نصف طريقة مستهدفة قائمة على تسلسل الحمض النووي الريبي تتضمن إعداد مكتبات (كدنا) المفهرسة ، والتهجين والالتقاط باستخدام مجسات مخصصة وتحليل البيانات لاستجواب النصوص المختارة للتعبير الجيني والطفرات واندماج الجينات. يسمح RNAseq المستهدف بتقييم سريع وفعال من حيث التكلفة للنصوص المحددة على جهاز التسلسل المكتبي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استهدفت RNA تسلسل الفحص لتحديد خصائص التعبير الجيني والجينوم التعديلات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
RNA تسلسل (RNAseq) هو أسلوب متعدد الاستعمالات التي يمكن أن تستخدم لكشف وتميز التعبير الجيني، والطفرات، اندماج الجينات، والرنا غير المرمزة noncoding الموجودة. يتطلب معيار RNAseq 30-100٬000٬000 التسلسل يقرأ ويمكن أن تشمل المنتجات RNA متعددة مثل مرنا والرنا غير المرمزة noncoding الموجودة. نحن لشرح كيفية RNAseq استهدافا (التقاط) يسمح دراسة مركزة على المنتجات RNA المحدد باستخدام المنظم سطح المكتب. القبض على RNAseq يمكن توصيف النصوص غير المشروحة، منخفضة، أو التعبير عابر التي قد لا تكتشف بطريقة أخرى باستخدام أساليب RNAseq التقليدية. نحن هنا وصف استخراج الحمض النووي الريبي من خطوط الخلايا، واستنزاف الحمض النووي الريبي الريباسي، والتوليف [كدنا]، وإعداد مكتبات barcoded والتهجين والتقاط النصوص المستهدفة وتسلسل تعدد الإرسال على المنظم سطح المكتب. نحن أيضا الخطوط العريضة للخط أنابيب التحليل الحسابي، والذي يتضمن تقييم ومراقبة الجودة، والمحاذاة، والكشف عن الانصهار، وتحديد الجينات وتحديد مجلس التوحيد الوطنى واحدالمتغيرات leotide. هذا الاختبار يسمح لتسلسل النص المستهدف لتوصيف التعبير الجيني، اندماج الجينات، والطفرات.
المقدمة
تسلسل النسخ الكامل أو الحمض النووي الريبي (RNAseq) هي طريقة تسلسل غير متحيزة لتقييم جميع منتجات الحمض النووي الريبي. الهدف من RNAseq (الالتقاط) المستهدف هو تقييم مركز للنصوص المختارة ذات الحساسية المتزايدة والنطاق الديناميكي والتكلفة أو الحجم المنخفض وزيادة الإنتاجية مقارنة ب RNAseq القياسي. على غرار RNAseq القياسي ، يمكن استخدام أساليب التخصيب المستهدفة لتقييم التعبير الجيني ، وأنواع الحمض النووي الريبي المتعددة مثل mRNA ، و microRNA (miRNA) ، و lncRNA1 ، و RNAs الأخرى غير المشفرة2 ، واندماج الجينات3 ، والطفرات4-6.
يتضمنCapture تهجين قليل النوكليوتيدات التكميلية لإثراء مكتبات (كدنا) للتسلس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تجهيز وقت واحد وتحليل أربع عينات. هذا الأسلوب هو متوافق مع الحمض النووي الريبي معزولة عن الخلايا والأنسجة المجمدة الطازجة والأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE). يبدأ هذا البروتوكول مع 50 - 1000 نانوغرام (250 نانوغرام موصى به) بدء إدخال الحمض النووي الريبي لكل عينة.
1. الريباسي استنفاد والتفتت الداخلي RNA
- الريباسي استنفاد
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد الخطوات الرئيسية التخطيطي تسليط الضوء في التقاط RNAseq في الشكل 1. واستخدمت أربعة خطوط الخلايا السرطانية مع الطفرات المعروفة لإثبات فعالية تقنية RNAseq القبض على (K562 مع ABL1 الانصهار، LC2 مع الانصهار RET، EOL1 مع PDGFRalpha الانصهار وRT- 4 مع FGFR3 الانصهار). وكان يتم تجميع العينات الأربع معا، والتسلسل مع 2X يقرأ 100 نقطة أساس على المنظم سطح المكتب، والذي يولد ملفات FASTQ. تم تشغيل ملفات F.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
RNAseq التقاط هو استراتيجية متوسطة بين RNAseq وميكروأري نهج لتقييم والجزء المحدد من Transcriptome على. وتشمل مزايا القبض على التكلفة والوقت تحول سريع تخفيض على المنظم سطح المكتب، إنتاجية عالية، والكشف عن التعديلات الجينوم. ويمكن تكييف طريقة لوصف الرنا غير الترميز 23، كشف النووية المنفردة المتغيرات 4-6 وفحص الحمض النووي الريبي الربط، وتحديد اندماج الجينات أو إعادة ترتيب الهيكلية 24. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا النهج في العينات السريرية أو المصنعة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تتلقى س.ر. تمويلا من شركة نوفارتيس وأرياد للأدوية لإجراء التجارب السريرية. يمتلك أفراد الأسرة المباشرون أسهما في جونسون آند جونسون.
شكر وتقدير
نقدم شكرا خاصا لعزرا ليون وإليوت تشو وميشيل وينج وإسكو كاوتو وإريك سامورودنيتسكي على الدعم الفني. نود أيضا أن نشكر جيني باديلو على دعمها الإداري لفريقنا. نحن نقدر مركز أوهايو للكمبيوتر العملاق (OSC) لتوفير مساحة القرص وسعة المعالجة والدعم لإجراء تحليلاتنا. نشكر مركز السرطان الشامل (CCC) في مركز ويكسنر الطبي بجامعة ولاية أوهايو على دعمهم الإداري لهذا العمل. SR وفريقهم مدعومون من قبل جمعية السرطان الأمريكية (MRSG-12-194-01-TBG) ، وجائزة الباحث الشاب لمؤسسة سرطان البروستاتا ، و NHGRI (UM1HG006508-01A1) ، ومؤسسة فور لأبحاث السرطان ، وجمعية الرئة الأمريكية ، وبيلوتونيا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| جهاز طرد مركزي 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| البيولوجيا الجزيئية الصف الإيثانول | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 × 1.5 مل | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300- دورات) | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Kit مع RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen & reg ؛ Oligo الحجب العالمي - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen & reg ؛ الحجب العالمي أوليغو - TS-p7 (6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen & reg ؛ Oligo الحجب العالمي - TS-p7 (8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt & reg ؛ AMPure® XP - حبات تنقية PCR | بيكمان كولتر | A63880 | |
| Dynabeads & reg; M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT الحمض النووي البشري ، درجة الفلورومترية ، 1 ملغ | روش للعلوم | التطبيقية 05480647001 | |
| Qubit & reg ؛ أنابيب الفحص | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit & reg dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap & reg ؛ مجموعات التهجين والغسيل EZ (24 أو 96 تفاعلا) | روش NimbleGen | 05634261001 أو 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 × 2 مل IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Nuclease Free Water | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch & Trade ؛ Cycler الحراري مع 96 &ndash ؛ وحدة المستقيم السريع | جيدا Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ مجموعات التهجين والغسيل | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μ ل | تقنيات الحياة | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 مل | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| RNA ScreenTape سلم | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| RNA ScreenTape عينة العازلة | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيجما | 72068-100 مل | |
| DynaBeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 SIDE EACH | Life Technologies | 12331D | |
| Chloroform | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| NanoDrop 2000 مقياس الطيف | الحراري العلمي | ||
| My Block Mini Dry | Bath Benchmark | BSH200 | |
| D1000 الكواشف | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
المراجع
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
