصل TECS من المصفوفة خارج الخلية (ECM). ندرتها (~ 200000 في الغدة الصعترية الماوس)، وهشاشة جعلت من مهمة صعبة لعزل TECS. استخدام الأخير من كولاجيناز العالية النقاء في عزلة TEC زادت بشكل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح R21 AI113000 (ساموا) وR01 AI123392 (YF).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > TEC Isolation < / قوي >
70٪ مختبرات إيثانولديكون2701 (1 جالون)الإيثانول 200 دليل ، مقص تشريح المياه منزوعة الأيونات
، أدوات العلوم الدقيقة، شركة مستقيمة.91460-11
ملقط Graefe ، أدواتالعلوم الدقيقة المستقيمة ، Inc.11053-10
ملقط Graefe ،العلوم الدقيقة المنحنية ، Inc.11052-10
محلول1x PBS ، 0.1٪ BSA ، 2 & nbsp ؛ mM EDTA
1x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)Gibco10010-023
BSA (ألبومين مصل الأبقار)SigmaA1470-100G
EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك)Invitrogen15575-038
محلول9 مل RPMI-1640 ، 0.025   ؛ ملغ / مل Liberase TM درجة البحث, 10 & nbsp; mM HEPES, 0.2  ملغ / مل DNaseI
RPMI-1640Gibco11879-020
Liberase TM Research GradeRoche05 401 127 001يشار إليها باسم "الكولاجيناز المنقى"
1 & nbsp ؛ M HEPESLonza17-737E
Dnase IRoche10 104 159 001
50  مل أنبوب الطرد المركزيCorning430290
60  مم طبق ثقافة الأنسجةFalcon353002
1/2 & nbsp ؛ cc U-100 حقنة الأنسولين 28   ؛ 1/2  جيبيكتون ديكنسون329461
5  مل البوليسترين أنبوب دائري القاعFalcon352058
5   ؛ مل ماصة زجاجيةفيشر للرعاية الصحية13-678-27Eاستخدم لشطف شظايا الغدة الصعترية. تميل شظايا الغدة الصعترية إلى الالتصاق بالحائط باستخدام ماصات بلاستيكية.
MACSmix أنبوب دوارMiltenyi130-090-753
100  ومايكرو. م مصفاة الخليةفالكون352360
التدرج الكثافة: OptiPrepAxis-Shield
< قوي > فرز الخلايا < / قوي >
5 & nbsp ؛ مل البولي بروبيلين أنبوب دائري القاعفالكون352063
مضاد للفأر CD16 / CD32 (Fc Block) BDBiosciences553142استخدام غير مخفف ، 2 & nbsp ؛ ومايكرو. ل لكل عينة
مضادة للفأر CD45-PercpCy5.5eBioscience45-0451-80استخدم في 1: 150 ، 10 & nbsp ؛ ومايكرو. ل لكل عينة
مضادة للفأر CD326 (EpCAM) -PEeBioscience12-5791-82استخدم في 1: 100 ، 10 & nbsp ؛ ومايكرو. ل لكل عينة
BD InfluxBD Biosciences
برنامج تحليل الخلية المفردةFlowJo
EAK Gel Assembly < / strong >
Anti His-TagAnaSpec29673"anti-His-Tag IgG"
منقى مضاد للفأر CD326 (EpCAM) BioLegend118202"مضاد ل EpCAM IgG"
البروتين المؤتلف A/Gبيرس التكنولوجيا الحيوية
1.5  مل أنابيب القفل الآمن ، Biopur ، SterileFisher Healthcare05-402-24Bالمشار إليها باسم "1.5 & nbsp ؛ مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق "
96-بئر ، لوحة زراعة الأنسجة ، قاع دائري مع غطاء منخفض التبخرBD Falcon353917
منصة هزازة: خلاط Nutator No.1105BD Clay Adams
10٪ سكروزSigmaS0389تحضير بالماء المقطر المعقم
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAEAEAKAK-CONH2< / sub>) شركةالببتيد الأمريكية & نب سب.مخصص مركبة ، 10 & nbsp ؛ ملغ/مل
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHH-CONH2) شركةالببتيد الأمريكية مخصص مركبة ، 7.5 & nbsp ؛ ملغ / مل
متوسطكامل RPMI-1640 ، 10٪ FBS ، 1٪ قلم / بكتيريا ، 1٪ L-glutamine ، 1٪ NEAA ، 5 & nbsp ؛ mM HEPES, 50  ومايكرو. M 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640Gibco11879-020
FBS (مصل الأبقار الجنينية)Atlanta BiologicalsS11150تعطيل الحرارة قبل الاستخدام
Pen / StrepGibco15140-122
L-glutamine 200 & nbsp ؛ ملي مولار (100x)Gibco25030-081
NEAA (حمض أميني غير أساسي) 100xGibco11140-050
1  M HEPESBioWhittaker17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)MilliporeES-007-E
شاكر المنصة: The Belly DancerStovall Life Sciences Inc.الموديل: USBDbo
أدوات الغسيل الهضم وسط

المراجع

  1. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  2. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  3. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  4. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  5. Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
  6. Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
  7. Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
  8. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
  9. Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
  10. Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
  11. Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
  12. Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
  13. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  14. Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
  15. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  16. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
  17. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
  18. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
  19. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780(2014).
  20. Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
  21. Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
  22. Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
  23. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  24. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
  25. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FACS EAK A G EpCAM
تعزيز 3-D تجميع الخلايا FACS تنقية التوتة طلائي مع EAK 16-II / EAKIIH6 الذاتي تجميع هيدروجيل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.