مقالة منهجية

ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض

DOI:

10.3791/54131

⸱

أكتوبر 31, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Greehey Children's Cancer Research Institute, University of Texas Health Science Center at San Antonio

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول للتحقيق في الحامض النووي الجينوم في الدراسات المريض السريرية واسعة النطاق الفحص باستخدام ميثيل ربط تسلسل الحمض النووي لقطة (MBDCap تسلسل أو مليون برميل يوميا وما يليها) التكنولوجيا وخط أنابيب تحليل المعلومات البيولوجية اللاحقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مثيلة هي واحدة من تعديلات جينية الأساسية على الحمض النووي، وهي المسؤولة عن تنظيم دقيق للجينات اللازمة للتنمية مستقرة والتفريق بين أنواع الأنسجة المختلفة. التقلبات في هذه العملية وغالبا ما يكون السمة المميزة لمختلف الأمراض مثل السرطان. هنا، ونحن الخطوط العريضة واحدة من تقنيات التسلسل الأخيرة، ميثيل ربط الحمض النووي التقاط تسلسل (MBDCap وما يليها)، وتستخدم لتحديد مثيلة في مختلف الأنسجة الطبيعية والمرض لأفواج المرضى كبيرة. وصفنا بروتوكول مفصلة لهذا النهج تخصيب تقارب جنبا إلى جنب مع خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحقيق الكمي الأمثل. وقد استخدمت هذه التقنية لتسلسل مئات المرضى عبر أنواع السرطان المختلفة كجزء من مشروع methylome 1000 (سرطان نظام Methylome).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم جينية للجينات من خلال الحامض النووي هو إحدى الآليات الأساسية اللازمة لتحديد مصير الخلية عن طريق التمايز مستقر من أنواع الأنسجة المختلفة في الجسم 1. وقد عرفت ديسريغولاتيون من هذه العملية أن تسبب الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان 2.

هذه العملية تنطوي أساسا على إضافة مجموعات الميثيل على بقايا السيتوزين في dinucleotides الدليل السياسي الشامل من الحمض النووي 3. هناك عدد من التقنيات المختلفة المستخدمة حاليا للتحقيق في هذه الآلية، ولكل منها ميزاتها الخاصة على النحو المبين في العديد من الدراسات 2-8. هنا سوف نناقش واحدة من هذه التقنيات يسمى ميثيل ربط الحمض ال....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتم الحصول على جميع الأنسجة بعد موافقة لجنة مجلس المراجعة المؤسسية وعندما يقبل جميع المشاركين على حد سواء التحليلات الجزيئية ودراسات المتابعة. تمت الموافقة على بروتوكولات لجنة الدراسات الإنسانية في جامعة تكساس مركز العلوم الصحية في سان انطونيو.

1. ملزم الميثيل الحمض النووي القبض على (MBDCap)

  1. جمع العينات وعزل الحمض النووي
    1. جمع الورم بالجملة أو عينات الأنسجة الطبيعية من البارافين جزءا لا ي....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمنا MBDCap وما يليها لدراسة التعديلات الحامض النووي في عدد كبير من المرضى من أنواع السرطان المختلفة بما في ذلك الثدي 12، بطانة الرحم 13 والبروستاتا 14، وسرطان الكبد وغيرها. نحن هنا لشرح بعض المعلومات من دراسة سرطان الثدي نشرت مؤخرا 12. في هذا المثال، استخدمنا نهج تسلسل الجينوم بأكمله لتحديد الجزر الدليل السياسي الشامل التي ميثليته تفاضلي في الورم مع الاحترام إلى وضعها الطبيعي في جميع أنحاء المناطق الجينومية مختلفة. وكشف التحقيق أن من مجموع التحقيق ا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية MBDCap وما يليها هو نهج تخصيب تقارب 3، التي تعتبر بديلا فعالا من حيث التكلفة عند التحقيق الأفواج مع عدد كبير من المرضى 15. خط أنابيب المعروضة هنا يصف اتباع نهج شامل من شراء عينة لتحليل البيانات وتفسيرها. واحدة من أهم الخطوات ووضع إجراء التضخيم PCR لتحسين كفاءة PCR من المناطق GC المخصب في الجينوم لأن هذا هو المكان الذي يحدث الحامض النووي. أيضا، لا بد من ضمان بعد التسلسل، كل عينة لديه على الأقل أكثر من 20 مليون تعيين فريد يقرأ في الجينوم. ومن المتوقع أن توفر ما يكفي من تخصيب .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير هذا البروتوكول في مختبرات الدكتور تيم هوانغ والدكتور فيكتور جين في جامعة تكساس مركز العلوم الصحية في سان انطونيو.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم هذا العمل من قبل CPRIT بحوث التدريب جائزة RP140105، وكذلك جزئيا بدعم من المعاهد الامريكية الوطنية للصحة (NIH) يمنح R01 GM114142 ومؤسسة البحوث الطبية وليام وإيلا أوينز.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم تخصيب الحمض النووي MethylminerInvitrogenME10025
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen112-05D
Bioruptor Plus جهازصوتنة دياجينودB01020001
3 M أسيتات الصوديوم ، درجة الحموضة 5.2SigmaS7899100 مل
نظام مكتبة شظايا SPRIworks Iبيكمان كولترA50100نظام بناء المكتبة الآلي بالكامل
محول الاشعالBioo Scientific514104PCR التمهيدي مزيج
QubitInvitrogenQ32854نظام القياس الكمي الفلوري
PCR ماستر ميكسKAPA العلميةKK2621PCR ماستر ميكس
AMPure XPBeckman CoulterA63881PCR تنقية الخرز
EB BufferQiagen19086
نظام تسلسل HiSeq 2000Illumina

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
  2. Nair, S. S., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CpG

مقالات ذات صلة