يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (DRG) المعزولة من الفئران وثقافة الخلايا العصبية DRG على نظام زراعة الخلايا الممتدة مسبقا لتعزيز محاذاة المحاور العصبية ، مع الزراعة المشتركة اللاحقة لخلايا شوان (SCs) لتعزيز تكوين النخاع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مدخل لتعزيز التوافق وتكون الميالين في ظهري الجذر العقدة العصبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تجديد المحور العصبي هو عملية فوضوية ترجع إلى حد كبير إلى محاذاة المحاور العصبية غير المنظمة. لذلك ، من أجل وجود عدد كاف من المحاور المتجددة لجسر موقع الآفة ، يلزم إجراء محاذاة محورية منظمة بشكل صحيح. نظرا لأن إزالة الميالين بعد إصابة الأعصاب يضعف بشدة القدرة التوصيلية للمحاور الباقية ، فإن إعادة الميالين أمر بالغ الأهمية لنجاح عمل الأعصاب المتجددة. في السابق ، أظهرنا أن الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) محاذاة على سطح متباين الخواص المستحث قبل التمدد لأن الخلايا يمكن أن تشعر بصلابة فعالة أكبر في الاتجاه الممتد منها في الاتجاه العمودي. أظهرنا أيضا أن السطح متباين الخواص الناشئ عن سطح ميكانيكي ممتد مسبقا يؤثر بالمثل على المحاذاة ، وكذلك نمو وتكوين النخاع للمحاور. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإعداد سطح متباين الخواص ممتد مسبقا ، وعزل وثقافة الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (DRG) على سطح ممتد مسبقا ، ونظهر سلوك الميالين للثقافة المشتركة للخلايا العصبية DRG مع خلايا شوان (SCs) على سطح ممتد مسبقا.
المقدمة
في الإصابات العصبية، وغالبا ما يمنعون جذوعها الداني والقاصي العصبية من إعادة تنظيم مباشرة من كراسات العصبية نظرا لموقع الآفة 1-2. عادة، تتكون مساحات محور عصبي حزم أمر غاية والانحياز من المحاور، والتي تشكل شبكات معقدة من الاتصال. ومع ذلك، وتجديد الأعصاب هو عملية الفوضى بسبب سوء التنظيم محور عصبي محاذاة 3-4. لذلك، لتوليد عدد كاف من تجديد المحاور التي ردم موقع الآفة، فمن الضروري للحث على محاذاة محور عصبي منظمة تنظيما جيدا. بالإضافة إلى ذلك، إزالة الميالين يصاحب الإصابات العصبية بسبب موت الخلايا myelinating في موقع الإصابة. منذ إزالة الميالين يضعف بشدة قدرة موصلة للبقاء محاور وعلاجات تستهدف إزالة الميالين أو ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافق جميع الإجراءات لعزل الخلايا عن طريق لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ولاية ميشيغان.
1. إعداد امتدت قبل سطح متباين الخواص
- خلط 10: حل 1 من قاعدة وكيل علاج ويصب الخليط في صحن زراعة الأنسجة (12 سم القطر). استخدام 4900 قاعدة ملغ و 490 ملغ وكيل علاج لمجموع خليط يشابك.
- الحفاظ على مزيج هلام في ظل فراغ لمدة 20 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
- ضع الخليط جل في الفرن لعلاج بين عشية وضحاها ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
النظام امتدت ما قبل زراعة الخلايا الترويج DRG محوار محاذاة 10. ومثقف الخلايا العصبية DRG على السطوح قبل امتدت وغير المتمدد لمدة 12 يوما. كانت ملطخة محاور لβ-III تويولين لإثبات اتساقها الشكل 2 يقارن التوجه محور عصبي على ركائز PDMS قبل امتدت وغير المتمدد بعد 12 يوما من الثقافة. المحاور DRG محاذاة موازية لاتجاه امتدت، في حين أنها أظهرت محاذاة عشوائية وشكل شبكة مترابطة على الركيزة PDMS غير المتمدد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
للحث على محاذاة محوار على سطح امتدت مسبقا، هناك نوعان من الخطوات الحاسمة: 1) يجب أن يكون غشاء PDMS مسطحة وسمك متجانس. و2) يجب إزالة الخلايا الدبقية من DRG. بعد خلط PDMS وcrosslinker وعلاج في الفرن، يجب أن تبقى جل PDMS crosslinked على قمة مقاعد البدلاء شقة والتعامل معها بعناية لتجنب أي إمالة. وينبغي أن يتبع العلاج الأكسجين البلازما الغشاء PDMS في غضون 6 ساعة بواسطة PLL طلاء، منذ hydrophilicity من السطح (مطلوب لمرفق الخلية) بعد العلاج البلازما خفف على مر الزمن. منذ يتم تطبيق العلاج .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للإفصاح عنهم.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر اريك فاسكو لمساعدته في إعداد ركائز PDMS، الدكتور Shiyong وانغ في مختبر الدكتور مرسى ماتا في جامعة ميشيغان للحصول على اقتراحات مفيدة والتدريب من العزلة DRG، والدكتور مارك Tuszynski والدكتور دبليو ماري كامبانا في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو للحصول على اقتراحات مفيدة وبروتوكول لعزل SC. وأيد هذه الدراسة في جزء من مؤسسة العلوم الوطنية (CBET 0941055 وCBET 1510895)، والمعهد الوطني للصحة (R21CA176854، R01GM089866، وR01EB014986).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المتوسط العصبي القاعدي 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| مكمل B27 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| عامل نمو الأعصاب-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| البنسلين الستربتومايسين | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05٪ Trypsin-EDTA / 1 ملي مولار EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01< / a> | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| أردين | سيجما | U3003 | |
| هانك s محلول الملح المتوازن (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | العازلة العازلة |
| من النوع الأول كولاجيناز | ورثينجتون | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| مصل الجنين البقري المعطل | بالحرارة Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| غرفة السيليكون | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| نظام تنظيف / نقش البلازما | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 الجسم المضاد | سيجما- ألدريتش | M7898 | |
| الأرانب التكميلية | سيجما- ألدريتش | S-7764 | |
| وسط | النمو القياسيللحصول على 500 مل من Neurobasal Medium 1x ، أضف 10 مل من B-27 50x ، و 5 مل من Glutamax-I 100x ، و 2.5 مل من البنسلين / الستربتومايسين (Penn / Strep) ، و 1 مل من Albumax-I ، و 1 & mu ؛ ل من NGF - 7S (50 & mu ؛ جم / مل). | ||
| مخزون FDU Uridine | FDU 100 ملغ في 10 مل من ddH2< / sub>O (10 مجم / مل) ، مرشح في غطاء محرك السيارة ومقسمة إلى 500 & ل aliquots وتخزينها في -20 & C. Uridine 5 g في 166.7 مل من ddH2< / sub>O (33 ملغ / مل) ، مرشح في غطاء محرك السيارة ، يقسم في 200 مو ؛ ل aliquots وتخزينها في -20 & °C. خذ 61.5 مو ؛ لتر من FDU (10 ملغ/مل) و 20.5 مو ؛ ل من Uridine(33 ملغ/مل), وإضافة 4,918 & mu; ل من ddH2< / sub>O إلى تركيز المخزون النهائي ، ثم قسمها إلى 1 مل من الكميات وتخزينها عند -20 درجة مئوية. |
المراجع
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
