موقع إخراج صفها سبين والثوري دراسات طيفية القنوات Pentameric يجند بوابات ايون

ملخص

تصف هذه المقالة طرق وضع العلامات على الدوران الموجه للموقع وإعادة تشكيل القنوات ذات الترابط الخماسي لدراسات الرنين المغناطيسي الإلكتروني. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أي بروتين غشائي يمكن أيضا استخدام طريقة إعادة التكوين الموضحة هنا لقياسات المشبك الرقيعي للتيارات العيانية وحيدة القناة في نظام دهني محدد.

الملخص

بوابة القناة الأيونية هي تنسيق مدفوع بالتحفيز لحركات البروتين التي تؤدي إلى انتقالات بين الحالات المغلقة والمفتوحة وغير الحساسة. من الأمور الأساسية لهذه التحولات المرونة الجوهرية للبروتين ، والتي يتم تعديلها بشكل حاسم عن طريق تكوين الدهون في الغشاء. لفهم الأساس الهيكلي لوظيفة القناة بشكل أفضل ، من الضروري دراسة ديناميكيات البروتين في بيئة الغشاء الفسيولوجي. يعد التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي الإلكتروني (EPR) أداة مهمة لتوصيف التحولات التوافقية بين الحالات الوظيفية. بالمقارنة مع الرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية ، فإن المعلومات التي تم الحصول عليها من EPR ذات دقة أقل في جوهرها. ومع ذلك ، على عكس التقنيات الأخرى ، لا يوجد حد أعلى للوزن الجزيئي للبروتين في EPR ، ومتطلبات العينة أقل بكثير ، والأهم من ذلك أن البروتين غير مقيد بقوى الشبكة البلورية. لذلك ، فإن EPR مناسب بشكل فريد لدراسة مجمعات البروتين الكبيرة والبروتينات في الأنظمة المعاد تكوينها. في هذه المقالة ، سنناقش البروتوكولات العامة لوضع العلامات على الدوران الموجه للموقع وإعادة تشكيل الغشاء باستخدام قناة أيونية خماسية ببوابات بروتونية بدائية النواة (pLGIC) من Gloeobacter violaceus (GLIC) كمثال. سيتم وصف مزيج من مناهج EPR للموجة المستمرة في الحالة المستقرة (CW) والنبضية (رنين الإلكترون المزدوج - الغزلاء) والتي ستمكن من التوصيف الكمي الكامل لديناميكيات القناة.

المقدمة

على مدى العقد الماضي، نمت فهم الهيكلي من القنوات الأيونية بوابات يجند pentameric (pLGIC) في قدم وساق، وذلك بسبب تعدد الهياكل عالية الدقة من عدد من أعضاء الأسرة. العوامل الرئيسية التي أدت إلى التطورات الراهنة في مجال تشمل، اكتشاف قنوات pLGIC بدائية النواة، ^1-3 تقدمات كبيرة في التعبير البروتين غشاء حقيقية النواة ^و4-6 واختراقات هائلة في النهج تحديد الهيكل. ⁷ وتوفر هذه الهياكل إجماع واضح على حفظ الشامل للبنية ثلاثية الأبعاد من pLGIC. ومع ذلك، مجالين رئيسيين التي يبدو أنها تتخلف وراء هي توصيف وظيفي لهذه الاستعدادات القناة ووصف الآلية وظيفة القناة.

البروتوكول

1. الموقع الموجه الطفرات والسيستئين الطفرات

1. الاستنساخ والطفرات
   ملاحظة: GLIC النوع البري (وزن) ³⁵ له السيستين وحيد الأم (C27)، والذي تحور لسيرين لإنشاء خلفية السيستين أقل. وأدخلت الطفرات السيستين على خلفية السيستين أقل من الطفرات موقع الموجه باستخدام بادئات التي تحمل كودون السيستين في الموضع المطلوب ^36.
   1. مزيج 5 ميكرولتر من العازلة 10X رد فعل، 1 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر السيستين-أقل GLIC قالب DNA ^35،<....

النتائج

توصيف الكيمياء الحيوية من المسوخ GLIC المسمى سبين

بعد بروتوكول صفها أعلاه سوف تسفر عادة GLIC-م ب ب البروتين الانصهار في حدود 10-12 ملغ / لتر من الثقافة. على الرغم من أن قد تختلف هذه القيمة عبر طفرات مختلفة، لاسيما في المناصب دفن داخل البروتين، والعائد قد يكون خطر كبير. في هذه الحالات، قد يتطلب كميات ثقافة الارتقاء. انشقاق الانصهار .......

المناقشة

وقد ثبت الطيفي EPR أن يكون النهج الهيكلي لا مثيل لها في قياس التغيرات متعلق بتكوين بروتينات الغشاء في البيئة القريبة من مسقط رأسه. هذا الأسلوب يتيح لنا نظرة خاطفة في التفاصيل الجزيئية ديناميات البروتين الذي يتم حجب في هياكل عالية الدقة من البلورات بالأشعة السينية والمجهر البرد الإلكترون. ومع ذلك، فمن المهم النظر في القيود التقنية لهذا النهج التي قد تؤثر على تطبيقها بصفة عامة على الأنظمة الأخرى وأيضا أن نأخذ في الاعتبار الحواجز التجريبية المحتملة على طول الطريق. نناقش بعض هذه الجوا.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الطفرات الموجهة بالموقع وطفرات
Cys 10x PfuUltra HF تفاعل عازلة	Agilent Technologies	600380-52
dNTPS	New England BioLabs Inc‎	N0447L	10 ملي مولار لكل dNTP
pfu Ultra DNA polymerase	Agilent Technologies	600380-51	2.5 U / ul
DPNI	New England BioLabs Inc & lrm ؛	R0176S	20,000 وحدة / مل
XL10 GOLD	Agilent Technologies	200314
SOC media	New England BioLabs Inc & lrm ؛	B9020S
Kanamycin	Fisher Scientfic	BP905
LB media	Invitrogen	127957084
Miniprep kit	QIAGEN	27106
C43 الخلايا المختصة	Lucigen	60446
التعبير والتنقية
الجلوكوز	فيشر Scientfic	D16
الكواشف الحيوية	للتريبتون	BP1421-500
مستخلص الخميرة	Amresco	J850
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229
K2< / sub>HPO4< / sub>	Amresco	0705
K2< / sub>HPO4< / sub>	Amresco	0781
IPTG (الأيزوبروبيل ثيو بيتا الجالاكتوسيد)	التكنولوجيا الحيوية الذهبية	I2481C25
قاعدة تريزما	سيجما لايف ساينس	T1503
كلوريد الصوديوم	سيجما ألدريتش	S7653
DNase I	سيجما علوم الحياة	DN25
PMSF	أمريسكو	M145
ليوببتين	أمريسكو	J580
Pepstatin	Amresco	J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside)	Anatrace	D310S
راتنج الأميلوز	نيو إنجلاند BioLabs Inc‎	E8021L
TCEP	Amresco	K831
EDTA	Fisher Scientfic	BP118
Maltose	Acros Organics	329915000
Superdex 200 GL	GE Healthcare	17-5175-01
عمود كروماتوغرافيا البولي بروبلين الفارغ	BioRad	731-1550
وضع العلامات على الدوران الموجه للموقع
MTSL (1-oxyl-2،2،5،5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate	Toronto Reaserch Chemicals Inc	O873900
(1-acetoxy-2،2،5،5-tetramethyl-& Delta; 3-بيرولين -3-ميثيل) ميثانيثيوسلفونات	تورونتو ريسيرش للكيماويات A167900
DMSO	JT بيكر	9224-01
إعادة تشكيل
الدهون Asolectin	Avanti Polar Lipids Inc	541602C
Biobeads (حبات البوليسترين)	Bio Rad	152-3920
الميثانول	فيشر	A413
FRET
Fluorescein-maleimide	ThermoFisher Scientific	F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide	ThermoFisher Scientific	T-6027
POPC	Avanti polar lipids Inc	850457C
POPG	Avanti polar lipids Inc	840457C
E.coli< / em> مستخلص الدهون القطبية	Avanti Polar Lipids Inc	100600C
HEPES	Sigma Life Science	H3375
EPR قياس
TPX الشعيرات الدموية البلاستيكية	Bruker	ER221
EDDA (Ethylenediamine-N ، N'-diacetic acid)Aldrich		158186
Ni (OH) 2< / sub>	ألدريتش	283622

فيشر الدهون كيماويات