مقالة منهجية

كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

DOI:

10.3791/54146

⸱

يونيو 25, 2016

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف مقايسة لونية للكشف عن وجود السكريات المختزلة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم العثور على عملية إنبات الأبواغ الداخلية في المطثية العسيرة وغيرها من المطثيات ، بشكل متزايد لتختلف عن البكتيريا المكونة للأبواغ النموذجية ، Bacillus subtilis. يتم تشغيل الإنبات بواسطة نبتات جزيئات صغيرة ويحدث دون الحاجة إلى التخليق الجزيئي الكبير. على الرغم من وجود اختلافات بين آليات إنبات الأبواغ في أنواع Bacillus و Clostridium ، إلا أن الشرط الشائع هو التحلل المائي للقشرة الشبيهة بالببتيدوغليكان والذي يسمح للب البوغ بالانتفاخ وإعادة الترطيب. بعد الجفاف ، يمكن أن يبدأ التمثيل الغذائي وهذا يؤدي في النهاية إلى نمو خلية نباتية. قد يكون اكتشاف شظايا القشرة المتحللة أثناء إنبات الأبواغ أمرا صعبا ويمكن أن تكون التعديلات على المقايسات الموصوفة سابقا مربكة أو يصعب إعادة إنتاجها. وبالتالي ، بناء على تقريرنا الأخير باستخدام هذا الاختبار ، نقوم بتفصيل بروتوكول خطوة بخطوة للكشف اللوني عن شظايا القشرة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأبواغ هي عملية الأيض أشكال نائمة من البكتيريا التي تسمح للبكتيريا ان تستمر في البيئات غير المواتية. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هو فعل تشكيل بوغ بالحرمان من المغذيات ولكن يمكن التحكم في هذه العملية من خلال التغييرات في درجة الحموضة، والتعرض للأكسجين أو ضغوط أخرى 1. بينما في شكل بوغ نائمة عملية الأيض، والبكتيريا تقاوم الأشعة فوق البنفسجية، جفاف، ارتفاع درجات الحرارة، وتجميد 2. معظم المعارف على عملية تكاثر يأتي من دراسات في الكائن الحي نموذج، العصوية الرقيقة. تبدأ عملية تبوغ مع تكرار الحمض النووي وتشكيل 3،4 خيوط المحوري. والحاجز غير المتماثلة ثم يقسم الخلية إلى قسمين الحجم غير متكافئ. مقصورة أكبر، الخلية الأم، يجتاح حجرة صغيرة، وforespore. كل من الخلية الأم وforespore تنسيق التعبير الجيني لانضاج الجراثيم والخلية الأم انحلال في نهاية المطاف، والإفراج عن دورمانر بوغ في البيئة المحيطة 1.

يتم حفظها هيكل الجراثيم والتكوين عبر العديد من الأنواع البكتيرية. جوهر بوغ يحتوي على نسبة الماء أقل من الخلية النباتية وغنية بحمض dipicolinic (د ب أ) 1،2. خلال تشكيل بوغ، يتم ضخ DPA في صلب بوغ في مقابل الماء. المحيطة الأساسية هو غشاء بوغ الداخلي حيث، في معظم البكتيريا بوغ تشكيل، والمستقبلات التي تعترف الجزيئات الصغيرة التي تحفز إنبات (germinants) تقع 2. يقع خارج الغشاء الداخلي للبوغ هو طبقة من ببتيدوغليكان جدار الخلية. وهناك طبقة ببتيدوغليكان المتخصصة (القشرة) تحيط ببتيدوغليكان جدار الخلية وتتكون من العديد من نفس المكونات كما ببتيدوغليكان جدار الخلية [بالتناوب N-اسيتيل (ناغ) وحمض N-acetylmuramic (NAM)]. ومع ذلك، فقد تم تحويل ما يقرب من 50٪ من بقايا حركة عدم الانحياز في القشرة لالموراميك-δ لاكتام 5،6 . خلال إنبات الجراثيم، يتم التعرف على هذه المخلفات الموراميك-δ لاكتام من قبل بوغ قشرة الانزيمات التحللي (SCLEs)، مما يسمح للقشرة إلى أن يتحلل (وهي عملية ضرورية لإتمام الإنبات) ولكن ليس جدار الخلية. المحيطة القشرة هو الغشاء الخارجي وعدة طبقات من البروتينات معطف 2.

السيطرة على عملية الإنبات أمرا شديد الأهمية للبكتيريا تشكيل بوغ. يبدأ الإنبات عندما تتفاعل مستقبلات germinant مع germinants كل فيما يخصه 2. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هذه germinants هي الأحماض الأمينية والسكريات، النيوكليوتيدات، أيونات أو خليط منها 2. C. يبدأ صعب بوغ إنبات عن طريق مزيج من بعض أنواع الحوامض الصفراء، [على سبيل المثال، حمض taurocholic (TA)] والأحماض الأمينية (على سبيل المثال، الجلايسين) 7-10. على الرغم من وجود اختلافات بين C. العسيرة مسار الإنبات ومسارات درس في البعض تشكيل بوغالبكتيريا، مثل B. الرقيقة، مشتركة بين جميع هو شرط مطلق للحط من القشرة بوغ للسماح للخلية النباتية لتنمو من بذرة نبتت 2،8. تدهور القشرة يمكن أن يتحقق من قبل SCLEs CwlJ / SleB (كما هو موجود في B. الرقيقة) أو SleC (كما هو موجود في كثير من المطثيات). قشرة المائي يقلل من القيود على جدار الخلية والجراثيم. وهذا يسمح لمعالجة الجفاف الأساسية كاملة، خطوة ضرورية في تنشيط العديد من البروتينات اللازمة لعمليات أيض الخلايا 2.

عندما تنبت الجراثيم، والتغيرات بوغ نائمة من دولة مرحلة مشرقة لدولة مرحلة مظلمة وهذه العملية يمكن قياس التغير في الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر 11. ويشير التقرير السابق أن جزءا كبيرا من هذا التغيير في التطوير التنظيمي ويرجع ذلك إلى الإفراج عن DPA من بوغ 12. خلال دراستنا الأخيرة، سعينا لمقارنة توقيت C. صعب بوغ الإنبات ومراقبةالافراج عن الشؤون السياسية والقشرة شظايا 9. لهذه الدراسة انه من الضروري مراقبة الإفراج عن شظايا القشرة لأنها بدأت سيصدر من قبل الإنبات جراثيم.

واستند الفحص اللونية المستخدمة هنا على طريقة للكشف عن السكريات مع الحد من الغايات وضعت Ghuysen وآخرون. 13. لأن الآخرين قد وصف بروتوكولات للكشف عن السكريات المختزلة 14 أو عدلت هذه البروتوكولات 15، والأدب حول هذا الموضوع يمكن أن يكون مربكا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة خطوة بخطوة للكشف اللونية من السكريات المختزلة تتحرر من الإنبات C. جراثيم صعب. على الرغم من يستخدم هذه الدراسة C. جراثيم صعب، والسكريات المختزلة صدر خلال إنبات الجراثيم من البكتيريا الأخرى لتشكيل بوغ هي قادرة على أن الكشف عن هذا البروتوكول 9،16،17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عينات توليد

  1. الحرارة تفعيل C. صعب الجراثيم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتخزينها على الجليد.
    ملاحظة: C. جراثيم صعب يمكن أن تنتج وتنقيته كما هو موضح سابقا 7،9،10.
  2. إعداد الحل الإنبات في X + 1 مل حيث X هو عدد العينات التي تؤخذ أثناء الفحص.
    ملاحظة: الحل إنبات محددة لأنواع من البكتيريا الجراثيم التي تجري دراستها. لمعايرة C. صعب بوغ الإنبات، استخدمنا حل 10 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 100 الجلايسين ملي و 10 ملي حمض taurocholic في الماء منزوع الأيونات.
  3. قبل البدء في الفحص، رسم 1.0 مل عينة من الحل إنبات الجراثيم دون أن تكون فارغة للكشف عن القشرة شظية.
  4. إضافة الجراثيم إلى OD 600 من ~ 3.0 إلى حل الإنبات ودوامة بسرعة.
    ملاحظة: للحصول على الدراسات الإنبات لدينا في B. الرقيقة، استخدمنا نفس OD 600 الجراثيم بالنسبة للC. صعب.
    ملاحظة: هذا المبلغ من الجراثيم عملت بشكل جيد للرصد القشرة الافراج عن جزء خلال C. صعب بوغ الإنبات. وينبغي أن تحدد كمية من الجراثيم المستخدمة في هذا الاختبار تجريبيا لكل بكتيريا أو السلالة.
  5. إزالة 1.2 مل عينة فورا بعد إضافة الجراثيم وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في 14000 × ز. وهذه هي النقطة الساعة الصفر.
  6. نقل 1.0 مل من طاف من العينة طرد لأنبوب جديد لتحليل قشرة جزء لاحق.
    ملاحظة: يجب DPA تحتاج إلى رصد، إزالة عينة 100 ميكرولتر منفصلة للكشف عن DPA في الحل باستخدام مقايسة على أساس التيربيوم مضان 9،18،19.
  7. تجميد العينة التي تم جمعها في -80 درجة مئوية.
  8. كرر الخطوات من 1.4 و 1.5 على فترات منتظمة حتى الانتهاء من جميع نقاط الوقت.
    ملاحظة: بسبب الوقت اللازم لالطرد المركزي وأخذ العينات، ونقاط وقت أقل عشركان ل2 دقيقة بعيدا يكن من الممكن أثناء إجراء دينا، لذلك كانت فترات أخذ العينات لدينا مرة واحدة كل دقيقة 2 لمدة 14 دقيقة.
  9. كما تحكم إيجابية للحد من الكشف عن السكر وتقدير، وتشمل المبالغ التالية N -acetylglucosamine (نانومول): 0، 12.5، 25، 50، 100، 250، 500، و 5،000. إعداد هذه العينات في نفس الوقت الذي عينات القشرة وتشغيل جنبا إلى جنب مع عينات القشرة بحيث منحنى هو معيار ذات الصلة البيانات التي تم إنشاؤها من قبل الإنبات جراثيم.
  10. بعد أن يتم جمع كل العينات نقطة زمنية، يجفد العينات.
    ملاحظة: نحن مجفف بالتجميد عينات لدينا في 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى.

2. قياس اللحاء شظايا

  1. و resuspend العينات مجفف بالتجميد في 120 ميكرولتر من 3 N حمض الهيدروكلوريك تستكمل مع الفينول 1٪ و 0.5٪ β-المركابتويثانول.
  2. نقل العينات معلق إلى 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى.
    ملاحظة: للحصول على التكاثر، وضمان معلق كل عينة مجفف بالتجميد ونقل.
    3. <لى> احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
  3. بعد الحضانة، ووضع العينات على الجليد حتى أنها باردة.
  4. تحييد العينات مع 120 ميكرولتر من 3 M هيدروكسيد الصوديوم.
  5. إضافة 80 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم المشبعة و 80 ميكرولتر من 5٪ محلول أنهيدريد الخل لكل عينة ودوامة.
  6. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  7. نقل العينات إلى 95 ° C حمام الماء لمدة 3 دقائق بالضبط.
    ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب.
  8. إزالة عينات من الحمام المائي وتبرد على الجليد.
  9. إضافة 400 ميكرولتر من 6.54٪ K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O لكل أنبوب والدوامة.
  10. احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق بالضبط.
    ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب.
  11. إزالةالعينات ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق.

3. اللون الكاشف

  1. بينما العينات على الجليد (الخطوة 2.12)، وإعداد كاشف اللون. حل 0.320 غرام من ص -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB، كاشف إرليخ) في 1.9 مل من حمض الخليك الجليدي.
    ملاحظة: الكاشف الوقت ودرجة الحرارة والضوء حساسة ويجب أن لا يتم مقدما.
  2. بعد DMAB يذوب تماما، إضافة 100 ميكرولتر من 10 N حمض الهيدروكلوريك ودوامة.
  3. إضافة 5 مل من حمض الخليك الجليدي ودوامة.

4. رد الفعل اللونية

  1. نقل 100 ميكرولتر من كل عينة تبرد القشرة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد.
  2. إضافة 700 ميكرولتر من محلول اللون الطازجة إلى كل عينة.
  3. على الفور نقل العينات إلى 37 درجة مئوية الماء حمام واحتضان لمدة 20 دقيقة بالضبط.
  4. نقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة 96-جيدا واضحة.
  5. تحديد العينات عند 585 نانومتر على طبق من ذهبقارئ. وينبغي أن تبدأ عينات في اللون الأصفر، وسوف رد فعل إيجابي يتحول إلى اللون الأرجواني. المزيد من القشرة الوقت الحاضر، وعمق اللون الأرجواني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الجدول 1 نتائج نموذجية باستخدام معايير ناج. وتستخدم البيانات لإنشاء منحنى القياسية. ويبين الجدول 2 النتائج نموذجية من فحص الإنبات في المخزن إنبات تستكمل مع 100 الجلايسين ملي و 10 ملي TA (الظروف المعززة للإنبات) أو 100 الجلايسين ملم فقط (شروط عدم الإنبات). في غياب TA، C. جراثيم صعب لا تنبت، وهناك تغيير طفيف في وجود شظايا القشرة في الحل. ومع ذلك، في حضور كل من TA والجلايسين، C. جراثيم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على التحفيز، الجراثيم التي تمر بعملية الإنبات تفقد خصائص مقاومة من دون الحاجة إلى تركيب الجزيئات. عندما يتم تشغيل إنبات الجراثيم، جوهر بوغ النشرات DPA مقابل الماء 2. نظرا لما يحتويه DPA عالية من الجراثيم نائمة، جوهر بوغ تحت الضغط الاسموزي الشديد وببتيدوغليكان المتخصصة، والقشرة، يساعد على منع الأساسية من تورم من خلال العمل، ويفترض، كحاجز للتوسع 2.

الطريقة المذكورة أعلاه يستخدم كاشف إرليخ (حل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم المشروع التي وصفها جائزة عدد 5R01AI116895 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية أو المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2.0 مل أنبوب غطاء لولبيالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1420-3700
p1000 ماصة Eppendorf
p200 Eppendorf ماصة Eppendorf p20Eppendorf
ماصة Eppendorf P20 EppendorfEppendorf
100 - 1،250 &# 956 ؛ ل نصائح الماصةVWR89079-486
1 - 200 &# 956 ؛ ll نصائح الماصةVWR89079-458
N-acetyl-D-glucosamineSigmaA3286-25G
حمض الهيدروكلوريك - 10 NBDH-AristarBDH3032-3.8LP
أنهيدريد الخليكAlfa AesarL04295
بيكربونات الصوديومBDHBDH0280-500G
هيدرات البوتاسيومAlfa Aesar39435
هيدروكسيد الصوديومBDHBDH8019-500G
4- (ثنائي ميثيل أمينو) بنزالديهايدسيجما156477-100 جم
الفينول المشبعفيشرBP1750-400
2-MercaptoethanolAldrichM6250-100ML
SpectraMax M3الجزيئية
حمض الخليك ، الجليديBDHBDH3098-3.8LP
ساخنة ، حمام مائيVWR نموذج علمي1136
Microtest 96Falcon35307296 لوحة ثقافة الأنسجة الواضحة
أنابيب الثقافةVWR89000-506
دوامة
كتل الحرارة
رباعي الأجهزة متداول جيدا آلة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
  2. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
  3. Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
  4. Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
  5. Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
  6. Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
  7. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
  8. Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
  9. Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
  10. Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).
  11. Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
  12. Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).
  13. Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
  14. Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
  15. Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
  16. Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
  17. Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
  18. Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
  19. Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
  20. Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
  21. Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
  22. Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
  23. Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
  24. Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
  25. Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
  26. Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
  27. Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Clostridium difficile N acetylglucosamine

مقالات ذات صلة