مقالة منهجية

وPhenotyping حمية لالفئران المعدلة وراثيا المستخدمة لدراسة الجينات المتورطة في الأمراض البشرية الشيخوخة

DOI:

10.3791/54136

⸱

يوليو 14, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Health Sciences, Yale University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم نهج علم الوراثة العكسي لفهم عائلات الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية ، باستخدام الفأر كنظام نموذجي ، ويتم وصف جدول التنميط الظاهري اللاحق للفأر. نظرا لأن الفئران معيبة في جين مهم ، HtrA2 ، أظهرت أعراض باركنسون ، فإن نظام التنميط الظاهري يركز على تحديد العيوب العصبية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت الأمراض المرتبطة بالعمر منتشرة بشكل متزايد ويستمر العبء في النمو مع تقدم سكاننا في العمر. العلاجات الفعالة ضرورية لتقليل تأثير الحالات المنهكة ولكنها تظل بعيدة المنال في كثير من الحالات. فقط من خلال فهم أسباب وأمراض الأمراض المرتبطة بالشيخوخة ، يمكن للعلماء البدء في تحديد الأهداف العلاجية المحتملة وتطوير استراتيجيات التدخل. أكثر الحالات المرتبطة بالعمر شيوعا هي الاضطرابات التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون والعمى. التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو السبب الرئيسي للعمى لدى كبار السن. حددت دراسات الارتباط على نطاق الجينوم سابقا المواقع المرتبطة بزيادة القابلية للإصابة بهذا المرض وحددت منطقتين مهمتين: العامل التكميلي H (CFH) وموضع 10q26 ، حيث توجد جينات القابلية لاعتلال البقعة المرتبط بالعمر 2 (ARMS2) وعامل متطلبات درجات الحرارة المرتفعة A1 (HtrA1). يعمل CFH كمنظم سلبي للمسار البديل (AP) للنظام التكميلي بينما HtrA1 هو بروتياز سيرين خارج الخلية. يقع ARMS2 في المنبع من HtrA1 في جينوم الرئيسيات ، على الرغم من أن الجين غائب في الفئران. لدراسة تأثيرات هذه الجينات ، تم إنشاء خطوط الفئران المتوافقة مع البشر من Cfh و ARMS2 ، والضربات القاضية ل Cfh و HtrA1 و HtrA2 و HtrA3 و HtrA4 بالإضافة إلى الحذف العصبي المشروط ل HtrA2. من بين جميع الفئران المعدلة وراثيا ، أنتجت الفئران المعدلة وراثيا فقط الفئران التي تفتقر إلى HtrA2 ، سواء بشكل منهجي أو في الأنسجة العصبية ، أظهرت أنماطا ظاهرية واضحة. من أجل فحص هذه الفئران بدقة وبشكل منهجي ، تم وضع جدول تمهيدي أولي للأنماط الظاهرية ، يتكون من سلسلة من الاختبارات المتعلقة بمرضين رئيسيين أهميتهما: AMD ومرض باركنسون. يمكن أن تخضع الفئران المعدلة وراثيا لتجارب مناسبة لتحديد الأنماط الظاهرية التي قد تكون مرتبطة بالأمراض المرتبطة بالبشر. يتم تقديم نظام التنميط الظاهري مع التركيز على الميتوكوندريا هنا جنبا إلى جنب مع النتائج التمثيلية من اختبارات الاهتمام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وبدأت الأمراض المرتبطة بالسن انتشارا في المجتمع الحديث. مع تحسن العلوم الطبية وزيادة متوسط ​​العمر المتوقع، لا يزال السكان السن وعبء هذه الأمراض ينمو. هي العلاجات الفعالة الضرورية للتقليل من تأثير الظروف المنهكة ولكن لا تزال بعيدة المنال في كثير من الحالات. فقط من خلال فهم أسباب وعلم الأمراض من الأمراض المرتبطة بالشيخوخة يمكن للعلماء أن تبدأ في تحديد الأهداف العلاجية المحتملة ووضع استراتيجيات للتدخل. وتشمل الشروط المرتبطة بالعمر المشتركة الاضطرابات العصبية مثل مرض باركنسون (PD) والضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). PD هو اضطراب الحركة الأكثر شيوعا التي تسببها التنكس العصبي في الإنسان. تظهر معظم المرضى PD أعراض مثل الراحة ورعاش، وبطء الحركة والتصلب بعد 50 سنة من العمر. كما لوحظ بداية مبكرة في ما يقرب من 10٪ من الحالات.

AMD هي السبب الرئيسي للعمى فيوكبار السن، وإلحاق أضرار تدريجيا المستقبلات الضوئية والظهارة الصبغية الشبكية (RPE) في العين. هو ضعف الرؤية المركزية ولكن الرؤية المحيطية لا يتأثر عموما. هناك نوعان من AMD. في شكل "الجافة"، والودائع بروتين الخلية المعروفة باسم شكل براريق شفافة بين RPE وغشاء بروك (BM)، مما أدى إلى ضمور الجغرافي وعدم وضوح الرؤية المركزية. وأشد "الرطب" نتائج النموذج من اتساع الأوعية الدموية من المشيمية عبر BM في RPE ومستقبلة للضوء طبقات ويمكن أن يؤدي إلى hamorrhaging تحت شبكية العين الذي يسبب تلف دائم في نسيج الشبكية. الجينوم الدراسات جمعية اسعة حددت سابقا مواضع التي ترتبط مع زيادة القابلية للإصابة بهذا المرض، وحددت منطقتين من الفائدة: عامل مكمل H (CFH) على كروموسوم 1 ومكان 10q26، حيث المرتبطة بالعمر اعتلال البقعة قابلية 2 (ARMS2) و ارتفاع في درجة الحرارة عامل شرط A1 تقع (HtrA1) الجينات 1-5 . مزيج من هذه الأليلات تزيد من احتمال AMD بطريقة تعتمد على الجرعة وتعدد الأشكال محددة يمكن أن تكون مرتبطة بشكل تفضيلي مع أي من أشكال رطبة أو جافة من AMD 3-6.

يعمل CFH كمنظم السلبية للمسار بديل (ا ف ب) من نظام المتممة التي تحول دون تفعيل C3. وقد تم ربط والنوكليوتيدات تعدد الأشكال واحد (SNP) إلى زيادة خطر الإصابة AMD، مما تسبب في تبادل التيروزين 402 في اكسون 9 مع الحامض الاميني بسبب T إلى C الاستبدال 1. في AMD يعتقد أن وكالة اسوشييتد برس هو misregulated بسبب فقدان وظيفة CFH لكن ما إذا كان يلعب SNP دور سببي غير واضح. فرضية واحدة هي أن الحامض الاميني موجبة الشحنة يعتقد أن ينفي قدرة CFH لربط التفاعل البروتينات بروتين سي التفاعلي وكبريتات الهيبارين 1،7. في الدراسات المختبرية من CFH Y402H توفر نتائج متضاربة بسبب خلافات الوظيفية بين المتغيرات، وفي فيفو العمل في <م> CFH - / - الفئران معربا عن أنسنة CFH هو مستمر 8. يقع ARMS2 المنبع HtrA1 في الجينوم الرئيسيات، على الرغم من أن الجين هو غائب في الفئران. HtrA1 هو الأنزيم البروتيني سيرين لكن يتميز ARMS2 سيئة. جعلت اختلال التوازن الربط بين تعدد الأشكال في موضع المرتبطة AMD-صعوبة في تحديد المساهمات في خطر التحولات الفردية من الجينات في هذه المنطقة، ولكن العمل الأخير قد اقترح أنه من overexpression من HtrA1 بدلا من ARMS2 أن يؤدي إلى اتساع الأوعية الدموية و ودائع البروتين تحت الشبكية 9-11. ومع ذلك، وعلى مقربة من الجينات في هذا الموضع قد تسمح لالتفاعلات التي لا يمكن دراستها باستخدام الجينات المحورة إدراجها بشكل عشوائي.

بالإضافة إلى AMD، ارتبط الأسرة HtrA البروتياز سيرين مع العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. جميع البروتينات HtrA تحتوي على نطاق سيرين البروتيني تليها نطاق PDZ واحد على الأقل C-المحطة. HtrA1، HtrA3 وHtrA4 مشاركة غرامتأكل التماثل، ويتألف من مجال إشارة الببتيد، وعامل النمو الذي يشبه الانسولين ملزمة، مجال مثبط البروتياز Kazal، المجال سيرين البروتيني ومجال PDZ. HtrA2 لديه مختلفة N-محطة، ويتألف من سلسلة توطين الميتوكوندريا، مجال الغشاء والمانع من موت الخلايا المبرمج نطاق ملزم تليها البروتيني وPDZ المجالات 12-16. وينظم HtrA1 الثدييات من إعادة الناجم عن الركيزة في موقع نشط المجال البروتيني لها 17-20، ويمكن أيضا HtrA2 يكون منظم من قبل التفاعل بين البروتيني سيرين والمجالات PDZ أن يقمع النشاط البروتيني 21. ومن المثير للاهتمام، لا يظهر المجال PDZ للتشاور تنظيم مماثل لHtrA3 16. ويمكن أيضا أن البروتياز HtrA ينظم ذلك العوامل الخارجية: وقد تجلى ذلك مؤخرا أنه يوجد التفاعل التنظيمي بين HtrA1 وprotoporphyrins 22 و HtrA2 يمكن تنظيمها من قبل الفسفرة على تفعيل كيناز P38 MAPالمسار في الطريقة التي تعتمد على PINK1 23. وقد تم توثيق حذف كل فرد من أفراد الأسرة HtrA في الفئران، ولكن الآثار الميكانيكية هي في معظمها غير واضح ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود الظواهر المرئية.

HtrA1 يلعب وظيفة هامة في مراقبة الجودة البروتين وارتبط misregulation، أو طفرة مع العديد من الأمراض البشرية المختلفة بما في ذلك التهاب المفاصل والسرطان وزيادة خطر AMD 3،4،24-32. ارتبط فقدان وظيفة HtrA2 في الأنسجة العصبية مع الظواهر PD في البشر والفئران، في حين أن خسارتها من نتائج العينات غير العصبية في تسارع الشيخوخة 33-37. ارتبط التقلبات HtrA3 مع الأمراض بما فيها تسمم الحمل وأنواع معينة من السرطان 38،39. يصل التنظيم وقد لوحظ من HtrA4 في مشيمة من مرضى تسمم الحمل ولكن الفئران خروج المغلوب لا تعرض النمط الظاهري العلني 40،41. وكان عدم وجود الظواهر التي لوحظت في بعض الفئران خروج المغلوبيفترض أن يكون نتيجة للتعويض بين أفراد الأسرة HtrA: أنه يعتقد أن كلا HtrA4 وHtrA1 التفاعل مع الأسرة TGF-B من البروتينات، مما يسمح للتعويض من HtrA1 على حذف HtrA4 41. وبالمثل، ويعتقد أنه منذ HtrA1 وHtrA3 يكون حاصلا على درجة عالية من homologies نطاق قد يكون لديهم وظائف تكميلية 42. ومع ذلك، فقد قيل أن البروتينات HtrA قد أدوارا معادية جزئيا، وتنافس لتنظيم الأهداف المشتركة 43.

لمزيد من التحقيق في هذه عوامل الخطر تم إنشاء ثلاثة خطوط الماوس أنسنة المغلوب في. في CFH TM1 (CFH * 9) يتم استبدال jhoh وCFH TM2 (CFH * 9) jhoh، اكسون 9 من الجينات CFH مع اكسون 9 من نديد البشري. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh بترميز التيروزين غير مرض المرتبط بقايا في موقف 402، في حين CFH TM2 (CFH * 9) jhoh يحمل Y402H، SNP المصاحب للخطر. فيARMS2 tm1jhoh تسلسل ARMS2 البشري والتي تستهدف منطقة المنبع من HtrA1. تم رفعه توقف تسلسل يحيط loxP ضعت المنبع من تسلسل الجين ولكن المصب من المروج UbiC شمل عن طريق عبور للفئران OzCre، التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية recombinase تحت سيطرة المروج Rosa26، كما هو موضح سابقا (34). وبالإضافة إلى هذه الضربة القاضية في خطوط، تم إنشاء أليل خروج المغلوب الشرطية لCFH وHtrA1 (tm1jhoh وtm1jhoh HtrA1 CFH)، فضلا عن غيرهم من أفراد الأسرة HtrA المعروف: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh)، HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) وHtrA4 ( tm1jhoh HtrA4). تم إنشاء بالضربة القاضية خط الجرثومية من خلال عبور الفئران OzCre للحيوانات هندستها لتطويق الإكسونات محددة مع مواقع loxP، مثل أن حذف يسبب تحولا إطار و / أو حذف المجال النشط (CFH، اكسون 3، HtrA1، الإكسونات 2-3، HtrA2: الإكسونات 2-4، HtrA3. اكسون 3، HtrA4. الإكسونات 4-6) 34،41. وحذف العصبي للHtrA2، حذف باستخدام لجنة المساواة العرقية recombinase تحت سيطرة المروج Nestin (HtrA2 flox، تيراغرام (نيس-لجنة المساواة العرقية) 1Kln / J)، كما وصفت 34. الفئران الوحيدة التي تفتقر إلى HtrA2، إما بشكل منتظم أو في الأنسجة العصبية، عرض الظواهر واضحة، مع تقديم الظواهر الشلل الارتعاشي.

منذ وافترض بعض هذه الجينات التي تهم أن تكون مترجمة إلى الميتوكوندريا 11،44-47، وحذف HtrA2 إنشاء الظواهر الشلل الارتعاشي، وهو نظام phenotyping مع التركيز الميتوكوندريا والعصبية وصفها هنا ويتم تقديم نتائج ممثلة من الاختبارات ذات الاهتمام . من أجل دراسة فئران معدلة وراثيا تنتج لتحقيق الإنسان، وأمراض المرتبطة بالعمر شامل ومنهجي أنشئ جدول phenotyping الأولي، ويتكون من سلسلة من الاختبارات المتعلقة الرئيسيتينأمراض الفائدة: AMD والشلل الرعاش.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت الدراسات على الحيوانات في الامتثال مع المعاهد الوطنية للصحة التوصيات في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ورعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC) في جامعة ييل: الأخلاقيات بيان.

1. السلوكية اختبار الفئران المعدلة وراثيا

ملاحظة: يجب أن تخضع جميع الفئران لنفس الاختبار نظام للحد من الخلافات في التعود على التعامل معها. يجب أن يتم تنفيذ الاختبارات في نفس الوقت من اليوم في كل مرة.

  1. حديثي الولادة هند الاطراف اختبار
    ملاحظة: يتم إجراء اختبار أطرافهم هند يوميا من يوم ما بعد الولادة (P) 4 إلى P10 لتقييم القريبة هند أطرافهم القوة العضلية والضعف والتعب.
    1. الفئران النقل إلى منطقة الاختبار والسماح للراحة لمدة 30 دقيقة قبل إجراء الاختبار.
    2. إعداد جهاز الفحص عن طريق تنظيف 50 مل أنبوب مخروطي مع الايثانول 70٪، مما دفع اثنين (-P8 P4) أو واحد (P9-P10) كرات القطن لأسفل رأوبي وتأمين في وضع عمودي.
    3. إزالة الجرو واحد من القفص وسجل الوزن. إبقاء الجرو في عقد صينية على لوحة الحرارة كلما لا يختبر.
    4. تعليق بلطف أطرافه الخلفية من الوليد على حافة أنبوب مخروطي الشكل، بحيث يواجه أسفل نحو كرات القطن. حساب عدد من محاولات سحب المحرز والكمون مقياس أن يسقط باستخدام ساعة توقيت.
    5. أكرر مرة أخرى ثم تسمية الجرو مع علامة. بعد ذلك، وتحديد الجراء P6 التي كتبها قطة أخمص قدميه. فرك بلطف الجراء مع الفراش من قفص المنزل قبل أن يحل محل.
    6. مسح أنبوب مخروطي مع 70٪ من الإيثانول.
    7. تكرار التجارب على الجرو المقبل حتى تم اختبار القمامة كلها.
    8. التخلص من الكرة القطن وأنبوب مخروطي الشكل. تنظيف جميع المعدات مع 70٪ من الإيثانول.
  2. اختبار مراقبة فطيم
    ملاحظة: يخضع للامتحان المراقبة فطيم يوميا من P19 P21 إلى ليسجل مستويات الحركة والنشاط العام.
    1. الفئران النقل إلى منطقة اختبار لالثانية تسمح للراحة لمدة 30 دقيقة قبل إجراء الاختبار.
    2. إعداد زجاجي اختبار مربع ملحوظ مع شبكة 6X6 من 2 الساحات بوصة على قاعدة عن طريق تنظيف مع 70٪ من الإيثانول. إعداد أجهزة الفيديو إلى الجانب بحيث مربع كامل في مجال العرض. حافظ على إعداد والمناطق المحيطة بها هي نفسها في كل يوم لتجنب إدخال الجدة.
    3. إزالة فطيم واحد من القفص ووضعه في كوب عقد نظيفة. الوزن القياسي.
    4. بدء تسجيل الفيديو من خلال تصوير بطاقة الهوية الاختبار، مع رقم الهوية الماوس والعمر وتاريخ الاختبار. نقل الماوس من عقد كوب من ساحة المركز. الوقت لمدة ثلاث دقائق، عد عدد من خطوط اجتاز كل من الكفوف الأمامية للفأرة أثناء الاختبار.
    5. عودة الماوس إلى القفص ونهاية تسجيل الفيديو نظيفة.
    6. تنظيف جهاز الفحص مع 70٪ من الإيثانول.
    7. كرر حتى يتم اختبار جميع القمامة، ثم يعود كل الجراء إلى قفص المنزل.
    8. تنظيف جميع معدات الاختبار مع 70٪ من الإيثانول.
    9. عن طريق الفيديو، quantitate عدد من تربية الأحداث فرز بعد الملاحظة البصرية، حيث يقف الماوس مع كل الكفوف الأمامية واضحة للدعم، والاستمالة الأحداث، حيث تشارك كل من الجبهة الكفوف في التنظيف.
  3. شبكة أسلاك قبضة اختبار قوة
    ملاحظة: يتم إجراء اختبار قوة قبضة يوما بعد يوم بين P22 و P26، لتقييم القوة العصبية والعضلية.
    1. الفئران النقل إلى منطقة الاختبار وتسمح للراحة في قفص المنزل لمدة 30 دقيقة قبل إجراء الاختبار.
    2. إعداد جهاز عن طريق تنظيف مربع وشبكات شبكي الشبكة مع 70٪ من الإيثانول. وضع فقاعة التفاف في الجزء السفلي من مربع، وتغطي بالورق.
    3. الفئران منفصلة في مجموعات من ثلاثة، ووضع في أكواب عقد الفردية.
    4. ضع الماوس الأول على مركز للأسلاك وعكس ببطء 10-20 سم فوق سطح ناعم في الجزء السفلي من مربع شبكي. قياس الكمون في الانخفاض باستخدام ساعة توقيت. إنهاء الاختبار بعد أن انقضت 60 ثانية إذا كان الماوس لاخريف.
    5. عودة الماوس لعقد الكأس، يمسح شبكة مع 70٪ من الإيثانول واستبدال ورقة خلال التفاف فقاعة. إجراء اختبار على الفئران المتبقيتين في المجموعة قبل أن تعود إلى الأول. كرر حتى تم اختبار كل فأر ما مجموعه ثلاث مرات.
    6. عودة المجموعة إلى قفص نظيفة وتواصل مع باقي المجموعات. إذا كان هناك أقل من ثلاثة الفئران في أي مجموعة، تأكد من السماح لمدة 5 دقائق بين المحاكمة الفاصل الزمني الاسترداد.
    7. إعادة جميع الفئران إلى قفص المنزل، والتخلص من الورق ومعدات الاختبار نظيفة مع الايثانول 70٪.

2. فحص بنية شبكية العين

  1. تخدير الحيوانات في P30-35 عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). تقييم عمق التخدير بواسطة معسر قاطع الطريق والمضي قدما فقط في حالة عدم وجود استجابة، وذلك تمشيا مع المبادئ التوجيهية IACUC. يروي مع 4٪ PFA / PBS 48.
  2. لإزالة العين، وتنظيف الجلد في الاشتراكية شقالشركة المصرية للاتصالات مع 70٪ من الإيثانول، قبل قطع طريق الجلد في قاعدة الجمجمة. قشر العودة الجلد لفضح الجمجمة ونظيفة مع الايثانول 70٪. استخدام أدوات نظيفة، وقطع بعناية من خلال الجمجمة للوصول إلى تجويف العين وكشف العينين. قطع العصب البصري، وإزالة بلطف العين من مأخذ وشطف في برنامج تلفزيوني.
  3. إصلاح العين في 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. وضع العين في طبق بتري صغيرة تحتوي على برنامج تلفزيوني. إجراء شق صغير في وسط القرنية باستخدام مقص إزالة غرزة. إزالة القرنية عن طريق خفض الحافة بين القرنية والصلبة. استخدام ملقط لإزالة القزحية. وأخيرا، تقشر طبقات RPE، وترك الشبكية سليمة والعدسة في مكانها.
    ملاحظة: إن 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني تثبيت يسبب RPE مفرزة السماح للRPE إلى مقشر بسهولة من خارج شبكية العين.
  5. إعادة الإصلاح في 4٪ PFA / 30٪ سكروز / برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل أن تعود العين إلى طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني. سحب ليونق باستخدام ملقط، وبذلك يصبح الجسم الزجاجي معها.
  6. Cryoprotect في 30٪ سكروز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  7. عيون معطف في الأمثل مركب قطع درجة الحرارة (أكتوبر) ونقل إلى قالب دمج تحتوي أكتوبر الطازجة. توجيه العين بحيث المستوى السهمي موازية مع وجه القطع، وذلك باستخدام عدد قليل من الحركات ممكن، وتجنب إدخال فقاعات الهواء. فلاش تجميد بغمر القالب في حمام الثلج / الايثانول الجاف. متجر بنات في -80 درجة مئوية.
  8. باستخدام ناظم البرد، وقطع 20 ميكرون أقسام السهمي وجمع على الشرائح precleaned.
  9. أقسام وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين وفقا لبروتوكولات القياسية 49. صورة باستخدام المجهر الضوئي مجهزة للفحص المجهري مشرق الميدان.

3. هستوكيميائية تلطيخ

  1. إعداد عينة
    1. الموت ببطء الحيوانات في P30-35 باستخدام جرعة زائدة الأيزوفلورين (30٪ في غليكول البروبيلين) عن طريق الاستنشاق انخفاض مفتوحة. تقييم القتل الرحيم من وقفمن التنفس، وضربات القلب وعدم الاستجابة للمعسر قاطع الطريق. تأكيد وفاة خلع عنق الرحم وإزالة الجهاز، وذلك تمشيا مع المبادئ التوجيهية IACUC.
    2. لإزالة الدماغ، وتنظيف الجلد في موقع شق مع 70٪ من الإيثانول، قبل قطع طريق الجلد في قاعدة الجمجمة. قشر العودة الجلد لفضح الجمجمة ونظيفة مع الايثانول 70٪. استخدام أدوات نظيفة، وقطع بعناية من خلال الجمجمة وإزالة لفضح الدماغ. إزالة الأغشية، وإزالة بلطف الدماغ من تجويف الجمجمة. شطف في برنامج تلفزيوني.
    3. معطف الدماغ في أكتوبر ونقلها إلى قالب دمج تحتوي أكتوبر الطازجة. توجيه الدماغ بحيث المستوى السهمي موازية مع وجه القطع، وذلك باستخدام عدد قليل من الحركات ممكن، وتجنب إدخال فقاعات الهواء. فلاش تجميد بغمر العفن في الجليد حمام جاف / الإيثانول ومخزن في -80 درجة مئوية.
    4. باستخدام ناظم البرد، وقطع 10 ميكرون أقسام السهمي وجمع على الشرائح precleaned.
    2. <لى> NADH ديافوراز تلطيخ
    1. إعداد 0.05 العازلة M تريس، ودرجة الحموضة 7.6 عن طريق إذابة 5.72 ز تريس، حمض الهيدروكلوريك و1.66 ز قاعدة تريس في المياه 1L-منزوع الأيونات. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أسابيع.
    2. يعد حل NADH (2.25 ملي NADH في 0.05 عازلة M تريس). قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
    3. يعد حل NBT (2.5 ملي نيترو-الأزرق نتروبلو في 0.05 عازلة M تريس). تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أسابيع في زجاجة.
    4. الجمع بين كميات متساوية من حل NADH وحل NBT لجعل حل تلطيخ وإضافة 1 مل لكل شريحة. احتضان عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب لمدة 30 دقيقة.
    5. نضح حل تلطيخ ويغسل ثلاث مرات مع DH 2 O.
    6. يغسل ثلاث مرات في كل تصاعدي وتنازلي تركيزات من الأسيتون / درهم 2 0 (30٪، 60٪، 90٪، 60٪، 30٪) لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. شطف ثلاث مرات في DH 2 O وجبل المقاطع مع الوسط المائي. صورة باستخدام المجهر الضوئي مجهزة لو مشرقالمجهر درع. تلطيخ الأزرق يتوافق مع النشاط الأنزيمي.
  2. السكسينات هيدروجيناز هستوكيميائية تلطيخ
    1. تحضير 0.2 M الصوديوم أحادي فوسفات / درهم 2 O و 0.2 M الصوديوم ثنائي القاعدة فوسفات / درهم 2 O.
    2. جعل 0.2 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.6 عن طريق الجمع بين 3 أجزاء الفوسفات أحادي القاعدة مع 20 أجزاء فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة.
    3. يعد حل تلطيخ (0.1 M سكسينات الصوديوم، 1.25 M NBT في 0.2 م العازلة الفوسفات) وإضافة 1 مل لكل شريحة. احتضان عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب لمدة 60 دقيقة.
    4. نضح حل تلطيخ ويغسل ثلاث مرات في DH 2 O.
    5. يغسل ثلاث مرات في كل من التصاعدي والتنازلي تركيزات الأسيتون / درهم 2 O (30٪، 60٪، 90٪، 60٪، 30٪) لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. شطف ثلاث مرات في DH 2 O وجبل المقاطع مع الوسط المائي. صورة باستخدام المجهر الضوئي مجهزة للفحص المجهري مشرق الميدان. تلطيخ الأزرق يتوافق مع ENالنشاط zymatic.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا القسم أمثلة على النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذه الأساليب. في اختبار الخلفية الأطراف الاصطناعية، أدلى عدد من محاولات سحب وتتلخص خلال اختبارين متتاليين لكل يوم الكمون في الانخفاض. هذا الاختبار يمكن استخدامها للمقارنة بين مجموعات مختلفة وراثيا للتمييز الفئران مع انخفاض القوة العصبية والعضلية tm1jhoh HtrA2 (HTRA2 KO) الفئران في الشكل 1A - B إثبات أي تغيير في عدد تسحب والكمون ليسق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك حاجة إلى علاجات فعالة للحد من تأثير المنهكة الظروف المتصلة بالشيخوخة الإنسان، ولكنها لا تزال بعيدة المنال بالنسبة لكثير من الظروف. لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة ووضع استراتيجيات للتدخل، لا بد أولا من فهم أسباب وعلم الأمراض من الأمراض المرتبطة بالشيخوخة. ليس كل الفئران المعدلة وراثيا الحالية فورا مع الظواهر واضحة التي ترتبط بهذا المرض من الاهتمام، حتى لو كان قد سبق ترتبط هذه الجينات إلى حالة في الدراسات الإنسانية. وبالتالي الحاجة إلى مزيد من التحقيقات المنهجية ويجب أن تخضع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وجاء تمويل هذا البحث من المؤسسة الطبية دفلي نبات وصندوق أبحاث في كلية ييل الطبية العميد (JH). نشكر الدكتور كلير كونيغ للمساعدة في التجارب السلوكية. وراثيا تم إنشاؤها خطوط الماوس مهندسة في Ozgene (بيرث، أستراليا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إيثانولديكون (فيشر ساينتفيكيف)435541
أنبوب مخروطي 50 ملفيشر ساينتفيككرات
حصيرةحرارة وول مارت
صن بيم0000756-500-000
صينية عقد (صينية مكعبات ثلج)ساعة توقيت إلكترونية وول مارت
GOGOPC396
صندوق زجاجشبكي شيدت في ورشةعمل 12 "× 12"   ؛
Vixia HF R400 كاميرا فيديوCanon8155B004
9 أوقية أكواب شفافةوول مارت
1/4 بوصة شبكة سلكية204331884 هوم ديبوت(عبر الإنترنت) / 554219 (في المتجر)12 بوصة × 12 بوصة & nbsp ؛
التفاف الفقاعاتVWR470092-416
ملقط عينة مستقيمةVWR82027-438
ملقط تشريح ذو طرف دقيقVWR82027-408
مقص ناعمVWR82027-578
محلول بارافورمالدهيد 16٪علوم المجهر الإلكتروني15710
10x فوسفات محلول ملحي مخزن درجة الحموضة 7.4التحليل الحيوي الأمريكيAB11072-04000
السكروزJT بيكر4072-01
شرائح سوبر فروستفيشر ساينتفيك12-550-15
محلول بقع الهيماتوكسيلينفيشر Scientific (Ricca)353016
البقع Eosin YFisher Scientific (Ricca)2845-32
Tris hydrochlorideSigmaT3253
تريسالأمريكية التحليل الحيويAB02000-01000
نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد ، هيدرات ملح ثنائي الصوديوم المختزلسيجماN8129
نيتروتيرازوليوم كلوريد أزرقسيجماN6876
الأسيتونجي تي بيكر9006-05
فوسفات الصوديوم أحادي الهيدرات أحادي القاعدةسيجماS9638
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي الهيدراتSigmaS9390
سكسينات الصوديوم ثنائي القاعدة سداسي هيدراتSigmaS2378
VectaMount تركيب مائي متوسطVector LabsH-5501-60
غطاء زجاجيفيشر Scientific12-545-M60 مم × 24 مم
AxioImager A1 مجهرزايس
كاميرا فيديو ثلاثي القوائمأمازون
درجة حرارة القطع المثلى (OCT)Fischer Scientific23730571
Cryostat Sectioning  آلةLeica CM1900توقف ولكن منذ ذلك الحين تم استبداله ب CM1950
قطنية 1443222 محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
  2. Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
  3. Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
  4. Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
  5. Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
  6. Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
  7. Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
  8. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
  9. Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
  10. Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
  11. Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
  12. Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
  13. Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
  14. Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
  15. Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
  16. Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142(2015).
  17. Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
  18. Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
  19. Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19(2009).
  20. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
  21. Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
  22. Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362(2014).
  23. Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
  24. Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
  25. Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
  26. Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
  27. Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
  28. Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
  29. Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
  30. Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
  31. Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
  32. Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959(2011).
  33. Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
  34. Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789(2014).
  35. Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
  36. Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
  37. Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
  38. Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956(2012).
  39. Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
  40. Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
  41. Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
  42. Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
  43. Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
  44. Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
  45. Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
  46. Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
  47. Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
  48. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  49. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
  50. Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
  51. El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
  52. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  53. Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
  54. Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
  55. Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NADH HtrA2

مقالات ذات صلة