يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الجينوم التحرير في

7.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54113

⸱

يونيو 20, 2016

 ,  , 
1Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Department of Biology, University of Maryland

في هذه المقالة

ملخص

الطفرات التي تستهدف الجين هو ممكن الآن في مجموعة واسعة من الكائنات الحية باستخدام تقنيات التحرير الجينوم. هنا، علينا أن نظهر بروتوكول لالطفرات الجينية المستهدفة باستخدام النسخ المنشط مثل nucleases المستجيب (TALENs) في Astyanax mexicanus، وهي من الأنواع من الأسماك التي تشمل الأسماك السطحية وcavefish.

الملخص

يعد تحديد أليلات الجينات الكامنة وراء التغيير التطوري أمرا ضروريا لفهم كيف ولماذا يحدث التطور. تحقيقا لهذه الغاية ، ركز الكثير من الأعمال الحديثة على تحديد الجينات المرشحة لتطور السمات في مجموعة متنوعة من الأنواع. ومع ذلك ، حتى وقت قريب كان من الصعب التحقق من صحة الجينات المرشحة المثيرة للاهتمام وظيفيا. تتيح الأدوات المطورة حديثا للهندسة الوراثية التلاعب بجينات معينة في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. سيسمح تطبيق هذه التكنولوجيا في الكائنات الحية ذات الصلة تطوريا برؤية غير مسبوقة لدور الجينات المرشحة في التطور. أستياناكس مكسيكانوس (A. mexicanus) هو نوع من الأسماك له أشكال سكنية سطحية وسكن كهوف. تطورت خطوط مستقلة متعددة من أشكال الكهوف من أسماك الأجداد السطحية ، والتي تتداخل مع بعضها البعض ومع الأسماك السطحية ، مما يسمح بتوضيح الأساس الجيني لسمات الكهوف. A. mexicanus تم استخدامه في عدد من الدراسات التطورية ، بما في ذلك تحليل الارتباط لتحديد الجينات المرشحة المسؤولة عن عدد من السمات. وبالتالي ، فإن A. mexicanus هو نظام مثالي لتطبيق تحرير الجينوم لاختبار دور الجينات المرشحة. نبلغ هنا عن طريقة لاستخدام نوكليازات المستجيب الشبيهة بمنشط النسخ (TALENs) لتحور الجينات في السطح A. mexicanus. تم استخدام تحرير الجينوم باستخدام TALENs في A. mexicanus لتوليد طفرات في جينات التصبغ. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لتقييم دور الجينات المرشحة لعدد من السمات الأخرى التي تطورت في أشكال الكهوف من A. mexicanus.

المقدمة

فهم الأساس الجيني للتطور سمة هو هدف البحث النقدي من علماء البيولوجيا التطورية. وقد تم إحراز تقدم كبير في تحديد مواضع الكامنة وراء تطور الصفات وإبراز الجينات المرشحة ضمن هذه المكاني (على سبيل المثال 1-3). ومع ذلك، وظيفيا اختبار دور هذه الجينات قد ظلت تتحدى العديد من الكائنات الحية تستخدم لدراسة تطور الصفات ليست حاليا لين العريكة وراثيا. ظهور تقنيات التحرير الجينوم ازداد الى حد كبير manipulability الجيني للمجموعة واسعة من الكائنات الحية. وقد استخدمت النسخ nucleases مثل المنشط المستجيب (TALENs) وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (CRISPRs) لتوليد الطفرات المستهدفة في الجينات في عدد من الكائنات الحية (على سبيل المثال 4-11). هذه الأدوات، وتطبيقها على نظام ذات الصلة تطويريا، لديها القدرة على إحداث ثورة في طريقة البيولوجيا التطورية الدراسة الأساس الجيني للتطور.

Astyanax mexicanus هي نوع من الأسماك التي توجد في شكلين: أ (الأسماك السطحية) شكل السطح التي تعيش في النهر ومتعددة الأشكال التي تعيش في كهف (cavefish) أ. mexicanus cavefish تطورت من أسلاف الأسماك السطحية (استعرضت في 12). وقد تطورت سكان cavefish في عدد من الصفات بما في ذلك فقدان العينين، وانخفاض أو فقدان تصبغ، وأعداد متزايدة من براعم الذوق وneuromasts الجمجمة، وتغييرات في السلوك مثل فقدان السلوك المدرسي، وزيادة العدوان، والتغيرات في تغذية الموقف وفرط الأكل 13 -19. Cavefish والأسماك السطحية interfertile، وقد أجريت تجارب رسم الخرائط الوراثية لتحديد الجينات مواضع والمرشح لصفات كهف 1،20-26. وقد تم اختبار بعض الجينات المرشحة لدور وظيفي في المساهمة في الصفات كهف في ثقافة الخلية 1،19، في الكائنات نموذج من الأنواع الأخرى 21 أو overexpression 27 أو ضربة قاضية عابرة شالغناء morpholinos 28 في A. mexicanus. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب له حدود. القدرة على توليد أليل متحولة من هذه الجينات في A. mexicanus أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها في تطور cavefish. وهكذا، A. mexicanus هو كائن حي المرشح المثالي لتطبيق تكنولوجيات تحرير الجينوم.

نحن هنا الخطوط العريضة لطريقة لتحرير الجينوم في A. mexicanus باستخدام TALENs. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم فسيفساء حقن الأسماك مؤسس للالظواهر ولعزل خطوط السمك مع الطفرات مستقرة في الجينات التي تهم 29.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وكانت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة من قبل لجنة الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدم في جامعة ولاية ايوا وجامعة ميريلاند.

1. TALEN التصميم

  1. المدخلات المطلوبة تسلسل الهدف لتصميم الموقع TALEN. (على سبيل المثال: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). إدخال اختيار أطوال مجموعة هل / تكرار.
    1. نسخ التسلسل الجيني في المربع المسمى "تسلسل".
    2. ضمن علامة التبويب "توفير مخصص فاصل / RVD أطوال" تحديد طول الفاصل وطول المصفوفة.
      ملاحظة: أطوال فاصل من 15 زوج قاعدي وتكرار أطوال مجموعة من 15-17 تعمل بشكل جيد وجعل التجمع أقل تعقيدا.
  2. اختيار زوج TALEN. TALEN أزواج يتمحور حول الفريد موقع انزيم التقييد تسمح التنميط الجيني بواسطة انزيم تقييد هضممنتج PCR.
  3. الاشعال تصميم لتضخيم المنطقة المحيطة الجينومية الموقع المستهدف TALEN باستخدام موقع على شبكة الانترنت مثل Primer3 30-32. عندما التنميط الجيني مع انزيم التقييد، الاشعال تصميم لتضخيم منطقة تحتوي على موقع انزيم التقييد مرة واحدة فقط. فمن المستحسن أن هذه المنطقة يتم تضخيمه والتسلسل قبل البناء TALEN لتحديد أي الأشكال الموجودة في A. mexicanus السكان المختبر لاستخدامها ل microinjection.

2. الجمعية TALEN (معدلة من بروتوكول TALEN كيت) 33،34

للحصول على تفاصيل إضافية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، انظر البروتوكول 34.

  1. إعداد وتسلسل البلازميدات اللازمة من عدة TALEN وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. إعداد # 1 ردود الفعل لردود الفعل ألف وباء وتشمل تكرار-متغير diresidues (RVDs) 1-10 وpFUS_A ناقلات جهة في رد الفعل A. تشمل RVDs 11- (N-1) وعشرناقلات ه جهة pFUS_B (N-1) في رد الفعل B حيث N هو العدد الإجمالي للRVDs في TALEN.
    1. إضافة إلى كل رد فعل: 1 ميكرولتر من كل تحتوي على البلازميد كل RVD (100 نانوغرام / ميكرولتر)، وناقلات الوجهة (100 نانوغرام / ميكرولتر)، 1 ميكرولتر بسه أنا انزيم التقييد، 1 ميكرولتر الأبقار مصل الزلال (BSA) (2 ملغ / مل )، 1 ميكرولتر يغاز، 2 ميكرولتر من العازلة 10X يغاز و x ميكرولتر من الماء لحجم ما مجموعه 20 ميكرولتر. على سبيل المثال، انظر الجدول 1.
      ملاحظة: يمكن أيضا ردود فعل نصف استخدامها.
    2. وضع ردود الفعل في thermocycler وتشغيل دورة: 10X (37 ° C / 5 دقائق + 16 ° C / 10 دقيقة) + 50 ° C / 5 دقائق + 80 ° C / 5 دقائق.
  3. احتضان ردود الفعل مع نوكلياز. إلى كل رد فعل إضافة 1 ميكرولتر 25 ملي ATP و 1 ميكرولتر نوكلياز. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. تحويل ردود الفعل.
    1. تحويل 2.5 ميكرولتر من كل التفاعل إلى 25 ميكرولتر كيميائيا الخلايا المختصة.
      ملاحظة: محلية الصنع ج المختصةملتعلمي اللغة اإلنكليزية يمكن استخدامها. ومع ذلك، يمكن خلايا بكفاءة منخفضة يؤدي إلى عدم وجود المستعمرات.
      1. مزيج 2.5 ميكرولتر من رد الفعل مع 25 ميكرولتر من الخلايا المختصة كيميائيا. احتضان على الجليد لمدة خمس دقائق. احتضان الخلايا لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية.
      2. وضع أنابيب على الجليد لمدة 2 دقيقة. إضافة 125 ميكرولتر من مرق سوبر الأمثل مع القمع مقيضة (SOC). هزة الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا تحولت على لوحات LB مع السبيكتينوميسين (50 ميكروغرام / مل)، X-غال والآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). تنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
  5. اختيار 2-3 مستعمرات بيضاء لكل رد فعل وتحقق من مستعمرة PCR باستخدام بادئات pCR8_F1 وpCR8_R1 (الجدول 2).
    1. جعل مزيج الرئيسي من الكواشف. على سبيل المثال، انظر الجدول 3.
    2. اختيار مستعمرة وتشويه صورتها في الجزء السفلي من أنبوب PCR، ومن ثم وضع ما تبقى من مستعمرة إلى 2 مل LB مع السبيكتينوميسين(50 ميكروغرام / مل). ضع 15 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في أنبوب مع مستعمرة.
    3. تشغيل البرنامج PCR التالية (الجدول 4)
    4. فحص PCR (تشغيل وحدة التخزين بالكامل) على هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي. فإن استنساخ الصحيحة لها الفرقة في الحجم المتوقع فضلا عن تشويه وسلم من العصابات. للحصول على مثال مسحة المناسبة، انظر 34،33.
    5. تنمو 2 مل الثقافات من الحيوانات المستنسخة الصحيحة في LB سائل الإعلام O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز.
  6. Miniprep البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  7. تسلسل للتحقق من تسلسل TALEN مع pCR8_F1 وpCR8_R1. اتبع الأساليب المذكورة سابقا (35).
  8. استخدام الحيوانات المستنسخة الصحيحة التحقق من التسلسل، إعداد رد فعل # 2 (مجموعة TALEN)، والتي سوف تضع RVDs من ناقلات ألف وباء وRVD النهائي في ناقلات الوجهة.
    1. إعداد مزيج لرد فعل 2 (جدول رقم 5).
      ملاحظة: هاردود الفعل LF يمكن استخدامها.
    2. وضع ردود الفعل في thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 37 ° C / 10 دقيقة + 16 ° C / 15 دقيقة + 37 ° C / 15 دقيقة + 80 ° C / 5 دقائق.
  9. تحويل ردود الفعل.
    1. تحويل 2.5 ميكرولتر من كل التفاعل إلى 25 ميكرولتر كيميائيا الخلايا المختصة.
      1. مزيج 2.5 ميكرولتر من رد الفعل مع 25 ميكرولتر من الخلايا المختصة كيميائيا. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. حرارة صدمة الخلايا لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية.
      2. وضع أنابيب على الجليد. إضافة 125 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب. وضع أنابيب في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا تحولت على لوحات LB مع الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل)، X-غال وIPTG. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
  10. اختيار 1-3 مستعمرات بيضاء لكل رد فعل وتحقق من مستعمرة PCR باستخدام بادئات TAL_F1 وTAL_R2 (الجدول 2).
    1. جعل حل البلمرة mastermix والمياه والاشعال كماهو موضح في الجدول 3. اختيار مستعمرة وتشويه صورتها في الجزء السفلي من أنبوب PCR، ومن ثم وضع ما تبقى من مستعمرة إلى 2 مل LB مع الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل). ضع 15 ميكرولتر من الحل في أنبوب مع مستعمرة.
    2. تشغيل البرنامج PCR (الجدول 6).
    3. فحص PCR على هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي. فإن استنساخ الصحيحة لها رتوش وسلم من العصابات. للحصول على مثال مسحة المناسبة، انظر 34،33.
    4. تنمو 2 مل الثقافات من الحيوانات المستنسخة الصحيحة في LB سائل الإعلام O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز.
  11. Miniprep البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  12. تسلسل للتحقق من تسلسل TALEN مع TAL_F1 وTAL_R2 التالية الأساليب المذكورة سابقا 35.

3. مرنا النسخ من TALENs

  1. هضم 4 ميكروغرام من القالب التحقق من التسلسل مع 2 ميكرولتر الحويصلة أنا لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. تشغيل 2 ميكرولتر من البلازميد هضمها I-ساك على هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي. سوف البلازميدات التي يتم هضمها بشكل صحيح عرض شريط واحد.
  3. تنقية المتبقية البلازميد هضمها I-الحويصلة بعد PCR بروتوكول عدة تنقية. يغسل مرتين مع محلول الغسيل قبل شطف. أزل إلى 30 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه.
  4. اتبع بروتوكول قياسي لإنتاج T3 مرنا.
    1. إعداد ردود الفعل نصف باستخدام 0.5 ميكروغرام من قالب خطي (المعد أعلاه). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    2. إضافة 0.5 ميكرولتر من الدناز (موجودة في الطقم)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  5. تنقية مرنا، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. أزل إلى 30 nuclease خالية من المياه ميكرولتر.
  6. تشغيل هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي للتحقق من مرنا.
    1. تنظيف الجهاز هلام مع منتج للقضاء على التلوث ريبونوكلياز وإعداد جل 1.2٪.
    2. مزيج 1 مرنا ميكرولتر + 4 &# 181؛ ل nuclease خالية من الماء + 5 ميكرولتر glyoxyl تحميل صبغ. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنابيب ومكان على الجليد قبل تشغيل هلام.
  7. للتحقق من تركيز باستخدام طريقة قياس تركيز الأحماض النووية وتخزين الحمض النووي الريبي في aliquots في -80 درجة مئوية. اختر حجم قسامة مثل أن الحمض النووي الريبي لا المجمدة / إذابة أكثر من مرة.
    ملاحظة: تركيزات 500-1،000 نانوغرام / يتم الحصول عليها عادة نيكولا لانغ. RNA مع تركيز أقل ويمكن استخدام طويلة كما يتم الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي (وفقا لتقييم الفرقة بدلا من مسحة على هلام).

4. حقن Astyanax mexicanus الأجنة مع TALEN مرنا

  1. إعداد أدوات للحقن.
    1. صب لوحات الحقن عن طريق سكب 1.2٪ الاغاروز في أسماك المياه (المياه مكيفة مع بيكربونات الصوديوم وملح البحر إلى 7.4 درجة الحموضة والموصلية 700 ميكرو ثانية) في طبق بتري. وضع قالب (قطعة من البلاستيك مع توقعات لجعل الآبار للأسماكالبيض) داخل الطبق. إزالة العفن عندما تصلب الاغاروز وتخزينها في 4 درجات مئوية. لمزيد من التفاصيل على القالب يرى 36.
    2. سحب الإبر لحقن باستخدام مجتذب إبرة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: مناسب طول الإبرة مهم للحقن. والإبر التي هي فترة طويلة جدا أن تكون مرنة جدا لحقن. فإن بروتوكول للإبر سحب تختلف مع المعدات المستخدمة لسحب الإبر. ويرد مثال على الإبرة المناسبة في الشكل 1. بالنسبة للمعدات لدينا، وسحب الإبر التي هي 5-6 سم في الطول، ويكون قطرها الخارجي في غيض من حوالي 0.011 مم عندما كسر. ومع ذلك، يجب أن تكون محسوبة الإبر (الخطوة 4.3.4) لتحديد عرض الافتتاح. يمكن العثور على البرنامج المثال لسحب الإبر في الجدول 7.
    3. إعداد الماصات الزجاجية لنقل الأجنة عن طريق كسر ماصة بحيث تكون الفتحة كبيرة بما يكفي لبيضة بالمرور. لهب نهاية كسر حتىلم يعد حاد.
      ملاحظة: من المهم استخدام الماصات الزجاجية والزجاج السلطانيات عند العمل مع أ. البيض mexicanus والأجنة لأنها لزجة، وستلتزم البلاستيك.
  2. اجمع 1-خلية المرحلة البيض.
    1. سلالة أ. mexicanus التالية البروتوكولات القياسية 37.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم الحفاظ على الأسماك على 14 ضوء: دورة الظلام 10 واستخدام الوقت Zeitgerber (ZT) مع ZT0 أضواء على وZT14 كما الأنوار، لدينا تفرخ الأسماك السطحية بين ZT15 وZT19. يجب تحديد وقت التبويض بدقة لكل مختبر على حدة.
    2. تفريخ من قبل فرط السمك لمدة 3-4 أيام قبل التزاوج ووضع الأسماك في المياه العذبة. رفع درجة فهرنهايت درجة الحرارة 2. ملاحظة: لدينا درجة حرارة الماء الأولية ما يقرب من 74 درجة فهرنهايت.
    3. جمع بيض الأسماك السطحية في الظلام، والتحقق من كل 15 دقيقة للحصول على البيض في المرحلة 1 خلية. ويمكن الحصول على مئات من البيض من زوج واحد من الأسماك السطحية.
    4. جمعالبيض في أوعية زجاجية لمنع الالتصاق على السطوح البلاستيكية والفرز لعزل الأجنة في مرحلة 1 خلية قبل الحقن من خلال مراقبة البيض تحت المجهر وجمع البيض التي هي خلية واحدة. إبقاء البيض في المياه العذبة النظام (خزان المياه وتستضيف الأسماك البالغة، التي تمت معالجتها للدرجة الحموضة والموصلية).
  3. حقن TALEN مرنا.
    1. ضخ كميات مختلفة من إجمالي مرنا (كميات متساوية من كل TALEN في الزوج) لتحديد تركيز الأمثل للحقن على سميتها والكفاءة تختلف من زوج TALEN. تبدأ عن طريق حقن مجموع تركيزات مرنا التي هي 400-800 ص. تمييع والجمع بين مرنا لتركيزات المطلوب لحقن 1.5 نيكولا لانغ.
    2. الحمل تضعف مرنا في الجزء الخلفي من الإبرة وإرفاق الإبرة إلى حاقن الصغرى.
    3. كسر إبرة باستخدام ملقط.
    4. معايرة الإبرة. على سبيل المثال، إخراج 10 مرات وجمع قطرة مما أدى إلى الشعيرات الدموية الصغيرة. لمدة 10 × 100 المتاح 1.081؛ ل، 32 مم الشعرية الصغيرة، ينبغي أن انخفاض ملء الشعرية الصغيرة إلى 0.5 ملم مقابل 1.5 نيكولا لانغ حقن / 1. ضبط الوقت الحقن والضغط حسب الحاجة.
    5. ادخال الإبرة في خلية واحدة وحقن مرنا. حقن مرنا مباشرة في الخلية، وليس في صفار البيض.
    6. جمع الأجنة المحقونة في أوعية زجاجية. إبقاء الأجنة في 23-25 ​​درجة مئوية. إزالة الأجنة الميتة (الأجنة التي أصبحت غائما وغير منتظمة الشكل) بانتظام خلال الأيام القليلة الأولى بعد الحقن. أعداد قياسية من الأجنة الميتة والمشوهة من سيطرة (uninjected) وألواح حقن.
      ملاحظة: زيادة تركيز مرنا يمكن أن يؤدي إلى زيادة السمية والتشوه / فاة الأجنة. وبالتالي، يجب أن تكون متوازنة سمية مقابل الكفاءة لتحديد أفضل تركيز مرنا لحقن.

5. النمط الظاهري مؤسس الأسماك وتقييم TALEN الكفاءة

  1. التضحية الأجنة وفقا لبروتوكول الحيوان المؤسسي.
    ملاحظة: نحن الموت ببطءالأجنة عن طريق السريع تقشعر لها الأبدان على الجليد.
  2. جمع الأجنة إلى 0.8 ميكرولتر PCR أنابيب الشريط باستخدام ماصة نقل.
    ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها التنميط الجيني على الأجنة الفردية أو برك من الأجنة.
  3. استخراج الحمض النووي.
    1. مكان الأجنة في 100 ميكرولتر 50 هيدروكسيد الصوديوم ملم (هيدروكسيد الصوديوم)، واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم تبرد إلى 4 درجة مئوية.
    2. إضافة 10/01 حجم ال (10 ميكرولتر) من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة (8).
  4. إجراء PCR على المنطقة باستخدام بادئات مصممة في الخطوة 1.3 (انظر الجداول 8 و 9 لبروتوكولات العينة). لأجنة الفردية 1 ميكرولتر من الحمض النووي غير كافية للتفاعل PCR.
  5. هضم المنتج PCR الناتج مع انزيم التقييد المناسب وتشغيل جل الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي.
    1. على سبيل المثال، لالتنميط الجيني موضع عيني جلدي المهق 2 (oca2) في حقن الأجنة هضم المنتج PCR باستخدام انزيم التقييد فرقة البحث وأنا بإضافة 00.5 ميكرولتر من فرقة البحث الأول مباشرة إلى 12.5 ميكرولتر من رد فعل PCR الانتهاء، يحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تشغيل عسر الهضم والمنتج هضمها على هلام. انزيم التقييد عصابات المقاومة (أي العصابات التي لا تهضم) تشير إلى أن الطفرات المستحثة TALEN-هي موجودة (الشكل 2).
  6. (اختياري) حساب معدل الطفرات مئوية خلال تحديد نسبة مئوية من الناتج تقطيعه عن طريق تحليل الصور من المواد الهلامية في فيجي 38 باستخدام أداة تحليل هلام لحساب قيمة كثافة كل فرقة كما هو موضح سابقا (29).
  7. تحديد تسلسل من الأليلات الطافرة التي كتبها TA استنساخ هلام تنقية تقييد انزيم الفرقة متحولة مقاومة وتسلسل الحيوانات المستنسخة.
    1. هلام تنقية تقييد انزيم الفرقة متحولة مقاومة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. استنساخ TA الفرقة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. اختيار المستعمرات والنمو في 1.5 مل LB O / N عند 37 درجة مئوية في هزالحاضنة.
    2. الثقافات Miniprep باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إرسال الحمض النووي لتسلسل.
    3. باستخدام برنامج مثل القرد، محاذاة متواليات متحولة إلى تسلسل wildtype.
      1. نسخ ولصق كل من متواليات إلى ملفات القرد. اختيار "محاذاة اثنين من سلاسل" أداة من قائمة "أدوات".
      2. تحديد اثنين من تسلسل الحمض النووي باستخدام القوائم المنسدلة.
        ملاحظة: تكملة العكسي للتسلسل المستنسخة قد تحتاج لاستخدامها اعتمادا على اتجاه ذهب PCR في ناقلات الاستنساخ. إذا كان تسلسل لا محاذاة، كرر الخطوات من التحقق من مربع "القس كوم" في خانة "محاذاة الحمض النووي".
  8. تقييم الأسماك مؤسس للالظواهر في مرحلة مناسبة واستخدام الأساليب المناسبة لالنمط الظاهري المتوقع 29 (على سبيل المثال، الشكل 3). وستستند أساليب phenotyping على النمط الظاهري المتوقع لهذا الجين المستهدف من قبل الباحث باستخدام protocرأ.

6. الشاشة لنقل سلالة الجرثومية

ملاحظة: أ. mexicanus تصل إلى مرحلة النضج الجنسي في 4-8 أشهر.

  1. عبور الأسماك مؤسس الناضجة جنسيا لنوع الأسماك البرية.
  2. الأجنة الشاشة أو الأسماك البالغة باستخدام الأساليب في الخطوات 5،1-5،7 (الشكل 4). وبالنسبة للأسماك الكبار، وقطعة من الذيل يمكن أن يثقب بعد التخدير.
    1. تخدير الأسماك غمر الأسماك في حل من تريكين (حمض 3-أمينو إيثيل استر) للحد من التوتر خلال لقطة الزعانف. وبعد لقطة الزعانف، والسماح الأسماك للتعافي في المياه العذبة. الأسماك تتعافى بسرعة؛ مراقبة الا بعد ان تعافى (تسبح عادة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

TALEN حقن زوج تؤدي إلى الملزم للRVDs إلى النيوكليوتيدات الحمض النووي محددة وبالتالي dimerization من المجالات FokI، مما أدى إلى انقطاع في الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة 39 التي يمكن اصلاحها من خلال نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ). في كثير من الأحيان يدخل NHEJ الأخطاء التي تؤدي إلى الإدراج أو الحذف (indels). Indels يمكن تحديدها عن طريق تضخيم المنطقة المحيطة بالموقع المستهدف TALEN وهضم amplicon الناتج مع انزيم التقييد الذي يمر في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد خطت خطوات واسعة في السنوات الأخيرة نحو فهم الأساس الجيني للتطور الصفات. بينما الجينات المرشحة الكامنة وراء تطور في عدد من الصفات تم تحديدها، إلا انه لا يزال تحديا لاختبار هذه الجينات في الجسم الحي بسبب عدم وجود قابلية الإستطراق الجيني للأنواع الأكثر إثارة للاهتمام من الناحية التطورية. نحن هنا الإبلاغ عن طريقة لتحرير الجينوم في A. mexicanus، استخدمت الأنواع لدراسة تطور الحيوانات الكهف. دراسات الخرائط الجينية 1،21،23 ونهج الجين مرشح 19،40 ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة علم الوراثة والتنمية وبيولوجيا الخلية وجامعة ولاية أيوا والمعاهد الوطنية للصحة منحة EY024941 (WJ) .Dr. قدم جيفري Essner تعليق على المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي> المعدات< / قوي>
حقن
Thermocycler
جهاز
مجتذب
Nanodrop
<قوي>الاسم< / قوي><قوي> الشركة رقم الكتالوجComments
Supplies
ملاحظة: على حد علمنا ، يمكن استخدام الإمدادات من شركات مختلفة ما لم يذكر
Golden Gate TALEN و TAL Effector Kit 2.0AddgeneKit #1000000024
فيشر الكواشف الحيوية LB Agar ، Miller (حبيبات)فيشرBP9724-500
فيشر الكواشف الحيوية علم الأحياء الدقيقة الوسائط: LB Broth ، MillerFisherBP1426-500
Teknova TET-15 في 50٪ EtOHTeknova (تم طلبه من خلال فيشر)50-843-314
سبيكتينومايسين ثنائي هيدروكلوريد ، فيشر الكواشف الحيويةفيشرBP2957-1
سوبر أمبيسيلين (1،000x حل)DNA Technologies6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution ، جاهز للاستخدامThermo Sci Fermentas Inc (تم طلبه من خلال فيشر)FERR0941
IPTG ، Fisher BioReactorsFisherBP1620-1
أطباق بتريFisher08-757-13
Bsa< / em>INew England Biolabs (تم طلبها من خلال Fisher)50-812-203استخدم BsaI ، وليس BsaI-HF (كما هو موضح في بروتوكول Golden Gate TALEN و TAL Effector Kit)
BSANew England Biolabsمزودة بإنزيمات
10x T4 ligase bufferPromega (تم طلبها من خلال Fisher)PR-C1263
GoTaq Green Master mixPromega (تم طلبها من خلال Fisher)PRM7123يمكن استخدام Taq أخرى ، ولكن يجب تعديل التفاعل وفقا لذلك
طقم ربط سريعنيو إنجلاند بيولابز (تم طلبها من خلال فيشر)50-811-728نحن نستخدم Quick Ligase لجميع تفاعلات تجميع TALEN
طلقة واحدة TOP10 بكتريا قولونية مؤهلة كيميائياInvitrogenC4040-06يمكن استخدام الخلايا الأخرى المختصة كيميائيا أو الخلايا المختصة محلية
الصنعEsp< / em> 3IThermo Sci Fermentas Inc (تم طلبها من خلال فيشر)FERER0451
مركز DNase المعتمد على ATP الآمن للبلازميد(تم طلبه من خلال فيشر)NC9046399
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106يجب استخدام مجموعة Qiagen لإعداد البلازميد الأولي (كما هو موضح في بروتوكول Golden Gate TALEN و TAL Effector Kit)
طقم تنقية QIAquick PCRQiagen28104
GeneMate LE Quick Dissolve AgaraoseBioExpressE-3119-125
Sac< / em> IPromega (تم طلبها من خلال فيشر)PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription KitAmbionAM1348M
Rneasy MinElute CleanupQiagen74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye  Ambion (تم طلبها من خلال Fisher)AM8551
EliminaseDecon (تم طلبها من خلال فيشر)04-355-32
Fisherbrand المتاح من زجاج الصودا والجير Pasteur PipetsFisher13-678-6B
الشعيرات الدموية الزجاجية القياسيةالعالمية للأدواتالدقيقة 1B100-4
MicrocapsDrummond Scientific Company1-000-0010
نصائح Eppendorf Femtotips Microloader ل Femtojet MicroinjectorEppendorf (تم طلبها من خلال فيشر)E5242956003
هيدروكسيد الصوديومفيشرS318-500
قاعدة تريسفيشرBP152-1
محطة هلامإبرةخلاف ذلكالتقييد Kit

المراجع

  1. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
  2. Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
  3. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  4. Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
  5. Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
  6. Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
  7. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  8. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  9. Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
  10. Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evol Biol. 12, 105(2012).
  13. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  14. Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
  15. Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
  16. Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
  17. Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
  18. Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
  19. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  20. Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
  21. Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).
  22. Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108(2012).
  23. Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281(2013).
  24. Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
  25. Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
  26. Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
  27. Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
  28. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823(2013).
  29. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).
  30. Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
  31. Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).
  32. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  33. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).
  34. Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
  35. Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
  36. Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
  37. Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  39. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
  40. Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647(2014).
  41. McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307(2014).
  42. Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  43. Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
  44. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  45. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  46. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  47. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

TALEN mRNA PCR OCA2
الجينوم التحرير في
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.