مقالة منهجية

تسليم العلاجية سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الموجبة وأنيوني الليبوزومات

DOI:

10.3791/54106

⸱

يوليو 23, 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام الجسيمات الشحمية الموجبة / الأنيونية مع ببتيد يستهدف الأعصاب كنظام توصيل الجهاز العصبي المركزي لتمكين siRNA من عبور BBB. سيسمح تحسين نظام توصيل العلاجات ، مثل siRNA ، بمزيد من خيارات العلاج للبريون والأمراض التنكسية العصبية الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تنتج أمراض

Prion عن سوء طي بروتين البريون الخلوي الطبيعي (PrPC) إلى أيزومر غير طبيعي مقاوم للبروتياز يسمى PrPRes. أدى ظهور أمراض البريون في مجموعات الحياة البرية وتهديدها المتزايد لصحة الإنسان إلى زيادة الجهود لإيجاد علاج لهذه الأمراض. وجدت الدراسات الحديثة العديد من المركبات المضادة للبريون التي يمكن أن تمنع أيزومر PrPRes المعدي أو تنظم بروتين البريون الخلوي الطبيعي. ومع ذلك ، فإن معظم هذه المركبات لا تعبر الحاجز الدموي الدماغي لتثبيط تكوين PrPRes في أنسجة المخ بشكل فعال ، ولا تستهدف على وجه التحديد PrPC العصبية ، وغالبا ما تكون سامة جدا لاستخدامها في أو البشر.

لقد حققنا فيما إذا كان siRNA الذي يتم تسليمه داخل الأوعية الدموية ويستهدف PrPC العصبي العصبي هو مركب مضاد للبريون أكثر أمانا وفعالية. يحدد هذا التقرير بروتوكولا لإنتاج مركبتين لتوصيل الجثومات الشحمية siRNA ، وتعبئة وتسليم PrP siRNA إلى الخلايا العصبية. وركبتا التوصيل الشحمية هما 1) تركيبة الجسيمات الشحمية المعقدة siRNA باستخدام الجسيمات الشحمية الموجبة (LSPCs) ، و 2) تركيبة الجسيمات الشحمية المغلفة siRNA باستخدام الجسيمات الشحمية الموجبة أو الأنيونية (PALETS). بالنسبة ل LSPCs ، يرتبط siRNA سالب الشحنة إلكتروستاتيكيا بالجسيم الشحمي الكاتيوني. يضاف ببتيد موجب الشحنة (RVG-9r [بروتين سكري لفيروس داء]) إلى المركب ، والذي يستهدف على وجه التحديد مجمعات الببتيد الشحمية siRNA (LSPCs) عبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB) إلى الأسيتيل كولين الذي يعبر عن الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). بالنسبة ل PALETS (الببتيد الذي يتناول الجسيمات الشحمية المغلفة siRNA) ، تم إعادة ترطيب الدهون الموجبة والأنيونية بواسطة PrP siRNA. ينتج عن هذا الإجراء تغليف الحمض النووي الريبي داخل الجسيمات الشحمية الموجبة أو الأنيونية. مرة أخرى ، تم ربط الببتيد العصبي RVG-9r بجسيمات الشحم لاستهداف مجمعات siRNA / الجسيمات الشحمية إلى الجهاز العصبي المركزي. باستخدام هذه التركيبات ، نجحنا في توصيل PrP siRNA إلى الخلايا العصبية التي تعبر عن AchR ، وقللنا من تعبير PrPC للخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البريونات هي الأمراض العصبية الشديدة التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. أمراض البريون تنتج من misfolding من بروتين بريون الخلوي العادي، بي ار بي سي، من خلال آيزومور المعدية يسمى بي ار بي الدقة. هذه الأمراض تؤثر على مجموعة واسعة من الأنواع بما في ذلك مرض جنون البقر في بقرة، سكرابي في الأغنام ومرض الهزال المزمن في cervids، ومرض كروتزفيلد جاكوب في البشر 1-3. البريونات تسبب التنكس العصبي الذي يبدأ مع فقدان متشابك، ويتقدم لتشكل الفجوات، دباق، وفقدان الخلايا العصبية، والترسبات. في نهاية المطاف، مما أدى إلى موت الحيوان / الفردي 4. على مدى عقود، وقد حقق باحثو تهدف إلى إبطاء أو وقف تطور مرض بريون. ومع ذلك، لم يتم العثور على الباحثين إما العلاج الناجح أو وسيلة فعالة لتوصيل النظامية.

مطلوب الذاتية التعبير بي ار بي سي لتطور أمراض البريون 5 . لذلك، قد يؤدي خفض أو القضاء على بي ار بي C التعبير في تأخير أو تحسين من المرض. خلقت عدة مجموعات الفئران المعدلة وراثيا مع انخفاض مستويات بي ار بي C أو lentivectors حقن معربا عن shRNA مباشرة إلى أنسجة المخ الفئران للتحقيق في دور مستويات التعبير بي ار بي سي في مرض بريون. أدت هذه وجد الباحثون تقليل كمية الخلايا العصبية بي ار بي سي في وقف الأعصاب التدريجي للأمراض البريون وتمديد حياة الحيوانات 6-9. لقد ذكرت أن نتائج العلاج بي ار بي سي سيرنا في تطهير بي ار بي الدقة في الخلايا العصبية الماوس 10. وتشير هذه الدراسات إلى أن استخدام العلاج لخفض مستويات التعبير بي ار بي سي، مثل صغيرة بالتدخل RNA (سيرنا)، الذي يشق مرنا، قد يؤخر بما فيه الكفاية تطور أمراض البريون. ومع ذلك، تم تسليم معظم العلاجات التحقيق لأمراض البريون بطرق لن يكون عمليافي عملية إعداد سريرية. ولذلك، فإن العلاج سيرنا يحتاج إلى نظام تسليم النظامية، والتي يتم تسليمها عن طريق الوريد وهادفة إلى الجهاز العصبي المركزي.

وقد درس الباحثون استخدام الجسيمات الشحمية بوصفها وسائل إيصال للمنتجات العلاج الجيني. كلاهما يستخدم الدهون الموجبة والأيونية في تشكيل الجسيمات الشحمية. وتستخدم الدهون الموجبة أكثر على نطاق واسع من الدهون أنيوني لأن الفرق تهمة بين الدهون الموجبة وDNA / RNA يسمح للتعبئة فعالة. ميزة أخرى من الدهون الموجبة هي أنها عبور غشاء الخلية بسهولة أكثر من الدهون الأخرى 11-14. ومع ذلك، والدهون الموجبة أكثر مناعة من الدهون أنيوني 13،14. ولذلك، فقد بدأ الباحثون في التحول من استخدام الموجبة لأنيونية الدهون في الجسيمات الشحمية. منتجات العلاج الجيني يمكن تعبئتها بكفاءة في الجسيمات الشحمية الأيونية باستخدام موجبة كبريتات الببتيد بروتامين، التي يتكثف جزيئات DNA / RNA 15-19. منذ معهد العلوم الإندونيسي انيونيس أقل مناعة من الدهون الموجبة أنها قد زادت مرات الدورة الدموية، ويمكن أكثر التسامح في النماذج الحيوانية 13،14. وتستهدف الجسيمات الشحمية لأنسجة معينة باستخدام استهداف الببتيدات التي تعلق على الجسيمات الشحمية. ونيوروبيبتيدي RVG-9R التي تربط لمستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية وقد استخدمت لاستهداف سيرنا والجسيمات الشحمية إلى الجهاز العصبي المركزي 17-20.

ويعرض هذا التقرير على بروتوكول لإنتاج ثلاث عربات تسليم سيرنا، وحزم وتسليم سيرنا إلى الخلايا العصبية (الشكل 1). وتتكون المجمعات الحويصلية سيرنا الببتيد (LSPCs) من الجسيمات الشحمية مع سيرنا وRVG-9R استهداف الببتيد تعلق كهربية إلى السطح الخارجي للالحويصلية. تناول الببتيد الحويصلية مغلفة العلاجية سيرنا (PALETS) وتتكون من سيرنا وبروتامين مغلفة ضمن الجسيمات الشحمية، مع RVG 9R المستعبدين تساهميا إلى مجموعة الدهون PEG. باستخدام الأساليب التالية لتوليد LSPCs وPALETS، بي ار بي سي سيرنا يقلل بي ار بي C التعبير تصل إلى 90٪ في الخلايا العصبية، التي يحمله من آمال عريضة لعلاج أو إلى حد كبير تأخير ظهور الأمراض مرض بريون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت ولدت كل الفئران والحفاظ على الثروة الحيوانية مختبر، المعتمدة من قبل جمعية للتقويم والاعتماد للمختبر رعاية الحيوان الدولية، وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ولاية كولورادو.

1. إعداد LSPCs

  1. استخدام 1: DOTAP 1 (1،2-dioleoyl-3-trimethylammonium-البروبان): نسبة الكولسترول لLSPCs. ل4 إعداد الحويصلية nmole، مزيج 2 nmoles من DOTAP و 2 nmoles الكولسترول إلى 10 مل من 1: حل الميثانول في قارورة: 1 الكلوروفورم.
  2. تتبخر 9 مل من الكلوروفورم: حل الميثانول باستخدام N 2 الغاز في غطاء الدخان. تتبخر 1 مل الأخيرة من المذيبات في غطاء الدخان ليلة وضحاها بدون غاز. مراقبة فيلم الدهون رقيقة على الجزء السفلي من القارورة.
  3. الحرارة 10 مل من محلول السكروز 10٪ إلى 55 درجة مئوية.
  4. من أجل حل ساخنة 10٪ السكروز على الفيلم الدهون رقيقة ببطء، أي 1 مل / دقيقة، في حين أن شركة جنرال الكتريكيحوم ntly القارورة. الحفاظ على السكروز 10٪ وقارورة مع الدهون في 55 درجة مئوية بحيث تبقى جزيئات الدهون في مرحلة هلام السائل. نتائج الإماهة في الحويصلة (MLV) تشكيل الصفاحات.
  5. السماح الدهون لترطيب عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل تغيير حجم الجسيمات الشحمية.
  6. تجميع الطارد في تعليمات الشركة الصانعة مع 1.0 ميكرون مرشحات أو استخدام مرشحات حقنة 1.0 ميكرون لتحجيم.
  7. إضافة 1 مل من تعليق الحويصلية تسخينها إلى واحدة من الحقن على الطارد، وتمرير تعليق بين الحقن اثنين 11 مرة. تأكد من أن العملية تعتبر حقنة المعاكس من الحقنة تبدأ بعد 11 ممرات.
  8. حجم الجسيمات الشحمية مرة أخرى من خلال 0.45 ميكرون ثم 0.2 ميكرون مرشحات لتوليد الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs). حافظ على تعليق الحويصلية ساخنة لتسهيل التحجيم.
  9. احتضان 20 ميكرولتر من 4 nmole تعليق الحويصلية (200 ميكرومتر) مع 200 ميكرولتر من 20 ميكرومتر (4مجموعه nmole) حل سهم سيرنا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. احتضان 80 ميكرولتر من 500 ميكرومتر (40 nmole الكل) الأسهم حل RVG-9R مع الحل / الحويصلية سيرنا لمدة 10 دقيقة في RT. وينبغي أن تستخدم LSPCs في أقرب وقت ممكن ولكن يمكن استخدام ما يصل إلى عدة ساعات بعد الإعداد. متجر LSPCs في 4 درجات مئوية لعدة ساعة بعد الإعداد.

2. إعداد PALETS

  1. استخدام 55: نسبة 5 الرحى إما DSPE (1،2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine): 40 الكوليسترول: DSPE-PEG أو DOTAP: الكولسترول: DSPE-PEG لPALETS. ل4 إعداد الحويصلية nmole، مزيج 2.2 nmoles إما DSPE أو DOTAP، 1.6 nmoles من الكولسترول، و 0.2 nmoles من DSPE-PEG إلى 10 مل من 2: حل الميثانول في قارورة: 1 الكلوروفورم.
  2. إعداد تعليق الحويصلية بالضبط كما هو موضح في الخطوة 1.1 و 1.2 أعلاه. ترطيب الجسيمات الشحمية DSPE في 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X تسخينها إلى 75 درجة مئوية، بإضافة 1 مل / دقيقة. السماح الدهون لترطيب عند 75 درجة مئوية لمدة فيأقل 1 ساعة قبل التحجيم.
  3. حجم تعليق الحويصلية بالضبط كما هو موضح في الخطوة 1،6-1،8.
  4. الماصة كانت 20 ميكرولتر من كل واحد من 4 nmole (200 ميكرومتر) تعليق الحويصلية إلى قسامات تستخدم مرة واحدة بعد DOTAP وDSPE الجسيمات الشحمية الحجم، ويجفد لمدة 30 دقيقة باستخدام مجفف الفوق تجميد (الشكل 2).
  5. احتضان 200 ميكرولتر من 20 ميكرومتر (4 nmole الكل) الأسهم حل سيرنا مع 1.4 ميكرولتر من محلول 26.6 ميكرومتر من سلفات بروتامين لمدة 10 دقيقة في RT لسيرنا الذي هو أن تكون مغلفة في الجسيمات الشحمية DSPE PALETS.
  6. ترطيب الجسيمات الشحمية DOTAP PALETS مع 200 ميكرولتر من محلول المخزون nmole 4 من سيرنا أو ترطيب الجسيمات الشحمية DSPE PALETS مع 201.4 ميكرولتر من محلول / بروتامين سيرنا. احتضان الحويصلية / سيرنا حل لمدة 10 دقيقة في RT.
  7. إضافة 10 ميكرولتر من 60 ملي 1-إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) حل الحويصلية / حل سيرنا على حد سواء DOTAP وDSPE PALETS.
  8. إضافة 10 ميكرولتر من حل 150 ملي N-hydroxysulfosuccinimide (سلفو NHS) إلى الجسيمات الشحمية / حل سيرنا على حد سواء DOTAP وDSPE PALETS.
  9. احتضان EDC وسلفو NHS مع تعليق / الحويصلية سيرنا لمدة 2 ساعة على RT.
  10. احتضان 80 ميكرولتر من 500 ميكرومتر (40 nmole الكل) الأسهم حل RVG-9R مع سيرنا / الحويصلية يشابك حل لمدة 10 دقيقة في RT.
    ملاحظة: EDC / سلفو NHS يسمح للRVG-9R إلى السندات تساهمي إلى الدهون PEG. استخدام PALETS في غضون عدة ساعة بعد الإعداد. متجر PALETS في 4 درجات مئوية لعدة ساعة بعد الإعداد.
  11. لتحديد سيرنا كفاءة التغليف من PALETS:
    1. قياس تركيز سيرنا قبل وبعد إضافة بروتامين والجسيمات الشحمية باستخدام مقياس الطيف الضوئي التي وضعت في 260 نانومتر.
    2. تصفية سيرنا unencapsulated من الجسيمات الشحمية / التعليق سيرنا مغلفة باستخدام 50 كيلو دالتون مرشحات الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة.
    3. قياس تركيزسيرنا unencapsulated في الترشيح وتركيز سيرنا مغلفة في retentate باستخدام معمل في 260 نانومتر.

3. حقن الفئران مع LSPCs أو PALETS

  1. كشف الفئران لمدة 5-10 دقيقة لمصباح الحرارة إلى تمدد الأوعية الدموية.
  2. تخدير الماوس مع 2-3٪ آيزوفلوران / الأكسجين تدفق 5-10 دقيقة قبل الحقن، وأثناء الحقن. تأكيد التخدير عند الحيوان لم يعد متنقل وتباطأت التنفس عن طريق القيام قرصة أخمص قدميه. ضع الماوس على ظهرها أو الجانب للوصول إلى الوريد الذيل. استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني في عيون الماوس لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  3. مسح / رذاذ الذيل مع 70٪ ETOH وحقن 300 ميكرولتر من LSPCs أو PALETS على الوريد ذيل الماوس باستخدام 26 G حقنة الأنسولين. البدء في ضخ بشكل أقصى في الوريد الذيل ونقل قريب إذا الوريد ينهار أو تمزقات.
  4. ضع الماوس في قفص نظيفة حتى يحافظ على الاستلقاء القصية. لا تضع مواستخدام مع زملائه في قفص آخر حتى تعافى تماما. يجب أن الفئران على التعافي في 5 إلى 15 دقيقة. يمكن وضعها على وسادة التدفئة أو تحت مصباح الحرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم إذا الانتعاش وقتا أطول. ينبغي رصد الفئران عن كثب لحماية ضد الإفراط في التدفئة.
  5. رصد عدة ساعات بعد الحقن الحيوانية لضمان التخدير يلبس، وليس هناك أي آثار الضارة للعلاج. السماح للLSPCs أو PALETS أن تعمم لمدة 24 ساعة على الأقل.

4. تحليل التعبير البروتين عن طريق التدفق الخلوي

  1. الموت ببطء الفئران مع معدل تدفق 20٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة.
  2. تشريح خارج نصف الكرة الأرضية من الدماغ عن طريق قطع بعيدا الجلد والجمجمة من الفأرة باستخدام المقص. قشر بعيدا نصف الكرة الأرضية من الدماغ بعيدا من الجمجمة باستخدام ملقط أو نهاية مقصا.
  3. الصحافة نصف الكرة الأرضية من الدماغ من كل فأر خلال 40 ميكرون خلية شبكة مصفاة باستخدام 2.5 مل من العازلة FACS (1X، PBS، 1٪ الجنين المصل البقري، 10 ملي EDTA) في طبق بيتري مع المكبس من حقنة.
  4. شطف مصفاة الخلية وطبق بيتري مع 2.5 مل إضافية من FACS العازلة. وضع تعليق خلية واحدة في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.
  5. الماصة 100 ميكرولتر من 5 مل تعليق خلية واحدة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 ز س. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 1 مل من FACS العازلة. تدور في 350 x ج لمدة 5 دقائق. كرر مع 1 مل أخرى من FACS العازلة. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد.
  6. احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من 1: 100 التخفيف من 0.5 ملغ / مل الفئران كتلة مكافحة فأر التيسير في المخزن FACS لمدة 30-60 دقيقة على الجليد. بيليه وغسل الخلايا كما في الخطوة 4.5. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد.
  7. احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل الأجسام المضادة الفلورسنت ضد الماوس بي ار بي سي في 7٪ مصل الفأر في المخزن FACS على الجليد لمدة 30-60 دقيقة. بيليه وغسل الخلايا كما في الخطوة 4.5. الحفاظ على تعليق خليةعلى الجليد.
  8. بيليه وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من العازلة تحلل RBC (برنامج تلفزيوني 1X، 155 ملي NH 4 CL، 12 مم NaHCO 3، 0.1 ملي EDTA) لمدة 1 دقيقة. بيليه كما في الخطوة 4.5 و resuspend الخلايا في 1 مل من FACS العازلة. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد.
  9. تحليل بي ار بي C التعبير باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا (10). بوابة تعيش الخلايا من مجموع السكان الخلية. بوابة بي ار بي C + الخلايا من سكان الخلية الحية لتحديد مؤسسات التمويل الأصغر (كثافة الفلورسنت متوسط).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لزيادة كفاءة سيرنا التغليف داخل PALETS الأيونية، كان سيرنا مختلطة مع بروتامين. لتحديد أفضل تركيز بروتامين لسيرنا، كان سيرنا مختلطة مع تركيزات مختلفة من بروتامين، من 1: 1-2: 1 (الشكل 3A). كان هناك 60-65٪ سيرنا كفاءة التغليف في الجسيمات الشحمية الأيونية دون استخدام بروتامين. كان 1 (133-266 نانومتر) 80-90٪ سيرنا التغليف: العينات مع بروتامين: النسب المولية سيرنا من 1: 1 و 1.5. نسب المولي فوق 1.5: 1 أسفرت عن هطول الأمطار من المجمعات / ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا التقرير بروتوكول لإنشاء نظامين تسليم المستهدفة التي تنقل بكفاءة سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي. وتضمنت الأساليب السابقة من تقديم سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الحقن ناقلات سيرنا / shRNA مباشرة في الدماغ، والحقن في الوريد من سيرنا المستهدفة، أو الحقن في الوريد من المجمعات الحويصلية سيرنا غير المستهدفة. حقن ناقلات سيرنا / shRNA إلى الجهاز العصبي المركزي لا تسبب انخفاضا في مستويات بروتين تعبير الهدف. ومع ذلك، فإن سيرنا / shRNA لا تنتشر بحرية من خلال الجهاز العصبي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعرب عن تقديرنا لمصادر التمويل التالية: برنامج التدريب على أبحاث الأمراض المعدية CSU (ID: TRTP) وبرنامج منح أبحاث المعاهد الوطنية للصحة (R01 NS075214-01A1). نود أن نشكر مختبر Telling على استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة PRC5. نود أيضا أن نشكر مختبر داو على الجسيمات الشحمية DOTAP ، وعلى مشاركة خبراتهم في توليد الجسيمات الشحمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دهون دوتابأفانتي ليبيدات890890
دهون أفانتي كوليسترول700000
DSPEأفانتي للدهون850715
DSPE-PEGأفانتي ليبيدات880125
كلوروفورمفيشر العلميAC268320010
الميثانولEMD Millipore113351
N2 الغازالهوائي
السكروزفيشر ScientificS5-500
الطاردAvanti Lipids610023
1.0 و 0.4 و 0.2 &# 956 ؛ مرشحات مAvanti Lipids610010 ، 610007 ، 610006
PBSLife Technologies70011-044
كبريتات البروتامينفيشر ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980Aliquoted للاستخدام الفردي
Sulfo-NHSThermo Scientific24510Aliquoted للاستخدام الفردي
40 & # 956 ؛ مصفاة الخلايا mفيشر Scientific08-771-1
الفئران المضادة للفأر CD16 / CD32 كتلة FcBD Pharmigen553141
الأجسام المضادة المضادة ل PrP (PRC5)الملكية - جمهورية الصين الشعبية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  2. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  3. Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
  5. Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
  6. Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
  7. White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
  8. Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
  9. Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
  10. Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
  11. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
  12. Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
  13. Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
  14. Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
  15. Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
  16. Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  17. Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
  18. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  19. Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
  20. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  21. Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
  22. Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  23. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  24. Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
  25. Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
  26. Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
  27. Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
  28. Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
  29. Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
  30. Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

siRNA RVG 9r siRNA PrP

مقالات ذات صلة