مقالة منهجية

إزالة المواد من مصادر خارجية من الجزء الخارجي من النوى المجمدة للتحقيق في المجتمعات القديمة البيولوجية آوى داخل

8.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54091

⸱

يوليو 3, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

في هذه المقالة

ملخص

يوفر الغلاف الجليدي الوصول إلى الكائنات الحفاظ عليها التي لا تزال قائمة في ظل ظروف بيئية الماضية. ويرد بروتوكول لجمع وتطهير النوى الجليد السرمدي من التربة والجليد. غياب المستعمرات الخارجية والحمض النووي تشير إلى أن الكائنات الحية الدقيقة الكشف تمثل المواد، بدلا من التلوث الناجم عن الحفر أو المعالجة.

الملخص

يوفر الغلاف الجليدي الوصول إلى الكائنات الحية المحفوظة التي استمرت في ظل الظروف البيئية السابقة. في الواقع ، يمكن أن تعكس هذه المواد المجمدة الظروف على مدى فترات زمنية طويلة ، ويمكن أن يوفر التحقيق في المواد البيولوجية الموجودة في الداخل نظرة ثاقبة للبيئات القديمة. لتحليل هذه النظم البيئية بشكل مناسب واستخراج معلومات بيولوجية ذات مغزى من التربة المتجمدة والجليد ، من الضروري جمع العينات المجمدة ومعالجتها بشكل مناسب. هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص لتحليلات الميكروبات والحمض النووي لأن المجتمعات الموجودة قد تكون مختلفة بشكل فريد عن المجتمعات الحديثة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لجمع النوى المجمدة وتطهيرها بنجاح. يشير كل من غياب المستعمرات المستخدمة لمخدر السطح الخارجي والحمض النووي الخارجي إلى أننا نجحنا في تطهير النوى المجمدة وأن الكائنات الحية الدقيقة المكتشفة كانت من المادة ، بدلا من التلوث الناتج عن حفر النوى أو معالجتها.

المقدمة

الغلاف الجليدي (على سبيل المثال، والتربة دائمة التجمد، ملامح الجليد والثلوج الجليدية، فيرن، والجليد) تعطي لمحة عن أنواع الكائنات الحية استمرت في ظل ظروف بيئية الماضية. وبما أن هذه ركائز يمكن أن يكون عشرات ومئات الآلاف من السنين القديمة ومجتمعاتهم الميكروبية، عندما حفظت مجمدة منذ الترسيب، وتعكس الظروف البيئية القديمة. لتحليل هذه النظم الإيكولوجية بشكل مناسب واستخراج المعلومات البيولوجية ذات مغزى من التربة المجمدة والجليد، وجمع الصحيح وتجهيز العينات المجمدة من الضروري. هذا هو من أهمية قصوى كما الإسقاطات المناخية للقرن الحادي و21 تشير إلى احتمال ارتفاع درجة الحرارة وضوحا في المناطق القطبية الشمالية ومناطق القطب الشمالي الفرعية 1. على وجه التحديد، من المتوقع لتدفئة حوالي 5 درجات مئوية و 7 درجات مئوية، على التوالي بحلول عام 2100 2،3 ألاسكا الداخلية وغرينلاند. ومن المتوقع أن تؤثر بشكل كبير على التربة والمجتمعات الميكروبية المائية، وبالتالي، يرتبط هذاالعمليات البيولوجية الكيميائية. ومن المتوقع أن يبدأ تدهور الأراضي دائمة التجمد في العديد من المجالات 2-5 مما قد يؤدي إلى سمكا، إذابة موسميا (نشط) طبقة 6،7، وذوبان التربة المجمدة، وذوبان الجليد الهيئات الضخمة مثل ارتفاع درجات الحرارة وهطول الأمطار النظام تغير الجليد الأرضي، أسافين الجليد، وفصل الجليد 8. هذا من شأنه أن يحدث تغييرا هائلا في الصفات البيولوجية الكيميائية بالإضافة إلى التنوع البيولوجي للنباتات والحيوانات في هذه النظم الإيكولوجية.

الجليد الجليد وsyngenetic الرواسب دائمة التجمد والجليد ميزات قد حوصر الأدلة البيولوجية للبيئة تمثل ما عاش هناك في ذلك الوقت ملامح شكلت الكيميائية و. على سبيل المثال، في ولاية ألاسكا الداخلية، سواء Illinoisan ويسكونسن الذين تتراوح أعمارهم بين الجليد الدائم والحاضر وهذا الجليد الدائم على وجه الخصوص يوفر مواقع فريدة من نوعها تعود من الحديث إلى 150،000 سنة قبل الوقت الحاضر (YBP) التي تحتوي على الأدلة البيولوجية والجيوكيميائية من السلطة الإسرائيليةط م من التغيرات المناخية الماضية على التنوع البيولوجي. ونتيجة لذلك، توفر هذه الرواسب سجل من البيوجيوكيميائية والتنوع البيولوجي على امتداد آلاف السنين. منذ المنطقة لديها معدلات ترسيب منخفض، ولم يكن الجليدية، والعينات دون عائق يمكن الوصول إليها لجمع وتحليل، إما الحفر رأسيا في التربة أو الحفر أفقيا في الأنفاق. الأهم من ذلك، سجلات واسعة موجودة التي تبرز خصوصا الميزات البيولوجية الكيميائية الفريدة من الجليد في هذه المنطقة 9-14. على وجه التحديد، وتطبيق تحليل الحمض النووي لتقدير وجود ومدى التنوع البيولوجي في كل من عينات الجليد والتربة المتجمدة موجودة وقديمة يتيح استكشاف الربط بين الظروف البيئية القديمة والسكن للاحتلال من قبل كائنات محددة.

وقد حددت الدراسات السابقة التأثيرات المناخية على الثدييات والنباتات والكائنات الحية الدقيقة من عينات تعود إلى 50K YBP 11، 15-19، على الرغم من كل دراسة استخدمت احمنهجية الإقليم الشمالي لجمع وتطهير التربة المتجمدة أو الجليد النوى. في بعض الحالات، تم تعقيمها النوى حفر 16، 20-21، على الرغم من أن منهجية محددة لم توضح ما إذا كانت الأحماض النووية الأجنبية ألغيت أيضا من العينات. في دراسات أخرى، بكتيريا يعزل 15 (على سبيل المثال، السراتية الذابلة) وكذلك المجهرية الفلورسنت 22 استخدمت لقياس مدى فعالية إجراءات إزالة التلوث.

وكانت هذه التجربة جزءا من دراسة أكبر التحقيق المجتمعات الميكروبية من عينات التربة المتجمدة التي يعود تاريخها إلى ما يقرب من 40K YBP. وكان الهدف المحدد لهذا الجزء من الدراسة لتطهير الثلج والجليد السرمدي النوى بنجاح. على حد علمنا، لا يوجد لديه منهجية متكاملة لاستخدام حلول تهدف إلى القضاء على الأحماض النووية الأجنبية وnucleases المرتبطة من الجزء الخارجي من النوى المجمدة. هذا على الرغم من حقيقة أن هذه الحلول هي commonlذ استخدامها لتطهير معدات المختبرات لإجراء التجارب الجزيئية.

مرة واحدة تم تطهير النوى، تم استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام البروتوكولات التي وضعتها غريفيث وآخرون. 23 وتووي وآخرون. 24، كميا باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وتضعف مع الماء المعقم، وخالية من الحمض النووي لتحقيق 20 نانوغرام في رد الفعل. وتضخمت البكتيرية الجينات 16S الريباسي مع الاشعال 331F و797R وسبر BacTaq 25 و 16S archaeal وتضخمت الريباسي الجينات مع الاشعال قوس 349F وقوس 806R وتحقيق TM قوس 516F 26 وفقا للشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 600 ثانية تليها 45 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 57 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 25 ثانية مع التمديد النهائي عند 40 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. وأجريت جميع ردود الفعل QPCR في نسختين. شملت 20 مجلدا رد فعل ميكرولتر 20 نانوغرام الحمض النووي، و 10 ميكرومتر الاشعال، 5 ميكرومتر لجنة التحقيق، و 10 ميكرولتر من مزيج رد فعل QPCR. معايير FOص البكتيرية وarchaeal QPCR تم إعدادها باستخدام الحمض النووي الجيني من الزائفة المتألقة وملحاء عصوية ملحية، على التوالي. كانت تزرع على حد سواء لتسجيل المرحلة. أجريت التهم لوحة وتم عزل الحمض النووي من الثقافات. وكان كميا الجينوم الحمض النووي مع معمل مع افتراض واحد وستة نسخ من الجين 16S الريباسي في الجينوم له. salinarum و P. المتألقة، على التوالي 27-28. حسبت أعداد نسخة من الجينات البكتيرية وarchaeal على أساس منحنى قياسي، سجل حولت لحساب الفروق غير المتكافئة بين العلاجات، والمقررة من قبل ANOVA.

تم تحديد تكوين المجتمع من خلال تسلسل الجينات 16S الريباسي باستخدام خلايا تدفق والتكنولوجيات تضخيم الجسر وتحليل المجتمعات مع "رؤى الكمي في البيئة الميكروبية" (QIIME) 29. إلى الأمام وعكس يقرأ وانضم معا ثم تسلسل تم تصفيتها، فهرسة،وتم اختيار ممثلي ذات جودة عالية لدي نوفو الوحدات التصنيفية التشغيلية (اتو) التعيين من خلال تسلسل المحاذاة مع قاعدة بيانات مرجعية. وتمت مقارنة تسلسل الانحياز إلى قاعدة بيانات مرجعية مستقلة للتعيين التصنيفية. تم إنشاء جدول OTU مستوى الأسرة في اللغات لتحديد تكوين المجتمع العام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد المعدات والجليد المستديمة مجموعة كور

  1. إعداد المعدات وجمع العينات الميدانية والعتاد المحافظة
    1. تجميع اوجير لجمع العينات عن طريق إدخال محول محرك الأقراص في أعلى للبرميل وتناوب على رافعة لقفل في مكانه. دبوس أنبوب محول على محول محرك الأقراص ويعلقون المحرك على الأنبوب محول. تضاف قطع على برميل.
    2. ارتداء سترات خفيفة واجب، قفازات النتريل، وأقنعة للحد من أي تلوث للعينات. ارتداء حماية الأذن وقبعة الثابت للسلامة عند دخول الجليد المستديمة نفق (الشكل 1).
    3. دخول النفق وحدد موقعا لجمع العينات (الشكل 1B).
      ملاحظة: للحصول الرأسي أو الأفقي موقع الحفر، حدد المنطقة التي توجد المعروف دليلا على أن مادة يتم تجميد (على سبيل المثال، الثلج أو الجليد الدائم)، لا توجد أنظمة جذر كبيرة معروفة، وليس هناك الحصى معروف. حذف الكلالذين يعيشون المواد النباتية من المنطقة قبل جمع العينة. إذا الحفر رأسيا أو أفقيا، حدد المنطقة التي هي شقة نسبيا ويمكن الوصول إليها مع اوجير.
    4. إعداد محطة العمل من قبل طبقات الأرض مع المواد البلاستيكية التي تم تعقيمها مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
    5. وضع 10 سم القطر البولي فينيل كلوريد (PVC) قطع أنبوب في نصف بالطول على محطة العمل لتوفير حوض لعقد النوى كما يتم إزالتها من البريمة. تطهير الأنابيب البلاستيكية مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
    6. بالقرب من محطة عمل، تطهير اوجير عن طريق الرش مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث. إزالة الحلول من اوجير مع القضاء.
  2. الثلج والجليد السرمدي جمع الأساسية والتخزين
    1. حدد مساحة من الجدار لعينة (انظر 1.2.1ملاحظة).
    2. تطهير ما يقرب من 10 قطرها سم من منطقة الجدار المجمدة من قبل القضاء عليه مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
    3. رفع اوجير تطهير للمنطقة من الفائدة بحيث يكون عموديا على منطقة العينة وتبدأ الحفر في الوجه وتنظيفها من الجدار (الشكل 1C، D).
    4. إزالة بعناية اوجير من منطقة جمع العينات. فصل اوجير من المحرك ووضع اوجير فوق الأنابيب البلاستيكية المعقمة في محطة عمل نظيفة. بعناية إمالة اوجير بحيث النوى المجمدة تنزلق على الأنابيب البلاستيكية المعقمة (الشكل 1E).
    5. تطهير قفازات مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
    6. التقاط الثلج والجليد السرمدي النوى مع قفازات معقمة ووضعها في أكياس معقمة.
    7. وضع النوى في غرفة برودة أو باردة حتى يتم شحنها أو معالجتها.
    8. الشيخالملكية الفكرية النوى المجمدة باستخدام الثلج الجاف للحفاظ عليها عند درجة حرارة أقل من 0 درجة مئوية.
    9. على الفور تخزين النوى في -80 درجة مئوية.

2. الجليد المستديمة والجليد المعالجة الأساسية

  1. تحضير المواد
    1. إعداد عقيمة، النووي حمض الحرة الثقيلة رقائق الألومنيوم، ورفوف معدنية، والأواني الزجاجية، الملقط المعدني، والصوف الزجاجي من الخبز في الفرن على 450 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. نقض هذه المواد حتى استخدامها.
    2. تعقيم 95٪ من الإيثانول والماء عالى النقاء عن طريق تمرير الحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
    3. حل الإيثانول مخزن في -20 درجة مئوية والمياه في 4 درجات مئوية.
    4. تعقيم حاكم البلاستيك عن طريق الرش مع الايثانول 70٪، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وحل ريبونوكلياز إزالة التلوث والقضاء على الفور بعد كل حل.
  2. إعداد الثقافة البكتيرية
    1. إعداد مرق ولوحات لزراعة السراتية الذابلة.
      1. للمرق، والجمع بين 5 ز المحاولةptone، 1 غرام جلوكوز، 5 ز خلاصة الخميرة، و 1 غرام فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة، والماء ثم يضاف المقطر ليصل إلى 1 L. لجعل لوحات، إضافة 15 غراما من أجار إلى المزيج أعلاه. للمرق ولوحات، وضبط درجة الحموضة إلى 7 والأوتوكلاف على 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. إعداد 1X الفوسفات مصقول المالحة حل (PBS) من خلال الجمع بين 8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام من كلوريد البوتاسيوم، 1.44 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم، و 0.24 غرام البوتاسيوم الفوسفات أحادي القاعدة وإضافة الماء المقطر لتصل إلى 800 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وإضافة الماء المقطر ليصل إلى 1 L. الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. تطعيم مرق مع حلقة عقيمة عن طريق غمس في س. ثقافة marcescens الذي سبق تخزينها في المجمد -80 درجة مئوية. تحت ظروف معقمة، مخفف المسلسل الثقافة عن طريق إضافة 1 مل من ثقافة إلى 9 مل من برنامج تلفزيوني ويدويا عكس الحل. إضافة 1 مل من هذا التخفيف إلى 9 مل من برنامج تلفزيوني ويدويا عكس الحل. كرر ثماني مرات أكثر حتى 10 -9 diluيتم التوصل إلى نشوئها.
    4. نشر 10 -6 و 10 -7 و 10 -8، و 10 -9 حلول على لوحات أجار عن طريق توزيع 1 مل من مرق على لوحة ونشر مع رش الخلية. هل هذا في ثلاث نسخ في التخفيف. تخزين الثقافة الأصلية في 4 درجات مئوية.
    5. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. حساب عدد من المستعمرات لحساب عدد الخلايا في الثقافة الأصلية. ملاحظة: إن عدد من المستعمرات في الثقافة الأصلية تعتمد على معدل نمو البكتيريا.
    6. الماصة 250 ميكرولتر من الثقافة الأصلية في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. تمييع الثقافة الأصلية بإضافة حجم ما يكفي من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على ما يقرب من 10 9 خلية / مل على النحو الذي يحدده عدد مستعمرة في الخطوة السابقة. بيليه الخلايا في أنبوب microcentrifuge بواسطة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: إن حجم برنامج تلفزيوني 1X تختلف تبعا لمعدل نمو البكتيريا.
    7. في biohood عقيمة، الماصة قبالة مرق و resuspend الخلايا في 1 مل 1X العازلة في برنامج تلفزيوني. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها أو ما يقرب من شهرين.
    8. في يوم من المعالجة، يخفف من س. ثقافة marcescens من الخطوة 2.2.7 عن طريق إضافة 1 مل من S. الأصلي ثقافة marcescens إلى 39 مل 1X العازلة في برنامج تلفزيوني في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
  3. إعداد مساحة الغرفة الباردة لنواة معالجة ومعدات المحافظة
    1. قبل تقشعر لها الأبدان الغرفة الباردة، والجدران نظيفة، والأرضيات، وطاولة معدنية مع محلول التبييض 1٪.
    2. درجة الحرارة مجموعة من غرفة باردة إلى حوالي -11 درجة مئوية.
    3. مرة واحدة وصلت الى غرفة باردة إلى درجة الحرارة المطلوبة، وارتداء ملابس خفيفة واجب، قفازات النتريل، وأقنعة للحد من أي تلوث إلى الغرفة الباردة والعينات.
      ملاحظة: يرجى ملء اثنين من أفراد يرتدون بشكل صحيح لهذا الإجراء.
    4. جلب المواد المعقمة (على سبيل المثال، رقائق الألومنيوم، ورفوف معدنية، والأواني الزجاجية، علبة، S. ثقافة marcescens، وميلشفرة crotome) والعينات في غرفة باردة ومكان على الطاولة العقيمة.
  4. دائمة التجمد ومعالجة لب الجليد في منشأة الغرفة الباردة
    1. وضع نواة الجليد الدائم على، ورقة الحمض النووي معقمة خالية من رقائق الألومنيوم.
    2. تطعيم بخفة خارج النواة مع ثقافة مخفف من س. marcescens باستخدام رغوة المكونات معقمة (الشكل 2B).
    3. وضع الأساسية على رف معدني معقم ويجلس فوق الدرج.
    4. تعقيم شفرة الفولاذ مشراح مع 70٪ من الإيثانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
    5. هل لديك الفردية والنتريل قفازات نظيفة مع الايثانول 70٪، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث وعقد الأساسية في زاوية 45 درجة فوق الدرج.
    6. يكون الفرد ب كشط بلطف حوالي 5 ملم من خارج الأساسية بالكامل، بما في ذلك الغايات، باستخدام شفرة معقمة بينما الفرد ويتحول جوهر بعد كل كشط ( أرقام 2C و 3A، B). مسح شفرة مع 70٪ من الإيثانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث حسب الحاجة.
    7. يكون الفرد ب صب فلتر تعقيم 95٪ من الإيثانول على جوهر بعناية وبسرعة، في حين الفردية ويحول الأساسية كما هو سكب محلول (أرقام 2D، 3C).
    8. يكون الفرد ب شطف فورا الأساسية مع المياه فلتر تعقيم.
    9. استبدال رف معدني المستخدمة في علبة مع رف معدني معقم الجديد.
    10. يكون الفرد وتنظيف له أو لها قفازات النتريل مع 70٪ من الإيثانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث وعقد جوهر بزاوية 45 درجة فوق الدرج.
    11. يكون الفرد ب رش الأساسية كامل مع محلول الحمض النووي إزالة التلوث.
    12. يكون الفرد ب شطف فورا الأساسية مع المياه فلتر تعقيم.
    13. يكون الفرد ب رش الأساسية كامل مع ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
    14. هل لديك Individuآل B شطف فورا الأساسية مع المياه فلتر تعقيم.
    15. وضع الأساسية على ورقة معقمة من رقائق الألومنيوم والتفاف على محمل الجد.
  5. اللب الخارجي ذوبان
    1. وضع رف معدني معقم على طبق زجاجي معقم في biohood العقيمة مع تدفق الصفحي.
    2. وضع اثنين من لوحات أجار محددة لس. marcescens في طبق زجاجي تحت رف معقم لجمع السائل من جوهر (الشكل 2E).
    3. وضع الأساسية على رف معدني معقم.
    4. سمحت تقريبا 2-5 ملم من السطح الخارجي الأساسية لذوبان الجليد في 23 ° C (في المتوسط، وهذا سوف يحدث في حوالي 10 دقيقة). تحويل جوهر ما يقرب من 90 درجة في كل دقيقة 2.
    5. مسحة كامل سطح الأساسية باستخدام ملقط معقم وصوف زجاجي معقم وتطعيم اثنين من لوحات أجار الخاصة S. marcescens عن طريق المسح هذه المواد على سطح اللوحات. تطعيم اثنين من لوحات جديدة مع الثقافة الأصلية المستخدمة لمخدر خارجالأساسية، التي تعرضت لدرجات حرارة منخفضة من الغرفة الباردة.
    6. قياس الأبعاد الخارجية للالأساسية أسطواني إذابة عن طريق وضع حاكم عقيم القريب، ولكن لا لمس الأساسية.
    7. وضع الأساسية في كيس معقم كبيرة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  6. تحقق للنمو
    1. احتضان لوحات أجار في 23 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
    2. دراسة لوحات أجار لنمو س. المستعمرات marcescens.
      1. إذا لم تكن هناك مستعمرات واضحة على لوحة، انتقل إلى الخطوة 2.5.3.
      2. إذا المستعمرات تظهر على لوحة، كرر من الخطوة 2.1.1 في قسم 2 "الجليد المستديمة ومعالجة لب الجليد".
    3. الحصول على جوهر من الفريزر وجو معقم و مطهر نقلها إلى كيس معقم.
    4. تخزين الأساسية في كيس معقم عند 4 درجة مئوية لمدة حوالي 24-48 ساعة لذوبان الجليد جوهر بأكمله.

3. الحصول على عينة فرعية للحمض النووي استخراج من النوى الثلج والجليد المستديمة

  1. استخراج الحمض النووي من العينات الجليدية
    1. خلط المواد المذابة من صميم الجليد اثارة بلطف كيس (الشكل 2G).
    2. صب المواد المذابة في وعاء معقم مع مرشح 0.22 ميكرون في ظل فراغ لجمع الكائنات الحية الدقيقة.
    3. جو معقم و مطهر إزالة عامل التصفية مع ملقط معقم ووضعه في 2 مل أنبوب حبة السيراميك معقم (1.4 ملم).
    4. تخزين مرشح في -80 درجة مئوية.
  2. استخراج الحمض النووي من عينات التربة المتجمدة
    1. خلط المواد المذابة من صميم الجليد السرمدي من عجين بلطف الحقيبة.
    2. بعد التجمد وقد يمزج جيدا، للحصول على عينة فرعية من حوالي 0.5 جم تربة الجزء الأكبر مع سكوبولا معقمة ووضعه في العقيمة 2 مل أنبوب السيراميك حبة المسمار الحد الأقصى tared (1.4 ملم) أن يجلس منتصبا على التوازن.
    3. تخزين العينات الفرعية في -80 درجة مئوية.
    4. الحصول على المحتوى المائي الوزني من العينات.
      1. قياس 10 غرام من الجليد الدائم مع STERILالبريد سكوبولا ومكان في القصدير tared على التوازن. قياس كتلة رطبة من الجليد الدائم والقصدير.
      2. احتضان الجليد في فرن وضعت في درجة حرارة 105 مئوية لمدة 24 ساعة. قياس الكتلة الجافة الجليد والقصدير.
      3. حساب المحتوى المائي الجاذبية عن طريق طرح الكتلة الرطبة من التربة المتجمدة من قبل الكتلة الجافة من التجمد وقسمة كتلة جافة الجليد.
    5. متجر دائمة التجمد في -80 درجة مئوية.

4. استخراج الأحماض النووية من الجليد المستديمة والجليد النوى

  1. الإعداد المادي
    1. إعداد قارورة العنبر لعقد حلول عن طريق التعامل مع 0.1٪ diethylpyrocarbonate (DEPC)، احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، والتعقيم.
    2. إعداد 240 ملي فوسفات البوتاسيوم حل العازلة. إضافة 2. 5 غرام من البوتاسيوم الفوسفات أحادي القاعدة و38،7 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم. ضبط الحجم النهائي إلى 500 مل بإضافة الماء المعقم.
    3. إعداد بروميد hexadecyltrimethylammonium (CTAB) استخراج BUFفر عن طريق إذابة 4.1 جم كلوريد الصوديوم في 80 مل من الماء وإضافة ببطء 10 ز CTAB أثناء تسخين واثارة. ضبط الحجم النهائي إلى 100 مل بإضافة الماء المعقم.
    4. إضافة وحدات متساوية من حل العازلة الفوسفات وCTAB العازلة وتصفية تعقيم مع فلتر 0.22 ميكرون. تغطية زجاجة مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في RT.
    5. تحضير 1.6 M محلول كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) من خلال الجمع بين 9.35 جم كلوريد الصوديوم و 100 مل ماء معقم. إضافة 10 غرام البولي ايثيلين جلايكول 8000 إلى 1.6 M كلوريد الصوديوم حل وتصفية تعقيم. تخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. استخراج النووي حامض وفقا لنسخة معدلة من غريفيث وآخرون. 22 وتووي وآخرون. 23
    1. ارتداء سترات خفيفة واجب، قفازات النتريل، والأقنعة. مساحة المختبر نظيفة وpipets مع 70٪ من الإيثانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
    2. إزالة عينة فرعية (فلتر من قلب الجليد أو عينة التربة دائمة التجمد) في 2 مل حبة السيراميك المسمار كاليفورنياأنبوب ص من -80 درجة مئوية الفريزر وذوبان الجليد في RT.
    3. إضافة 0.5 مل من بروميد hexadecyltrimethylammonium (CTAB) استخراج العازلة ودوامة لفترة وجيزة.
    4. إضافة 0.5 مل من الكحول الفينول كلوروفورم-أيزو أميلي (25: 24: 1) (درجة الحموضة 8) ويهز أنابيب أفقيا لمدة 10 دقيقة باستخدام محول المسطحة على vortexer.
    5. وبعد حبة الضرب، وأنابيب الطرد المركزي في 16100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. إزالة الطبقة المائية لالعقيمة أنبوب 1.5 مل جديد وتخلط مع حجم مساو من الكحول الكلوروفورم-أيزو أميلي (24: 1). أجهزة الطرد المركزي في 16100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    7. إزالة الطبقة المائية لالعقيمة أنبوب 1.5 مل جديد وإضافة مجلدين من 30٪ البولي ايثيلين جلايكول 8000 و 1.6 M كلوريد الصوديوم. احتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
    8. أجهزة الطرد المركزي في 16100 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    9. غسل بيليه الحمض النووي مع ما يقرب من 500 ميكرولتر من الجليد الباردة الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 16100 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    10. الهواء الجاف بيليه في biohood عقيمة لمدة 2 ساعة. resuspend في 50 ميكرولتر الدناز العازلة TE / ريبونوكلياز خالية (8.0 درجة الحموضة). الحمض النووي هو على استعداد لتقديم الطلبات المصب مثل PCR وQPCR.
    11. تحديد تركيز الحمض النووي مع معمل.
    12. تخفيف الحمض النووي مع الماء المعقم، وخالية من الحمض النووي لتحقيق 20 نانوغرام في رد الفعل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويمكن استخدام طريقة عرض لتطهير العينات المجمدة التي تم جمعها من مختلف البيئات الغلاف الجليدي، من الجليد الجليدية في الجليد السرمدي. هنا، نقدم البيانات التي تم جمعها خصيصا من عينات الجليد والتربة المتجمدة التي تم جمعها من بحوث الهندسة البحوث والتنمية - المناطق الباردة البحوث ومختبر الهندسة (ERDC-CRREL) الجليد المستديمة نفق يقع في فوكس، حزب العدالة والتنمية (الشكل 1A و 1B). على الجليد المستديمة نفق يمتد نحو 110 متر إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر الغلاف الجليدي الوصول إلى الكائنات الحفاظ عليها التي لا تزال قائمة في ظل ظروف بيئية الماضية. على الرغم من أن الأصناف تعافى قد لا تمثل المجتمع التاريخي الكامل، وتلك المستخرجة من تحليل عينات الجليد والتربة المتجمدة الجليدية يمكن أن تسفر عن معلومات تاريخية قيمة عن تحديد الفترات الزمنية 15-16. على سبيل المثال، فقد تم استخلاص المعلومات البيولوجية ذات مغزى من الدراسات الجليد التحقيق النشاط اللاهوائي في الغطاء الجليدي في غرينلاند 20 و الدراسات دائمة التجمد التح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من خلال مركز أبحاث وتطوير مهندسي الجيش الأمريكي ، مكتب برنامج البحوث الأساسية. تم منح الإذن بنشر هذه المعلومات من قبل رئيس المهندسين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أوجيهسنو والجليد والتربة الصقيعية (SIPRE) ، فيربانكس ، AK
70٪ إيزوبروبانولوولمارت 551116880
95٪ كحول إيثيلي (مشوه)   ؛فيشر ساينتفيك ، بيتسبرغ ، PAA407-4
محلول إزالة تلوث الحمض النووي ، DNA AwayMolecular Bio-Products، Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا7010
محلول إزالة التلوث RNase ، RNase AwayMolecular Bio-Products، Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا & nbsp ؛7002
بدلات خفيفةKimberly-Clark Professional ، Roswell ، GA10606
قفازات النتريلFisher Scientific ، بيتسبرغ ، PAFFS-700
أقنعة مضادة للفيروساتCurad ، WalgreensCUR3845
أكياس عينات معقمة   ؛ناسكو ، فورت أتكينسون ، ويسكونسنB01445
شفرة فولاذية ميكروتوم   ؛B-Sharp Microknife ، Wake Forest ، NC
Metal RackFormed في CRREL ، Hanover ، NH
TrayHandy Paint Products ، Chanhassen ، MN7500-CC
رقائق الألومنيومالبلاستيك الغربي ، Temecula ، CA
500 مل زجاجة مع 0.22   ؛ مو م فلتركورنينج ، كورنينج ، نيويورك430513
Serratia marcescens< / em>ATCC ، ماناساس ، فيرجينيا17991
غطاء السلامة الحيويةNuAire ، بليموث ، مينيسوتاNU-425-400
Petri DishFisher Scientific ، بيتسبرغ ، بنسلفانياFB0875712
ATCC Agar 181- TryptoneAcros Organics ، NJ61184-5000
ATCC Agar 181- جلوكوزفيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانياBP381-500
ATCC Agar 181- مستخلص الخميرةفيشر Scientific ، بيتسبرغ ، بنسلفانياBP1422-500
ATCC Agar 181- فوسفات ثنائي البوتاسيومJT بيكر ، فيليبسبرغ ، نيوجيرسي3252-01
ATCC Agar 181- AgarDifco ، Sparks ، MD214530
NanoDrop 2000 مقياس الطيفالضوئي للأشعة فوق البنفسجيةThermo Fisher Scientific ، ويلمنجتون ، DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems، Inc. ، Indianapolis ، IN
em>Halobacterium salinarum< / em>مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC) ، ماناساس ، فيرجينيا
< م > Pseudomonas fluorescens < / em>مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC) ، ماناساس ، فيرجينيا
طقم عزل الحمض النووي الميكروبيMoBio Laboratories ، Carlsbad ، CA12224-50
حماية الأذنElvexEP-201
Hard Hat
KimwipesKimberly-Clark Professional ، Roswell ، GA34705
الصوف الزجاجيPyrex430330
مسطرة
وزن القصدير فيشر ساينتفيك ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا08-732-100
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريS-9625
كلوريد البوتاسيومJT بيكر ، فيليبسبرغ ، نيوجيرسي3040-04
فوسفات البوتاسيوم ، أحادي القاعدةJT Baker ، فيليبسبورغ ، نيوجيرسي& nbsp ؛ 3246-01
فوسفات البوتاسيوم ، ثنائي القاعدةJT Baker ، فيليبسبورغ ، نيوجيرسي3252-01
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة ، اللامائيفيشر Scientific ، بيتسبرغ ، بنسلفانياBP332-500
50 مل أنابيب الطرد المركزيCorning ، Corning ، NY4558
2 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقةMoBio Laboratories ، Carlsbad ، CA1200-250-T
2 مل أنابيب حبة السيراميك (1.4 & nbsp ؛ مم)مختبرات MoBio ، كارلسباد ، كاليفورنيا13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific ، ويلمنجتون ، DE1437520
BalanceOhaus ، Parsippany ، NJE12130
ثنائي إيثيل بيروكاربونات (DEPC)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، MOD5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)   ؛Acros Organics, NJ22716-5000
البولي إيثيلين جلايكول 8000 سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريP5413-1KG
كحول الفينول - كلوروفورم - الأيزواميل (25: 24: 1) (درجة الحموضة 8)   ؛فيشر العلمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانياBP1752-400
جهاز طرد مركزيEppendorf ، Hauppauge ، NY5417R
كحول الكلوروفورم-إيزواميل (24: 1)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher) ، ويلمنجتون ، DEAM9860
PipetsRainin ، Woburn ، MAPipet Lite XLS ، 2 ، 10 ، 200 ، و 1,000 & micro ؛ ل pipets
pipet نصائحRainin ، Woburn ، MARainin LTS معقمة مسبقا ، احتفاظ منخفض ، نصائح مفلترة ، 10 ، 20 ، 200 ، 1،000 & nbsp ؛ ومايكرو. ل
VortexorScientific Industries ، بوهيميا ، نيويوركG-560
Vortex AdapterMoBio Laboratories ، Carlsbad ، CA13000-V1
Clear BottleCorning ، Corning ، NYC1395500
Amber BottleBottle Corning ، Corning ، NYC5135250
مرشحات الزجاجة العلوية ، 0.22 & nbsp ؛ ومايكرو. مكورنينج ، كورنينج ، نيويورك430513
60 مل حقنةبيكتون ، ديكنسون وشركاه ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسيBD 309653
مرشحات حقنة ميليكس ، 0.22 مو ؛ mEMD Millipore ، Billerica ، MASLGV033RB
70٪ إيثانولفيشر Scientific ، بيتسبرغ ، بنسلفانياBP2818-500مخفف ومعقم
Isotemp 100 L فرنفيشر Scientific ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا151030511
Cell SpreaderFisher Scientific ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا08-100-10
التلقيح التي يمكن التخلصمنها فيشر علمي ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا22-363-602
مؤسسة أبحاث < حلقات

المراجع

  1. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
  2. Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
  3. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
  4. Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
  5. Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
  6. Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
  7. Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
  8. Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
  9. Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020(2006).
  10. Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603(2007).
  11. Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
  12. Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
  13. Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
  14. Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
  15. Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
  16. Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
  17. Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
  18. Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
  19. Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
  20. Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
  21. Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
  22. Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
  23. Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
  24. Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
  25. Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
  26. Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
  27. Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
  28. Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647(2012).
  29. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  30. Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
  31. Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
  32. Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
  33. Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
  34. Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042(2010).
  35. Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
  36. Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
  37. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  38. Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
  39. Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA Serratia marcescens 16S rRNA

مقالات ذات صلة