مقالة منهجية

موقع إخراج صفها سبين والثوري دراسات طيفية القنوات Pentameric يجند بوابات ايون

10.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54127

⸱

يوليو 4, 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المقالة طرق وضع العلامات على الدوران الموجه للموقع وإعادة تشكيل القنوات ذات الترابط الخماسي لدراسات الرنين المغناطيسي الإلكتروني. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أي بروتين غشائي يمكن أيضا استخدام طريقة إعادة التكوين الموضحة هنا لقياسات المشبك الرقيعي للتيارات العيانية وحيدة القناة في نظام دهني محدد.

الملخص

بوابة القناة الأيونية هي تنسيق مدفوع بالتحفيز لحركات البروتين التي تؤدي إلى انتقالات بين الحالات المغلقة والمفتوحة وغير الحساسة. من الأمور الأساسية لهذه التحولات المرونة الجوهرية للبروتين ، والتي يتم تعديلها بشكل حاسم عن طريق تكوين الدهون في الغشاء. لفهم الأساس الهيكلي لوظيفة القناة بشكل أفضل ، من الضروري دراسة ديناميكيات البروتين في بيئة الغشاء الفسيولوجي. يعد التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي الإلكتروني (EPR) أداة مهمة لتوصيف التحولات التوافقية بين الحالات الوظيفية. بالمقارنة مع الرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية ، فإن المعلومات التي تم الحصول عليها من EPR ذات دقة أقل في جوهرها. ومع ذلك ، على عكس التقنيات الأخرى ، لا يوجد حد أعلى للوزن الجزيئي للبروتين في EPR ، ومتطلبات العينة أقل بكثير ، والأهم من ذلك أن البروتين غير مقيد بقوى الشبكة البلورية. لذلك ، فإن EPR مناسب بشكل فريد لدراسة مجمعات البروتين الكبيرة والبروتينات في الأنظمة المعاد تكوينها. في هذه المقالة ، سنناقش البروتوكولات العامة لوضع العلامات على الدوران الموجه للموقع وإعادة تشكيل الغشاء باستخدام قناة أيونية خماسية ببوابات بروتونية بدائية النواة (pLGIC) من Gloeobacter violaceus (GLIC) كمثال. سيتم وصف مزيج من مناهج EPR للموجة المستمرة في الحالة المستقرة (CW) والنبضية (رنين الإلكترون المزدوج - الغزلاء) والتي ستمكن من التوصيف الكمي الكامل لديناميكيات القناة.

المقدمة

على مدى العقد الماضي، نمت فهم الهيكلي من القنوات الأيونية بوابات يجند pentameric (pLGIC) في قدم وساق، وذلك بسبب تعدد الهياكل عالية الدقة من عدد من أعضاء الأسرة. العوامل الرئيسية التي أدت إلى التطورات الراهنة في مجال تشمل، اكتشاف قنوات pLGIC بدائية النواة، 1-3 تقدمات كبيرة في التعبير البروتين غشاء حقيقية النواة و4-6 واختراقات هائلة في النهج تحديد الهيكل. 7 وتوفر هذه الهياكل إجماع واضح على حفظ الشامل للبنية ثلاثية الأبعاد من pLGIC. ومع ذلك، مجالين رئيسيين التي يبدو أنها تتخلف وراء هي توصيف وظيفي لهذه الاستعدادات القناة ووصف الآلية وظيفة القناة.

النابضة التغييرات متعلق بتكوين معقدة وتحدث على مسافة 60 Å على طول القناة، والتضمين هذه التحولات على نطاق واسع من قبلنسبة الدهون في غشاء. على وجه الخصوص، وقد ثبت أن نسبة الدهون في السلبية، والكولسترول، والدهون الفوسفاتية لتعديل وظيفة pLGIC 8-11. في حين أن الدور الدقيق لهذه المكونات الدهنية في وظيفة القناة لا يزال غير معروف، فإن فهم الجزيئية كاملة من النابضة يتطلب دراسة هذه القنوات في بيئتهم المحلية. سبين موقع الموجه وصفها (SDSL) والكترون ممغطس الرنين (الثوري) الطيفي هي التقنيات من اختيار لدراسة ديناميات البروتين في النظم تشكيلها. الجيش الشعبي الثوري الطيفي لا يقتصر على حجم الجزيئية (كما هو NMR) أو الممتلكات البصرية من العينة (كما هو مضان الطيفي)، وبالتالي يسمح قياسات يبني كامل طول تشكيلها في الظروف الدهون الأم. تقنية حساسة للغاية ولها متطلبات عينة منخفضة نسبيا (في حدود بيكو الخلد). كل من هذه الجوانب تجعل هذه التقنية مناسبة تماما لدراسة بروتينات الغشاء الكبيرة التي يصعب التعبير في أكثر من مليغرامكميات.

وقد تم تطوير استخدام التحليل الطيفي EPR في تركيبة مع زيادة ونقصان وصفها موقع الموجه من قبل واين هوبيل والزملاء، وتم تكييفها لدراسة مجموعة واسعة من أنواع البروتين. وقد استخدمت 12-24 البيانات الثوري للتحقيق في الهياكل الثانوية، والتغيرات في البروتين التشكل، أعماق غشاء الإدراج، والبروتين البروتين / تفاعلات البروتين يجند.

الأسلوب ينطوي على استبدال السيستين في مواقف الفائدة بمقدار الطفرات موقع الموجه. لضمان وضع العلامات الخاصة بالموقع، فمن الضروري أن تكون بديلا cysteines الأصلي مع حامض أميني آخر (على سبيل المثال، سيرين) لإنشاء قالب السيستين أقل. حتى الآن، وتسمية تدور الأكثر شعبية هي MTSL-ثيول محددة: (1-oxyl-2،2،5،5-ميثيل-Δ3-بيرولين-3-الميثيل) methanethiosulfonate التي يعلقها على البروتين من خلال جسر ثاني كبريتيد السندات. نظرا لخصوصيته العالية، وصغر حجمها نسبيا (أكبر قليلا من التربتوفان)، والمرنبيليتي من المنطقة رابط، وقد تبين هذه التسمية تدور لديهم القابلية للتفاعل ممتاز حتى مع وجود السيستين دفن. وعلاوة على ذلك، لتحقيق أقصى قدر من التفاعل، ويتم وضع العلامات رد فعل من البروتين في شكل المنظفات بالفاعلات. بعد انفصال الزائدة حرة تدور التسمية من قبل اللوني حجم الإقصاء، وإعادة تشكيل البروتين في جسيمات شحمية أو أنظمة محاكاة طبقة ثنائية من تكوين الدهون محددة. بشكل عام، والسيستين الطفرات جيد التحمل في معظم أجزاء من البروتين، وحجم صغير نسبيا من زيادة ونقصان مسبار يسبب الحد الأدنى من اضطراب للهياكل الثانوية والثالثية. للتأكد من أن تعديل الاحتفاظ ظائف نوع البرية، وقنوات وصفت وأعيد يمكن دراستها عن طريق القياسات التصحيح، المشبك.

ثم يتعرض البروتين المسمى وظيفية لقياسات الطيفية، والتي توفر أساسا ثلاثة أنواع رئيسية من المعلومات: 12،14،15،20،22،23،25-27 ديناميات تدور التحقيق من قبل lineshتحليل القرد. إمكانية الوصول إلى التحقيق لعوامل الاسترخاء ممغطس. يتم قياس المسافة وتوزيع 27 مسافات الثوري التي كتبها نهجين مختلفين. ويستند أولا على تقنية موجة مستمرة (CW)، حيث الطيفية توسيع الناجمة عن التفاعلات ثنائي القطب بين تدور العلامات (في 8-20 مجموعة بعد). ويستخدم لتحديد مسافة 28،29 والثاني هو نابض-EPR طريقة حيث قياسات المسافة التي يمكن أن تمتد ما يصل الى 70 Å. 30-34 وفي نقرا الكترون الكترون الرنين (غزلان)، ويتم تحليل التذبذبات في السعة تدور الصدى لتحديد المسافات والتوزيعات بعد. هنا هو منظم صدى تدور في وتيرة التفاعل ثنائي القطب. معا، وتستخدم هذه المعايير لتحديد طوبولوجيا البروتين والعناصر الهيكلية الثانوية، والتغيرات البروتين بتكوين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الموقع الموجه الطفرات والسيستئين الطفرات

  1. الاستنساخ والطفرات
    ملاحظة: GLIC النوع البري (وزن) 35 له السيستين وحيد الأم (C27)، والذي تحور لسيرين لإنشاء خلفية السيستين أقل. وأدخلت الطفرات السيستين على خلفية السيستين أقل من الطفرات موقع الموجه باستخدام بادئات التي تحمل كودون السيستين في الموضع المطلوب 36.
    1. مزيج 5 ميكرولتر من العازلة 10X رد فعل، 1 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر السيستين-أقل GLIC قالب DNA 35، 0.5 ميكرولتر كل من 40 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيدي 36، 1 ميكرولتر من dNTPs (100 ملم)، و 41 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات . ماصة العينة عدة مرات لمزجها جيدا، وتدور (6000 دورة في الدقيقة)، وأخيرا إضافة 1 ميكرولتر من بوليميريز الحمض النووي.
    2. تعيين الحرارية cycler على أن البروتوكول التالي:
      1. تمسخ في 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
      2. تمسخ في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      3. حمىجي في 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
      4. استطالة عند 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (تقريبا 1 دقيقة لكل كيلوبايت طول البلازميد).
      5. كرر الخطوات 1.1.2.2 - 1.1.2.4 لمدة 18 دورات.
      6. واستطالة النهائية في 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      7. عقد درجة حرارة 4 درجات مئوية
        ملاحظة: يتم احتساب درجة حرارة التليين على أساس التمهيدي تيم.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من DpnI إلى خليط التفاعل، مزيج دقيق من قبل pipetting، وتدور باستمرار (6000 دورة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة. احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. تحويل
    1. ذوبان الجليد E. الخلايا المختصة القولونية على الجليد. قسامة 30 ميكرولتر من الخلايا في 14 مل أنبوب التحول المعقم وإضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي المهضوم إلى الخلايا. مزيج من قبل التنصت على جانب الأنبوب. احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد.
    2. وضع أنبوب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ثم ضعه مرة أخرى على الجليد لمدة 2 دقيقة. إضافة 400 ميكرولتر وسائل الاعلام SOC العقيمة ويهز الخلايا في incuباتور في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا على لوحات LB تحتوي على كانامايسين (50 ميكرون) و 1٪ جلوكوز. احتضان لوحات O / N عند 37 درجة مئوية.
    4. حصاد مستعمرة واحدة من لوحة وتلقيح في 5 مل O / N الثقافات التي تحتوي على LB وسائل الاعلام / كانامايسين. احتضان الثقافة O / N (~ 16 ساعة) في 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة.
    5. استخراج الحمض النووي من يا ثقافة / N من minipreparation 37. قياس العائد من الحمض النووي باستخدام معمل عن طريق قياس الامتصاصية في 260 نانومتر الطول الموجي. يجب أن يكون التركيز ~ 100-200 نانوغرام / ميكرولتر. تأكد من وجود طفرة باستراتيجيات تسلسل الحمض النووي المؤتلف القياسية 38،39.

2. التعبير GLIC وتنقية

  1. تحويل
    1. اتباع الخطوات الموضحة في قسم 1.2، وتحويل 30 ميكرولتر من الخلايا المختصة C43 مع 1 ميكرولتر (~ 100-200 نانوغرام / ميكرولتر) من البلازميد التي تحتوي على الجين الترميز لGLIC جنبا إلى جنب مع فيروسات الانف الإنسان (الهريفي) -3C البروتيني الموقع الانقسام (للالبلازميد والجينات تسلسل، الرجوع إلى النص الإضافي) 35 (من الخطوة 1.2.5).
    2. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا على LB-أجار لوحات تحتوي على 1٪ جلوكوز و 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين، واحتضان لهم O / N (~ 16 ساعة) في 37 درجة مئوية في حاضنة.
    3. تحقق بصريا على المستعمرات، وضمان أن لا تزرع الإفراط في هم أو تظهر وجود المستعمرات الفضائية. على الفور ختم لوحات مع parafilm وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. وضع O / N-الثقافات وإعداد وسائط النمو
    1. اختيار مستعمرة معزولة واحدة باستخدام حلقة سلك بتلقيح ونقل إلى 100 مل قارورة معقمة تحتوي على 20 مل من مرق لوريا (LB) وسائل الإعلام تستكمل مع معقم 1٪ جلوكوز و 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين. احتضان لهم O / N (~ 16 ساعة) في 37 درجة مئوية في شاكر في 250 دورة في الدقيقة.
    2. الأوتوكلاف 900 مل رائع مرق (السل) وسائل الاعلام (انظر وسائل الإعلام والعازلة التكوين) في 2.8قوارير الزجاج L Fernbach للثقافة البكتيرية في دورة البخار عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. إعداد الثقافات نمو كبيرة
    1. إضافة 100 مل من العازلة فوسفات البوتاسيوم معقم (انظر وسائل الإعلام والعازلة التكوين) إلى وسائل الإعلام السل تعقيمها. إضافة الجلوكوز المعقم (تركيز النهائي 0.2٪)، كانامايسين (50 ميكروغرام / مل)، و 10 مل من O / N الثقافة. احتضان عند 37 درجة مئوية في شاكر في 250 دورة في الدقيقة.
    2. تحقق الكثافة البصرية في 600 نانومتر الطول الموجي (OD 600) باستخدام جهاز قياس شدة الضوء أو معمل كل ساعة حتى يصل 0.5 (~ 2 ساعة). في هذه المرحلة تقليل السرعة إلى 150 دورة في الدقيقة وخفض درجة الحرارة إلى 18 درجة مئوية. مراقبة OD 600 كل 30 دقيقة حتى تصل إلى 0.8 (~ 1 ساعة).
    3. إضافة 50 مل من الجلسرين ومواصلة هز الثقافة حتى OD 600 تصل إلى 1،0-1،2 (~ 15-30 دقيقة).
      ملاحظة: في ظل هذه الظروف، فإنه يأخذ حوالي ساعة للثقافة لتصل إلى 18 درجة مئوية من 37 درجة مئوية. ومن عفريتortant وأضاف أن الجلسرين للثقافة بعد أن تبرد إلى 18 درجة مئوية.
    4. لحث الخلايا مع 200 ميكرومتر IPTG (الآيزوبروبيل-ثيو-β-غالاكتوزيد) وإعادة شاكر إلى 250 دورة في الدقيقة وزيادة احتضان ل~ 16 ساعة على 18 درجة مئوية.
  4. البروتين تنقية
    1. تأكد من أن OD 600 في نهاية 16 ساعة هو ~ 16 - 18. حصاد الخلايا في زجاجات الطرد المركزي 1.0 لتر من الغزل في 8500 x ج، 4.0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. صب طاف وتزن زجاجة مع بيليه الخلية. حساب وزن بيليه بطرح وزن زجاجة فارغة من الوزن الكلي.
      ملاحظة: يتوقع وزن الخلية بيليه هو ~ 30 - 35 جم / لتر. على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أنه قد يكون هناك تقلب في النهائي OD 600 وبيليه خلية الوزن عبر المسوخ.
    2. إعادة تعليق بيليه البكتيرية في 150 مل من الجليد الباردة العازلة ألف (100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4) لكل 1.0 لتر من الثقافة. إضافة الدناز الأول (100 ميكروغرام / مل)، وبروتسمثبطات ه (فلوريد السلفونيل phenylmethyl (1 ملم)، leupeptin (2.0 ميكروغرام / مل)، أبروتينين (2.0 ميكروغرام / مل)، وpepstatin ألف (1 ميكروغرام / مل)).
    3. التجانس الخلايا عن طريق تمريرها من خلال ديسروبتر خلية في غرفة باردة 4.0 درجة مئوية. كرر هذه العملية ثلاث مرات حتى أن معظم البكتيريا وهي lysed. الطرد المركزي الخلايا في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة وماصة طاف بها ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة. تجاهل بيليه، الذي يحتوي على خلايا هي lysed الامم المتحدة والهيئات إدراج.
    4. أجهزة الطرد المركزي لطاف في 168000 x ج لمدة 1 ساعة. صب بعناية طاف دون الإخلال بيليه الغشاء.
    5. تجمع بيليه غشاء من 1 لتر من الثقافة وإعادة تعليق في الواق ألف (تستكمل مع 10٪ الجلسرين) إلى الحجم النهائي من 50 مل. إضافة 0.5 غرام من ن Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) إلى تعليق الغشاء وnutate لمدة 2 ساعة في 4.0 درجة مئوية.
    6. بعد ذوبان الغشاء، وإزالة الحطام خلية من المحللة التي كتبها centrifugأوجه في 168000 x ج لمدة 1HR. في هذه الأثناء إعداد الراتنج أميلوز. نقل 3 مل من راتنج باستخدام ماصة في عمود البولي بروبلين اللوني فارغة. غسل الراتنج عن طريق تمرير 10 مجلدات سرير من الماء 3 مرات وبعد ذلك مع 10 مجلدات السرير من الاحتياطي وتحتوي على 0.5 ملي DDM.
    7. بعد الطرد المركزي، واتخاذ بلطف طاف بها باستخدام ماصة ونقل إلى 50 مل أنبوب مخروطي نظيف. لدفعة من الحكمة ملزمة، إضافة معايرتها قبل الراتنج أميلوز إلى أنبوب مخروطي الشكل. ربط البروتين المستخرج من الراتنج أميلوز من الإيماء الخليط لمدة 2 ساعة في 4.0 درجة مئوية.
    8. تمرير الطين بأكمله من خلال عمود اللوني وجمع من خلال تدفق. ثم تمرير كامل جمع التدفق من خلال أكثر من الراتنج مرة ثانية لتعظيم ملزمة.
    9. تمرير 10 مجلدات السرير العازلة ومع 0.5 ملي DDM، 0.5 ملي تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP) و1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) لإزالة البروتينات غير منضم.
    10. أزل البروتين GLIC مع 10 مل من BUFفر والتي تحتوي على 40 ملي المالتوز بالإضافة إلى 0.5 ملي DDM و 0.05 ملي TCEP. TCEP يمنع أكسدة السيستين الجانب سلاسل. جمع أزل بأكمله.
    11. تركيز بروتين مزال استخدام المكثف الطرد المركزي (الوزن الجزيئي الانشطارية = 50 كيلو دالتون) إلى 4-6 ملغ / مل وإضافة البروتيني الهريفي-3C (200 ميكروغرام لكل 10 ملغ من البروتين)، واحتضان O / N عند 4.0 درجة مئوية.
      ملاحظة: تأكد من إتمام عملية الهضم البروتيني عن طريق تشغيل العينات على هلام PAGE SDS (راجع الخطوة 2.5.5 والشكل 1).
  5. موقع الموجه سبين وضع العلامات
    1. جعل حوالي 100 ميكرولتر من 200 الأسهم ملي من (1-oxyl-2،2،5،5-ميثيل-Δ3-بيرولين-3-الميثيل) MTSL 40 في DMSO وتخزينها السهم عند -20 درجة مئوية في 25 مكل.
    2. استخدام عينة هضمها البروتيني لتدور وضع العلامات مع MTSL. إضافة فائض الرحى 10 أضعاف من MTSL تدور التسمية (GLIC مونومر: MTSL في 01:10 نسبة الرحى). احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة. إضافة الطلقة الثانية من التسمية تدور في 5 أضعاف الفائض المولينسبة واحتضان لمدة ساعة أخرى.
      ملاحظة: للحصول على مناصب دفن (مع انخفاض كفاءة تدور وضع العلامات، هو موضح أدناه)، يتم إضافة 30 مرة فائض المولي التسمية تدور وحضنت البروتين لمدة 6 ساعة.
    3. تمرير العينة من خلال البروتين سريع عمود الحجم الاستبعاد اللوني السائل (FPLC) التي هي قبل معايرتها مع العازلة وو 0.5 ملي DDM لفصل MBP المشقوق والزائدة حرة تدور التسمية من pentamers GLIC. جمع 1 مل الكسور ليصبح المجموع 30 مل شطف. تجميع الكسور التي تحتوي pentamers GLIC (الشكل 1). اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتشغيل FPLC.
    4. تحديد تركيز العينة باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر الطول الموجي. معامل الانقراض المولي ويقدر الوزن الجزيئي للGLIC مونومر هم 49850 م -1 سم -1 و 36380 دا على التوالي. التركيز على حل البروتين باستخدام مكثف الطرد المركزي (الجزيئيةالوزن قص قبالة = 50 كيلو دالتون) إلى التركيز النهائي من ~ 8-10 ملغ / مل ووضعه على الجليد. العينة هي الآن جاهزة للإعادة.
    5. كما في اختبار الجودة إضافية لضمان إعداد متجانسة كيميائيا، تشغيل الحد (1.0٪ β-ME) هلام SDS-PAGE.
      ملاحظة: هلام commassie الملون يجب أن تظهر فرقة واحدة في ~ 33 كيلو دالتون الموافق مونومر GLIC (الشكل 1).
    6. لالمسوخ المسمى تدور يشتبه في معرض توسيع ثنائي القطب، تحت تسمية العينات في وجود التسمية diamagnetic 41. احتضان البروتين مزال مع MTSL 0.1 أضعاف، واحتضان على الجليد لمدة 1.0 ساعة. بعد ذلك، إضافة فائض الرحى 20 أضعاف من التسمية diamagnetic (1-acetoxy-2،2،5،5-ميثيل-Δ3-بيرولين-3-الميثيل) الميثان thiosulfonate.
      ملاحظة: كاشف diamagnetic المستخدمة هنا هي ايزو الفراغية إلى التسمية ممغطس مع وضع العلامات الكيمياء متطابقة.
    7. احتضان العينة على الجليد لمدة 2 ساعة. تمرير العينة من خلال الاحجامالبريد استبعاد العمود اللوني الذي هو قبل معايرتها مع العازلة وو 0.5 ملي DDM كما في الخطوة 2.5.3.
  6. كفاءة العلامات تدور
    1. ويعرف كفاءة تدور وضع العلامات على أنها نسبة تركيز تدور التسمية إلى تركيز السيستين جانب سلسلة (GLIC-مونومر). لتحديد كفاءة تدور وضع العلامات من العينة، وسيتم مقارنة شدة المتكاملة للعينة مع مستوى تركيز معروف يستخدم مؤامرة المعايرة. جعل حلول ذات مستوى EPR (مثل 2،2،6،6-ميثيل-1-piperidinyloxyl: TEMPO) في مجموعة من تركيزات (10-250 ميكرون) عن طريق إذابة في الماء.
    2. قياس إشارة الثوري لكل من هذه الحلول وتحديد المساحة تحت منحنى (التكامل المزدوج للإشارة الثوري) لكل تركيز (كما هو موضح في الخطوات 6.1). توليد منحنى المعايرة من قبل المتهم بالتآمر في منطقة محسوبة بوصفها وظيفة من تركيز TEMPO والمناسب مع خط مستقيم.
      ملاحظة: لوتحت إشارة الثوري مشتقة هو أفضل وصف لشدة الطيفية من الذروة إلى الذروة السعة. ودمج الأولى المشتقة إشارة الثوري إعطاء طيف الامتصاص، فإن التكامل الثاني ثم إعطاء المنطقة تحت طيف الامتصاص (والذي يتناسب مع تركيز تدور). ضمان خط الأساس المستمر سواء في الميدان منخفضة والمنطقة ميداني على مستوى عال من الطيف.
    3. قياس تركيز البروتين المسمى تدور في المنظفات باستخدام مقياس الطيف الضوئي (كما في الخطوة 2.5.4). الآن قياس إشارة الثوري من العينة ومن ثم تحديد مجال تكامل المزدوج للإشارة الثوري الخطوات التالية في القسم 6.1. باستخدام مؤامرة المعايرة، وتحديد تركيز التسمية التي تتطابق مع إشارة الثوري قياسها. حساب الكفاءة تدور وضع العلامات، نسبة المولي من التسمية تدور وتركيز البروتين.

3. GLIC إعادة إعماره في Asolectin الأغشية

    إعداد الحويصلية
    1. شطف 25 مل قارورة أسفل جولة نظيفة مع 5 مل من الكلوروفورم وتجفيف قارورة في تيار من غاز N 2 في غطاء الدخان. نقل 10 ملغ من asolectin (فول الصويا القطبي استخراج 25 ملغ / مل الأسهم في الكلوروفورم) في قارورة وتجفيف الدهون تحت دفق مستمر من N 2 الغاز.
      ملاحظة: يعتمد اختيار الدهون لإعادة على النتائج المستخلصة من التجارب في القسم 4.
    2. عندما تبخرت الكلوروفورم، ضع قارورة في فراغ لمدة 1 ساعة لضمان التجفيف الكامل. إضافة 1 مل من إعادة العازلة ألف من الدهون المجففة ودوامة القارورة بقوة للحصول على بيليه الدهون إلى تعليق.
    3. لإعداد الحويصلات unilamellar صغيرة، يصوتن تعليق الدهون في sonicator الحمام البارد حتى يصبح الحل حويصلة أكثر أو أقل شفافة ولوحظ عدم وجود كتل (حوالي 10-15 دقيقة). إلى هذا الخليط، إضافة DDM إلى تركيز النهائي من 4 مم واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
    <لى> إعادة إعماره
    1. إضافة البروتين المنقى من الخطوة 2.5.4 إلى خليط الدهن.
      ملاحظة: نسبة البروتين إلى الدهون تعتمد على نوع من التجربة. لقياس الحالية العيانية، 1: يستخدم نسبة 10،000. للدراسات الثوري، ويتم إعادة في البروتين العالي لنسبة الدهون (1: 2500) لتعظيم إشارة. وأظهرت في وقت سابق أنه في هذه التركيزات، يتم احترام أي تجميع الجانبي 42.
      ملاحظة: كمية العمل نموذجي GLIC لالثوري هي ~ 1 ملغ، على الرغم من أن يستند إلى موقف بحثها، وكميات أقل ستعمل أيضا.
    2. احتضان العينة عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع دوران طيف ثم تمييع العينة إلى 15 مل مع الواق A.
      ملاحظة: هذه الخطوة يرتفع تركيز المنظفات أقل من تركيز micellar الحرجة (CMC).
    3. إزالة المنظفات المتبقية في تعليق بإضافة الخرز البوليسترين (مع المسام مسعور هذا الفخ المنظفات). إضافة 80 ملغ من تنظيف الخرز واحتضان liposلى بعد تعليق O / N على nutator في 4 درجة مئوية.
      1. لإعداد الخرز للاستخدام، تزن ~ 100 ملغ ونقلها إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 10 مل من الميثانول، هزة بقوة، وتدور أسفل حبات في 8000 x ج لمدة 2 دقيقة، وصب الميثانول. كرر هذه العملية من الميثانول يغسل ثلاث مرات. كرر نفس العملية مع 30 مل من الماء منزوع الأيونات، وغسل ثلاث مرات.
    4. في اليوم التالي، ونقل الجسيمات الشحمية لأنبوب نابذة 25 مل باستخدام فلتر العمود لإزالة الخرز وزيادة تمييع العينة إلى 25 مل. الطرد المركزي العينات في 168000 x ج لمدة 2 ساعة. صب طاف وإعادة تعليق بيليه باستخدام 100 ميكرولتر من الاحتياطي B.

4. تحديد الأمثل الدهن تكوين لإعادة إعماره من قبل الحنق

  1. استخدام مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق) فحص المستندة إلى تحديد تكوين الغشاء الذي يحافظ على البروتين monodisperse.
  2. تنقية بالوزن GLIC (مع السيستين الأم، C27) باتباع الخطوات الموضحة في القسم 2. تسمية البروتين بنسبة 10: 1 (التسمية / مونومر) نسبة المولي مع أي فلوريسئين-maleimide أو tetramethylrhodamine-maleimide باستخدام الخطوات في القسم 2.5.
  3. الخطوات التالية في القسم 3.2 لإعادة، وإعداد ثلاث عينات مختلفة لكل تركيبة الدهون لفحصها، أولا، فلوريسئين المسمى GLIC في نسبة المولي من 1: 1500 (مخموس: الدهن) GLIC في نسبة المولي الثانية، وصفت رودامين- 1: 1500 (مخموس: الدهن). الثالث، خلط المنظفات بالفاعلات فلوريسئين ورودامين المسمى GLIC (نسبة 1: 1 المولي). إعادة تشكيل هذا الخليط في 1: 750 (مخموس: الدهن) النسبة.
    ملاحظة: استخدمنا ثلاثة أنظمة الدهون: asolectin، POPC: POPG (3: 1 نسبة الرحى)، و E. استخراج القطبي القولونية. هذا البروتين الدهني نسبة إعادة في التجربة الحنق أعلى من تلك المستخدمة لقياس الثوري (1: 750 بالمقارنة مع 1: 1500 تستخدم للدراسات الثوري).
  4. تمييعتعليق الحويصلية (للحد من إشارة تشتت الضوء؛ ~ 5 ميكرولتر في 995 ميكرولتر من الاحتياطي أ) ثم ماصة العينة إلى كوفيت الكوارتز ووضعه في مقياس التألق.
  5. تعيين الطول الموجي الإثارة في 490 (والتي تتطابق مع ماكسيما امتصاص للمتبرع: فلوريسئين). باستخدام تعليمات الشركة الصانعة، تسجيل الأطياف الانبعاثات من 500 نانومتر إلى 660 نانومتر.
    ملاحظة: للحصول على GLIC عينة المسمى فلوريسئين، سترى الذروة في 518 نانومتر (الموافق الانبعاثات فلوريسئين) مع عدم وجود ذروة في 572 نانومتر (الموافق الانبعاثات رودامين). لGLIC عينة المسمى رودامين، فإنك لن ترى ذروته في 518 نانومتر ولكن بدلا من ذلك في 572 نانومتر الناشئة عن الإثارة المباشرة لرودامين في 490 نانومتر. بالنسبة للعينة تحتوي على كل فلوريسئين ورودامين التسميات، وانخفاض في كثافة الذروة فلوريسئين وزيادة مقابلة في ذروة رودامين هو إشارة الحنق الذي من المرجح مؤشر التجميع الجانبي للبروتين في الغشاء.
  6. مراقبةاتساع الانبعاثات رودامين في 572 نانومتر على فترات زمنية مختلفة (0-24 ساعة) تسجيل في كل ساعة لساعة 6 الأولى ثم بعد O / N الحضانة (الشكل 2). لكل فترة، وقياس كثافة مضان في 572 نانومتر (لرودامين: الأولى أ) وفي 518 نانومتر (لفلوريسئين: إيد). طرح مساهمة تفعيل رودامين المباشر (نموذج 2 في الخطوة 4.3) من الأولى أ (IAC). تحديد نسبة الحنق كما IAC / (IAC + رطل). مقارنة الحنق على فترات زمنية مختلفة، وعبر تركيبة الدهون المختلفة.
    ملاحظة: كعنصر تحكم، نفذ الخطوة 4.5 و 4.6 لعينات المنظفات بالفاعلات والمقارنة بين أطياف الانبعاثات لتلك الجسيمات الشحمية من تشكيلها. استخدام مزيج متساوي المولية من البروتين المسمى في المنظفات (كما هو موضح في الخطوة 4.3) وتمييع العازلة وتستكمل مع 0.5 ملي DDM. ومن المتوقع أن عينات المنظفات سوف تظهر الحد الأدنى من إشارة الحنق.

5. القياسات الوظيفية من قبل تسجيلات التصحيح، المشبك

  1. إعداد العلاقات العامةoteoliposomes لقياس التصحيح، المشبك تماما بنفس الطريقة التي لدراسات الثوري (القسم 3.1).
    ملاحظة: ومع ذلك، وضبط البروتين: الدهون نسبة على أساس النوع من القياس تبذل (قناة واحدة، مقابل التسجيلات مجهري). فلاش تجميد proteoliposomes في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. عادة، إعادة GLIC في 1: 10،000 البروتين: الدهون (نسبة المولي) لالتيارات العيانية و 1: 50000 نسبة المولي للتسجيلات قناة واحدة.
  2. الجسيمات الشحمية ذوبان الجليد على الجليد. شطف شريحة زجاجية نظيفة مع الماء والإيثانول ويجف تماما. وضع قطرة 10 ميكرولتر من proteoliposome في وسط الشريحة ويا جاف / N في مجفف في 4 درجة مئوية تحت فراغ.
  3. إعادة ترطيب proteoliposomes المجففة بإضافة 20 ميكرولتر من الاحتياطي ب (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.0) ووضع شريحة في petriplate على رأس ورقة مرشح رطبة. تغطية لوحة، والسماح للالإماهة المضي قدما لمدة حوالي 2 ساعة.
    ملاحظة: هذا yie عمليةلدس الجسيمات الشحمية العملاقة متعددة رقائقي التي تؤدي إلى تصحيح من.
  4. سحب ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية رقيقة الجدران البورسليكات الزجاج (~ 1-2 ميكرون قطر الحافة) باستخدام المصنع أوصى وضع على مجتذب ماصة. للحرارة البولندية باستخدام النار المضي إلى المقاومة من 1.5 - 2MΩ عندما تمتلئ العازلة B.
  5. تملأ الغرفة مع تسجيل B الاحتياطي باستخدام ماصة ونعلق القطب الأرض حج / أجكل. باستخدام 2 ميكرولتر ماصة، طرد بلطف الجسيمات الشحمية من على حافة ونقل 1 ميكرولتر من تعليق على غرفة تسجيل. انتظر بضع دقائق للالجسيمات الشحمية لتستقر في القاع.
  6. ملء التصحيح، ماصة مع B الاحتياطي باستخدام إبرة حقنة غير المعدنية وتركيبها على مكبر للصوت وجها المرحلة. تحديد حويصلة واحدة معزولة لرأب الصدع. تطبيق ضغط إيجابي طفيف لمنع التصحيح، ماصة من انسداد، وإدراج معلومات سرية إلى غرفة تسجيل.
  7. تطبيق نبضات اختبار لقياس المقاومة ماصةالامتحانات التنافسية الوطنية وتعويض الجهد ماصة الإزاحة. الاقتراب من حويصلة، وعندما يتم الاتصال، وتطبيق ضغط سلبي طفيف لسحب بلطف الحويصلة ضد ماصة التصحيح على شكل خاتم gigaohm.
  8. مراقبة مقاومة ماصة خلال العملية برمتها. مرة واحدة يتم تشكيل ختم gigaohm، سحب ماصة بعناية بعيدا عن الجسيمات الشحمية لتشكيل التصحيح من الداخل إلى الخارج. إيقاف نبض الاختبار.
  9. تعيين إمكانية عقد ل-100 بالسيارات، وتطبيق نبض درجة الحموضة. تم الحصول على انخفاض الرقم الهيدروجيني باستخدام 10 ملي سيترات الصوديوم العازلة C (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي سيترات، ودرجة الحموضة 3.0). (الشكل 3)
    تتم التسجيلات على تردد أخذ العينات من كيلوهرتز 10 لالعيانية و 40 كيلو هرتز لقياس قناة واحدة: ملاحظة.

6. القياسات الثوري

  1. استمرار الموجة الثوري الطيفي
    1. نقل تعليق الحويصلية من الخطوة 3.2 في أنبوب ميكرولتر 200 وبيليه العينات باستخدام جهاز للطرد المركزي. تجاهل supernataالإقليم الشمالي ونموذج جاهز للقياسات الثوري.
      ملاحظة: للحصول على قياسات الثوري، فمن المهم لإزالة أكبر قدر من العازلة من عينة الحويصلية وقت ممكن. منذ عينات مائية تمتص جزء الكهربائية الموجات الدقيقة مما يؤدي إلى تسخين وفقدان الحساسية.
    2. لتنفيذ الصرف عازلة، ونقل 20 ميكرولتر من بيليه الحويصلية باستخدام ماصة لأنبوب microfuge. إضافة 180 ميكرولتر من الاحتياطي D (100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي سيترات، ودرجة الحموضة 3.0)، واحتضان في حمام الماء 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي لعينة، وإزالة طاف باستخدام ماصة وتكرار هذه العملية ثلاث مرات لضمان تبادل عازلة كاملة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إجراء صرف عازلة بإخضاع عينات لعدة دورات تجميد / الذوبان.
    3. الغاز الشعيرات البلاستيكية قابلة للاختراق هي مناسبة لقياس كل الأطياف خط الأشكال والوصول المذيبات. اضغط على شعري على proteoliposome مكعبات لرسم عينة داخل وختم نهاية بالشمع العظام.
      ليسE: نموذجي أحجام العينة هي ~ 5 ميكرولتر وتركيز تدور المرغوب فيه هو 150 ميكرومتر. إذا كان الهدف هو قياس الأشكال خط وحدها، يمكن للمرء استخدام 0.4 ملم أنابيب OD الكوارتز الشعرية. إذا لزم الأمر، ماصة يمكن أن تستخدم لملء عينة داخل الشعيرات الدموية.
    4. تشغيل مطياف
      1. إجراء قياسات CW-الثوري في RT (292-297 ك) على مطياف X-فرقة مجهزة عازلة مرنان وفقا لدليل التعليمات الصانعين.
      2. بدوره على الماء المبرد، وإمدادات الطاقة، وحدة جسر الميكروويف. السماح للنظام لكي تتوازن حراريا لمدة 30 دقيقة قبل تسجيل. فتح البرنامج الاستحواذ.
      3. إدراج نموذج أنبوب / الشعرية في مرنان، تأكد من أن قسم من أنبوب مملوء العينة في وسط تجويف مرنان. ضبط مرنان وفقا للتعليمات على دليل مطياف.
      4. تسجيل أول امتصاص الطيف مشتق من الاجتياح الميداني فيقوة الميكروويف الحادث من 1.0 ميغاواط، وتضمين التردد من 100 كيلو هرتز وعرض اكتساح 100 G. تحديد القوة المثلى للتجربة من خلال تنفيذ التقدمية التجربة التشبع السلطة حيث ذروة الذروة إلى الذروة من أول CW المشتقة يتم قياس إشارة الثوري بوصفها وظيفة من الجذر التربيعي للطاقة الميكروويف الحادث.
        ملاحظة: في القوى الميكروويف أقل، وشدة الزيادات في إشارة يتناسب مع الجذر التربيعي للطاقة طالما السكان التوازن في حالة دوران لا تتأثر. ومع ذلك، إذا تم زيادة الطاقة أبعد من ذلك، والاسترخاء تدور شعرية لم تعد قادرة على الحفاظ على فارق السكان التوازن الدول تدور اثنين ويبدأ السعة إشارة إلى هضبة أو "تشبع". بعد هذه النقطة، واتساع إشارة قد يقلل فعلا مع زيادة مراقبة السلطة بسبب انعكاس سكان يشبع زيادة ونقصان. وبالإضافة إلى ذلك، لأطياف وسعت مع أجنحة واسعة حيث الأساس شقة واضحة المعالم ليست السادسsible، تمديد عرض الاجتياح إلى 150 - 200 G لمنع فقدان المنطقة.
      5. تبدأ باستخدام تعديل السعة من 1.0 G.
        ملاحظة: هذه القيمة هي عينة التي تعتمد وتعدل لتقليل ضوضاء منخفضة التردد في الإشارة. إذا تم استخدام كبيرة جدا قيمة، فإنه يمكن أن تشوه أو توسيع الإشارة.
      6. ضبط الوقت وقت ثابت والتحول إلى 20.48 ميللي ثانية، اكتساح الوقت لل20.97 ثانية، وقرار 1024 نقطة.
        ملاحظة: وقت ثابت يستند أيضا على العينة وتعديلها لتصفية الضوضاء العالية التردد.
      7. بعد الفحص الأول، تعيين الحقل مركز في وسط إشارة الثوري واختيار عرض الاجتياح بحيث تتبع يتضمن إشارة والأساس كافية على أي من الجانبين.
        ملاحظة: أيضا، لتحسين إشارة نسبة / الضجيج، وزيادة عدد المسح على أساس قوة الإشارة الثوري. يشمل العرض واكتساح عدد من النقاط
      8. قياس إمكانية الوصول إلى تسمية تدور لالتصادم وكلاء الاسترخاء O 2 أو حمض ethylenediaminediacetic (NIEDDA) باستخدام القوة بروتوكولات التشبع 27 وصفت في الخطوة 6.1.4.4.
        ملاحظة: إعداد NIEDDA كما هو موضح سابقا (26).
      9. أولا يروي العينة في تجويف مع N 2 لمدة 5 دقائق (لطرد O 2). قياس أطياف لكل قوة الميكروويف بين 5-35 ديسيبل في الخطوات من 3 ديسيبل مع عرض اكتساح 30 G.
      10. ثم يروي العينة في تجويف مع الهواء لمدة 10 دقيقة وقياس الأطياف والقوى الميكروويف مختلفة (5-35 ديسيبل في الخطوات من 3 ديسيبل) كما في الخطوة 6.1.4.9.
      11. احتضان 20 ميكرولتر من بيليه الحويصلية مع 180 ميكرولتر من 50 ملي NIEDDA (في الواق الواق B أو D) في 42 درجة مئوية حمام مائي لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي لعينة وإزالة طاف باستخدام ماصة. تحميل العينة إلى الشعرية ووضعه في تجويف مرنان. كرر الخطوة 6.1.4.9.
        ملاحظة: المبدأ الكامن وراء هذه التجربة هو أن التفاعل مع الريلاكسين ممغطسأن وكلاء ز من خلال هايزنبرغ الصرف تدور منع تشبع من انعكاس إشارة والسكان. وتستخدم للذوبان في الماء NIEDDA والدهون القابلة للذوبان يا الجزيئية (2)، للصحفيين المياه (على حد سواء بكميات كبيرة والقاعات intraprotein) وغشاء تتعرض مواقع على البروتين، على التوالي.
  2. تحليل البيانات:
    ملاحظة: تحليل البيانات الثوري تتضمن الخطوات التالية: 14،22،23،25-27
    1. حساب التنقل لجنة التحقيق تدور (ΔH س -1)، وعكس عرض الخط المركزي لأول امتصاص الطيف مشتق. ΔH س -1 هو انعكاس لحرية الحركي أو ديناميات التحقيق.
    2. حساب المعلمة إمكانية الوصول (П)، وهو تقدير من الوصول لجنة التحقيق إلى وكلاء الاسترخاء تصادم ممغطس الآخرين، وذلك باستخدام الخطوات الموضحة أدناه.
      ملاحظة: تفاعل تدور مسبار مع وكلاء ممغطس الاسترخاءيعزز معدل الاسترخاء تدور شعرية (T 1) من nitroxide التي كتبها هايزنبرج صرف زيادة ونقصان. 27
      1. تقدير المعلمة إمكانية الوصول (П) من التجارب تشبع الطاقة (6.1.4.8) والتي تقاس السعة من الذروة إلى الذروة العمودي للخط وسط لأول الطيف EPR المشتقة في السلطة الميكروويف مختلفة. 25 قطعة أرض اتساع إشارة بوصفها وظيفة من الجذر التربيعي للطاقة الميكروويف وتتناسب مع المعادلة التالية (27).
        figure-protocol-1
        ملاحظة: حيث A هي السعة للإشارة، هي مقياس لمدى تجانس تشبع من خط الرنين (والذي هو عادة بين 0.5 و 1.5)، الأول هو عامل التحجيم، ف هي قوة الحادث، ويمثل القيمة التي أول السعة المشتقة هي نصف قيمته غير المشبعة.
  3. حساب ΔP 1/2 بالفرق في P 1/2 القيم في وجود (O 2 أو NIEDDA) وغياب (مع perfused N 2) وكلاء ممغطس الاسترخاء. حساب المعلمة إمكانية الوصول (П) باستخدام المعادلة:
    figure-protocol-2
    ملاحظة: أين P 1/2 المرجعية وΔH س المرجعية هي نصف القصوى قيمة التشبع السلطة وعرض الخط المركزي، على التوالي، على مستوى المرجعية (مثل DPPH (2،2-ثنائي-1-picrylhydrazyl)) 27.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

توصيف الكيمياء الحيوية من المسوخ GLIC المسمى سبين

بعد بروتوكول صفها أعلاه سوف تسفر عادة GLIC-م ب ب البروتين الانصهار في حدود 10-12 ملغ / لتر من الثقافة. على الرغم من أن قد تختلف هذه القيمة عبر طفرات مختلفة، لاسيما في المناصب دفن داخل البروتين، والعائد قد يكون خطر كبير. في هذه الحالات، قد يتطلب كميات ثقافة الارتقاء. انشقاق الانصهار ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد ثبت الطيفي EPR أن يكون النهج الهيكلي لا مثيل لها في قياس التغيرات متعلق بتكوين بروتينات الغشاء في البيئة القريبة من مسقط رأسه. هذا الأسلوب يتيح لنا نظرة خاطفة في التفاصيل الجزيئية ديناميات البروتين الذي يتم حجب في هياكل عالية الدقة من البلورات بالأشعة السينية والمجهر البرد الإلكترون. ومع ذلك، فمن المهم النظر في القيود التقنية لهذا النهج التي قد تؤثر على تطبيقها بصفة عامة على الأنظمة الأخرى وأيضا أن نأخذ في الاعتبار الحواجز التجريبية المحتملة على طول الطريق. نناقش بعض هذه الجوا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون جدا لأعضاء الحاليين والسابقين في المختبر Chakrapani للقراءة وتعليقات نقدية على المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة (1R01GM108921) وجمعية القلب الأميركية (NCRP التنمية العلماء غرانت 12SDG12070069) وSC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الطفرات الموجهة بالموقع وطفرات
Cys 10x PfuUltra HF تفاعل عازلةAgilent Technologies600380-52
dNTPSNew England BioLabs Inc‎N0447L10 ملي مولار لكل dNTP
pfu Ultra DNA polymeraseAgilent Technologies600380-512.5 U / ul
DPNINew England BioLabs Inc & lrm ؛R0176S20,000 وحدة / مل
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
SOC mediaNew England BioLabs Inc & lrm ؛B9020S
KanamycinFisher ScientficBP905
LB mediaInvitrogen127957084
Miniprep kitQIAGEN27106
C43 الخلايا المختصةLucigen60446
التعبير والتنقية
الجلوكوزفيشر ScientficD16
الكواشف الحيويةللتريبتونBP1421-500
مستخلص الخميرةAmrescoJ850
GlycerolFisher BioreagentsBP229
K2< / sub>HPO4< / sub>Amresco0705
K2< / sub>HPO4< / sub>Amresco0781
IPTG (الأيزوبروبيل ثيو بيتا الجالاكتوسيد)التكنولوجيا الحيوية الذهبيةI2481C25
قاعدة تريزماسيجما لايف ساينسT1503
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشS7653
DNase Iسيجما علوم الحياةDN25
PMSFأمريسكوM145
ليوببتينأمريسكوJ580
PepstatinAmrescoJ583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
راتنج الأميلوزنيو إنجلاند BioLabs Inc‎E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientficBP118
MaltoseAcros Organics329915000
Superdex 200 GLGE Healthcare17-5175-01
عمود كروماتوغرافيا البولي بروبلين الفارغBioRad731-1550
وضع العلامات على الدوران الموجه للموقع
MTSL (1-oxyl-2،2،5،5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) MethanethiosulfonateToronto Reaserch Chemicals IncO873900
(1-acetoxy-2،2،5،5-tetramethyl-& Delta; 3-بيرولين -3-ميثيل) ميثانيثيوسلفوناتتورونتو ريسيرش للكيماويات A167900
DMSOJT بيكر9224-01
إعادة تشكيل
الدهون AsolectinAvanti Polar Lipids Inc541602C
Biobeads (حبات البوليسترين)Bio Rad152-3920
الميثانولفيشرA413
FRET
Fluorescein-maleimideThermoFisher ScientificF-150
Tetramethylrhodamine-maleimideThermoFisher ScientificT-6027
POPCAvanti polar lipids Inc850457C
POPGAvanti polar lipids Inc840457C
E.coli< / em> مستخلص الدهون القطبيةAvanti Polar Lipids Inc100600C
HEPESSigma Life ScienceH3375
EPR قياس
TPX الشعيرات الدموية البلاستيكيةBrukerER221
EDDA (Ethylenediamine-N ، N'-diacetic acid)Aldrich158186
Ni (OH) 2< / sub>ألدريتش283622
فيشر الدهون كيماويات

المراجع

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4(2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452 (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457 (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474 (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512 (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512 (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. , (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25 (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284 (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259 (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23 (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27 (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7 (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19 (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102 (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52 (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4 (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248 (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35 (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56 (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89 (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40 (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124 (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172 (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9 (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86 (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457 (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287 (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38 (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38 (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16 (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88 (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285 (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321 (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47 (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158 (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5 (10), e271(2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98 (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142 (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30 (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289 (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11 (11), e1001714(2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288 (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23 (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46 (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281 (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51 (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (39), 9108-9111 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة