في هذا البروتوكول، ونحن تقديم الإجراءات في تأسيس العضلي ضمور 1 نماذج بالخلايا العضلية الجذعية، بما في ذلك تحسين صيانة C2C12 الخلية، ترنسفكأيشن الجينات / التنبيغ، والتمايز العضلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نمذجة العضلي الضمور 1 في خلايا C2C12 بالخلايا العضلية الجذعية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العضلي ضمور 1 (DM1) هو شكل شائع من الضمور العضلي. على الرغم من أن وضعت عدة نماذج حيوانية لDM1، ونماذج خلية بالخلايا العضلية الجذعية لا تزال مهمة لأنها توفر بديلا الخلوي فعال لدراسة الأحداث الخلوية والجزيئية. على الرغم من الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية C2C12 استخدمت على نطاق واسع لدراسة تكون العضل، ومقاومة للترنسفكأيشن الجينات، أو تنبيغ الفيروسية، يعيق البحوث في الخلايا C2C12. هنا، نحن تصف بروتوكول الأمثل الذي يتضمن إجراءات الصيانة اليومية، ترنسفكأيشن والتنبيغ لإدخال الجينات إلى myoblasts C2C12 وتحريض التمايز العضلية. بشكل جماعي، وتمكن هذه الإجراءات أفضل الكفاءات ترنسفكأيشن / تنبيغ، فضلا عن نتائج المفاضلة متسقة. بروتوكول صفها في إنشاء DM1 نماذج الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية يمكن أن تستفيد الدراسة من الضمور العضلي، فضلا عن غيرها من أمراض العضلات.
المقدمة
العضلي الضمور (DM) هو مرض وراثي جسمي قاهر التي تؤثر على أنظمة متعددة، وأهمها القلب والهيكل العظمي العضلات 1. هناك نوعين من هذا المرض، DM1 وDM2. DM1 هو أكثر شيوعا، ولها مظهر أكثر شدة من DM2 2. الطفرة الوراثية الكامنة DM1 هو التوسع في تكرار ثلاثية CUG تقع في منطقة غير مترجمة 3 '(UTR) من DM بروتين كيناز الجين (DMPK) 3. عدد CUG تكرار في الأفراد تتأثر يختلف من 5 إلى 37. في المقابل، ترتفع إلى أكثر من 50 عاما، وأحيانا تصل إلى الآلاف في المرضى الذين يعانون DM1 4. ونتيجة لذلك، والبروتينات ملزم RNA، مثل muscleblind مثل 1 (MBNL1)، CUGBP، وElav مثل العائلة 1 (Celf1)، هي misregulated. بسبب الح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. C2C12 خلية ثقافة
- الحفاظ على myoblasts الماوس C2C12 في لوحة 100 ملم في وسط النمو (المتوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM)) تستكمل مع 20٪ مصل بقري جنيني، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و2 مم L-الجلوتامين. السماح C2C12 خلايا passaged لتصبح حوالي 50 - 60٪ متموجة.
- تجاهل متوسطة النمو وغسل خلايا C2C12 مع المالحة الفوسفات-3 مل درجة حرارة الغرفة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA لفصل الخلايا. وضع لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
و transfected خلايا C2C12 مع GFP-CUG5 أو GFP-CUG200. بعد اختيار مقاومة المخدرات، تم إنشاء مجمعات مستقرة، والتي يمكن أن تصور من قبل التعبير GFP (الشكل 1A). تم الكشف عن تشكيل myotube مركزيا في myoblasts متباينة من قبل الميوسين السلسلة الثقيلة المناعية 10 (الشكل 1B). أظهر الكمي لتشكيل myotube مركزيا أن مؤشرات الاندماج وانخفضت من 35.4 ± 4.1٪ إلى 2.6 ± 1.1٪ وكانت انخفضت المناطق myotube مركزيا من 35.6 ± 2.2٪ إ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد تم استخدام خط الخلية C2C12 كنموذج لدراسة تكون العضل 11-14. هذه الخلايا تحتفظ نظرة تشبه الخلايا الليفية، تتكاثر بسرعة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 20٪ الجنين المصل البقري والتفريق بسهولة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 2٪ مصل الخيول 15. نمو سريع والتمايز هي الخصائص مفيدة في نموذج خلية تكون العضل. هنا، ونحن لشرح استخدام البلازميد، فيروسات، وناقلات lentiviral لتقديم كدنا]، 3'-UTR، وshRNA إلى خلايا C2C12. ويسلط الضوء على النقاط الحرجة لترنسفكأيشن / تنب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر الدكتورين توم كوبر من كلية بايلور للطب ، وماني س. ماهاديفان من جامعة ويسكونسن ماديسون ، وديدييه ترونو من جامعة جنيف على الكواشف. يتم دعم هذا العمل من قبل صندوق بدء التشغيل بجامعة هيوستن (YL) ، ومنحة جمعية القلب الأمريكية (YL ، 11SDG5260033) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (XP ، 81460047).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM ، تقنيات الحياة عالية الجلوكوز | 11965-084 | للثقافة المتوسطة | |
| مصل الأبقار الجنينية - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | للثقافة المتوسطة |
| البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامين (100x) Life | Technologies | 10378-016 | للثقافة المتوسطة |
| الأنسولين من البنكرياس البقري | Sigma Aldrich | I6634-100MG | ل التمايز متوسط |
| مصل الخيول | أتلانتا البيولوجية | S12150 | لوسط التمايز |
| FuGENE ؛ كاشف التعداء عالي الدقة | Promega | E2311 ؛ | للتعداء |
| G418 كبريتات | التكنولوجيا الحيوية الذهبية | G-418-10 | للاختيار المقاوم للأدوية |
| بوروميسين ثنائي هيدروكلوريد | سيجما ألدريتش | sc-108071 | للاختيار المقاوم للأدوية |
| NuPAGE Novex 4 - 12٪ هلام البروتين Bis-Tris ، 1.0 مم ، 15 بئر | Life Technologies | NP0323BOX | للبقعة الغربية |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Technologies | NP00061 | للبقعة الغربية |
| NuPAGE MES SDS تشغيل العازلة (20x) | Life Technologies | NP0002 | للبقعة الغربية |
| Amersham Protran مدعومة 0.2 NC ، 300 مم × 4 م | 10600015 علوم الحياة للرعاية الصحية | GE للبقعة الغربية | |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | الأساسي Ab لتلطيخ |
| الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، تكساس ريد-إكس المترافق | ثيرمو فيشر العلمي | T-862 | الثانوي Ab ل التلوين المناعي |
| خطوة واحدة qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | ل qRT-PCR |
| TriPure عزل كاشف | Roche | 11667165001 | لعزل الحمض النووي الريبي |
| CUG-BP1 الجسم المضاد (3B1) | سانتا كروز | SC-20003 | الابتدائي Ab Western blot |
| الأجسام المضادة الأكتين | سانتا كروز | sc-1615 | الماعز متعدد النسيلة IgG للتحكم في التحميل |
| 293T Ecopack | خلايا 631507 Clontech | لإعداد الفيروسات القهقرية | |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | ناقل فيروسات قهقرية فارغ لإعداد الفيروسات القهقرية |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | المنزل | غير متوفر | ترميز ناقلات الفيروسات القهقرية Celf1Flag ، تستخدم في تحضير الفيروسات القهقرية |
| هدية psPAX2 | من ديدييه ترونو | غير | متوفرة لإعداد الفيروسات العنقية |
| pMD2.G | من ديدييه ترونو | غير متوفرة | لإعداد فيروس العدسات |
| GFP-CUG5 | من MS Mahadevan | غير | متوفرة التفاصيل في المرجع 10 ؛ |
| GFP- هدية CUG200 | من MS Mahadevan | غير متوفرة | التفاصيل في المرجع 10 ؛ |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | للتلوين المناعي |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | للتلوين المناعي |
| TWEEN ؛ 20 | سيجما ألدريتش | P9416 | للتلوين المناعي |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | للتلوين المناعي |
المراجع
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
